Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1.Введение 6
1.2. Ретроэлементы 6
1.3.Структура эндогенных ретровирусов. 8
1.4.Типы эндогенных ретровирусов 9
1.5.Семейства эндогенных ретровирусов 12
1.6.ЭНДОгенные ретровирусы семейства HERV-H 12
1,7.Эндо генные ретровирусы семейства HERV-K(CUU) 13
1.8.Продукты трансляции эндогенных ретровирусных последовательностей и их роль в функционировании организма человека 14
1.9.Роль эндогенных ретровирусов и их LTR в регуляции транскрипции клеточных генов 16
1.10. Белковые факторы-регуляторы транскрипции, способные связываться с LTR 19
1.11. Свиные эндогенные ретровирусы, PERVs 21
1.12. Белки теплового шока (HSP, БТШ) 24
1.13. Заключение 26
2. Материалы и методы
2.1.Материалы 27
2.2.Буферные растворы 27
2.3.Клеточные культуры 28
2.4. Получение клеток асцитной карциномы мышей Krebs-II 28
2.5.Получение ядерных экстрактов 29
2.б.Радиоактивное мечение ДНК
2.6.1. Мечение в ходе ПЦР 29
2.6.2. Концевое мечение олигонуклеотидов 31
2.6.3. Очистка фрагментов, меченых в ходе ПЦР 31
2.7.Анализ сдвига электрофоретической подвижности ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA) 32
2.8.Двумерный электрофорез с ультрафиолетовой сшивкой 33
2.9. Приготовление ДНК-аффинного носителя
2.9.1. Подготовка олигонуклеотидов 33
2.9.2. Лигирование 34
2.10. Приготовление ДНК-Сефарозы
2.10.1. Активация Сефарозы. 34
2.10.2. Иммобилизация ДНК 34
2.10.3. Проверка эффективности связывания 35
2.11. Фракционирование ядерного экстракта на ДНК-аффинной колонке 35
2.12. Фракционирование ядерного экстракта методом аффинной элюции 35
2.13. Высаживание белков 36
2.14. Электрофорез белков в присутствии ДДС 36
2.15. Вестерн-блот анализ 36
2.16. Обработка гелей, гидролиз трипсином и экстракция пептидов 37
2.17. Анализ триптических пептидов при помощи масс-спектрометрии 37
3 Результаты и их обсуждение
3.1.Клеточные белки, специфически связывающиеся с 5'-концом области U3 LTR HERV-K
3.1.1. Локализация и специфичность связывания факторов ERF1, ERF2 и ERF3 с LTR HERV-K 39
3.1.2. Тканеспецифичное связывание белков другими участками LTR 42
3.1.3. Идентификация белков, потенциально ответственных за энхансерную активность LTR HERV-K 45
3.1.4. Связывание белков с негативным регуляторным элементом (NRE) 49
3.2.Выделение белков ERF-1,2 и 3, специфически связывающихся с LTR HERV-K и их идентификация
3.2.1. Получение ядерных экстрактов 50
3.2.2. Выделение факторов ERF методом ДНК-аффинной хроматографии 54
3.2.3. Выделение факторов ERF методом аффинной элюции 57
3.2.4. Идентификация ERF(l-3) методом MALDI-TOF-MS 64
3.2.5. EMS A ERF в присутствии антител к Hsc70 64
3.2.6. Вестерн-бл от анализ ERF с антителами к Hsc70 68
Выводы 71
- Ретроэлементы
- Свиные эндогенные ретровирусы, PERVs
- Приготовление ДНК-аффинного носителя
- Получение ядерных экстрактов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Эндогенные ретровирусы человека и их фрагменты, представленные несколькими семействами и составляющие до 8 % всей ДНК человеческого генома, обладают потенциальной способностью регулировать экспрессию близко расположенных генов. Благодаря их способности к перемещению по геному и к амплификации они могут быть важными инструментами эволюции и видообразования. Некоторые из них обладают способностью образовывать вирусные частицы, что свидетельствует об их участии в патогенных процессах, включая опухолевую трансформацию. Одиночные LTR некоторых семейств эндогенных ретровирусов человека, образующиеся, по всей видимости, по механизму гомологичной рекомбинации, присутствуют в геноме в количествах в десятки раз больших, чем соответствующие провирусы, что многократно умножает их регуляторный потенциал. Показано, что одиночные LTR человеческих эндогенных ретровирусов (HERV) могут служить промоторами и терминаторами транскрипции клеточных генов как in vitro, так и in vivo, а также обладать другими функциями. Таким образом, изучение эндогенных ретровирусов человека позволило получить ряд важных новых данных о механизмах регуляции и эволюции на уровне полного генома человека. Типичный LTR ретровируса включает в себя комплекс регуляторных элементов, необходимых для эффективной транскрипции провирусной ДНК: промоторы и энхансеры, необходимые для инициации транскрипции, и сигналы терминации и полиаденилирования РНК. Наличие промоторной и энхансерной активностей LTR экзогенных и эндогенных ретровирусов предполагает связывание ими специфических регуляторных белков.
Семейство К эндогенных ретровирусов человека (HERV-K) считается наиболее биологически активным и, возможно, способно формировать вирионы в клетках плаценты и тератокарциномы. Нуклеотидные последовательности LTR этого семейства были проверены на наличие участков связывания белковых факторов клетки-хозяина с использованием торможения в геле и ультрафиолетовой сшивки. Было показано, что последовательности LTR двух подсемейств HERV-K содержат специфические сайты связывания по крайней мере для трёх белковых факторов - ERF1, ERF2 и ERF3 (Akopovet al., 1998). По своим характеристикам эти белки не похожи на уже известные факторы транскрипции. Участок их связывания расположен в 5'-области Ш-элемента LTR.
Цель работы состояла в идентификации и функциональной характеристике регуляторных участков LTR эндогенных ретровирусов человека семейства К, связывающихся с белковыми факторами, атакже в выделении и характеристике белков, связывающихся с этими участками.
Объём работы.
Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и
состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, состоящего из 151 наименования.
Научная новизна и практическая ценность,
В настоящей работе показано, что центральная и З'-концевая области LTR HERV-К, в частности область негативного регуляторного элемента, способны специфически связываться с клеточными белковыми факторами. Было также обнаружено, что в клетках, где LTR HERV-K обладает энхансерной активностью, с центральной областью LTR связывается дополнительный клеточный фактор. Была проанализирована тканеспецифичность белковых факторов, связывающихся с определённым участком длинного концевого повтора человеческого эндогенного ретровируса семейства К. Был разработан метод аффинной элюции специфических ДНК-связывающих белков с гепарин-агарозной колонки, и с его помощью выделены белки, связывающиеся с 5'-концом области U3 LTR HERV-K. Один из белков был идентифицирован и охарактеризован методами масс-спектрометрии и иммунохимии.
Апробация полученных результатов.
Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 7th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers (HTC 7), 2002; FEBS advanced course No 02-11, 2002; VI чтения, посвященные памяти академика ЮА. Овчинникова, 2002; 2nd International Workshop "Retrotransposons and genome evolution", 2003; Cold Spring Harbor Laboratory meeting on retroviruses, 2004; 3rd European Conference & Practical course "Advanced methods for industrial production, purification, and characterization of gene vectors", 2004; Конгрессы HUPO 2003 и HUPO 2004.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.
Ретроэлементы
В геноме позвоночных существует большое количество различных семейств и типов ретроэлементов, способных играть важную роль в эволюции (1). Их активное перемещение по геному является одним из основных источников изменчивости генома. Без участия ретроэлементов и кодируемых ими ферментов темпы эволюции животного мира могли бы значительно замедлиться. По доминирующей на сегодня точке зрения все ретроэлементы тесно взаимосвязаны между собой. Роль ретровирусов и других кодирующих обратную транскриптазу (RT) последовательностей является ключевой в эволюции других ретроэлементов, таких как псевдогены, короткие диспергированные повторы, Alu-повторы и т.д. Согласно этому, другие ретроэлементы либо являются продуктами обратной транскрипции, т.е. ДНК-копиями (кДНК) клеточных РНК-транскриптов, либо бывшими ретровирусами, давно внедрившимися в геном позвоночных (2-4) и потерявшими в ходе рекомбинаций и замен часть своих генов (7). Эндогенные ретровирусы человека (HERVs - human endogenous retroviruses) представляют собой один из классов ретроэлементов, появившиеся в результате давнего заражения ретровирусами клеток зародышевого пути. Эндогенные ретровирусы и их элементы представлены в геноме высших приматов десятками тысяч копий, при этом число представителей различных классов HERV сильно различается (Табл. 1), составляя в сумме приблизительно 8% всего наследственного материала (15). Кроме полноразмерных элементов, для ряда классов HERV обнаружено большое число одиночных длинных концевых повторов (LTR), являющихся скоре всего продуктами рекомбинации целого ретровируса, содержащего два длинных концевых повтора в своём составе. Их число может значительно превышать количество полноразмерных HERV (Табл.1), Естественно, что столь значительный объём вирусной генетической информации в геноме может оказывать существенное влияние на функционирование организма. По широко распространённой на сегодня точке зрения ретровирусы инфицировали геном неоднократно. В пользу этого говорит наличие их в геноме как беспозвоночных, так и высокоразвитых позвоночных животных (4). Ретровирусы внедрились в геном приматов примерно 10-60 млн. лет назад (15) путём инфицирования экзогенными ретровирусами и с того времени существуют как стабильно интегрированные вертикально наследуемые провирусы. В ходе эволюции хозяина их геном видоизменялся, в нём происходили нарушения открытых рамок считывания.
Процессы транскрипции и трансляции их белков сопрягались с процессами, происходящими в геноме хозяина (см, ниже). Рекомбинация со встроившимися ранее ретроэлементамн повлекла изменения кодируемых ретровирусами белков, а продуцируемые ими ферменты вызвали появление большого количества ДНК-копий (кДНК) РНК-транскриптов многих клеточных генов. 1.3. Структура эндогенных ретровирусов Структура эндогенных ретровирусов не отличается от классической структуры экзогенных ретровирусов. Так, в их структуру входят гены gag, рої и env, окружённые с обеих сторон длинными концевыми повторами (LTRs), служащими промоторными и энхансерными элементами ретровирусов. 5 -концевой LTR используется как промотор, а 3 -концевой — как сайт полиаденилирования. Продуктами гена gag являются белок матрикса (МА), главный белок капсида (СА) и белок оболочки сердцевины (нуклеокапсида — nucleocapsid, NC). Обратная транскриптаза (RT), РНКаза Н и интеграза (IN) кодируются геном рої. Эти белки играют ключевую роль в размножении ретровирусов. Обратная транскриптаза осуществляет синтез ДНК-копии всего генома ретровируса, используя в качестве затравки для начала синтеза 3 -конец одной из тРНК клетки-хозяина, РНКаза Н разрушает затем РНК в РНК-ДНК гетеродуплексе, высвобождая первую цепь кДНК. Интеграза (IN) катализирует встраивание двуцепочечного кДНК-продукта, полученного после второго раунда репликации, тоже осуществляемого RT на одноцепочечной молекуле кДНК, в геном хозяина. Ген env, расположенный после акцепторного сайта сплайсинга (AS), ответственен за белок оболочки (surface protein, SU) и трансмембранные белки (ТМ), образующие совместно комплекс, взаимодействующий с мембраной клетки при заражении её ретровирусом. Первоначально единый предшественник этих белков подвергается ограниченному протеолизу, давая два независимых продукта. Размер длинных концевых повторов (LTR) ретровирусов варьирует от 415 до 1800 пар оснований (п.о.) для разных семейств HERV (8). Различные типы классификаций эндогенных ретровирусов человека основаны на различиях в их строении. Одна из самых распространённых основывается на типе молекул тРНК, служащих затравкой (праймером) для обратной транскриптазы. Согласно этой классификации семейства эндогенных ретровирусов человека обозначаются как HERV-R (аргининовая тРНК), HERV-E (глутаминовая тРНК), HERV-K (CUU-HTDV; UUU-C4: антикодоны лизиновой тРНК; далее HERV-K - обозначение для подсемейства CUU с прототипом HERV-K10) и т.д. Представители различных семейств по-разному распространены в геноме (Табл. 2). Кроме того, существует классификация эндогенных провирусов по типу их экзогенного аналога. Сведения об основных типах эндогенных ретровирусов приведены в Табл. 2. Некоторые из них подробнее обсуждаются ниже. Используя в качестве зонда последовательности, соответствующие потенциальным праймерам из состава пролиновой тРНК, две группы независимо получили ряд клонов эндогенных ретровирусов человека семейства HERV-P (9, 10).
Они были подразделены на три группы -HERV-Pl, HERV-P2 и HERV-P3, поскольку последовательности их длинных концевых повторов совершенно различны (3). Один из HERV-P1 содержит необычный 5 -LTR, последовательность которого прерывается Alu-повтором (10). Другой из полученных клонов, HuRRS-P (HERV-P3), представляет полноразмерный провирус длиной 8 т.п.о. с длинными концевыми повторами длиной 631 п.о. (9). Эндогенный ретровирус HERV-I был открыт случайно при исследовании гаптоглобин-связанного локуса (Нрг) (11). Было показано, что ретровирус находится в первом интроне псевдогена Нрг. Полноразмерный геном представителя семейства составляет около 9 т.п.о. Hpr-ассоциированный провирус расположен на хромосоме 16q21-22(ll). Полноразмерная копия HERV-L (15) была обнаружена в геноме в результате гибридизационного и ПЦР-анализа с использованием проб, гомологичных рої-генам. Полноразмерный провирус длиной 6,6 т.п.о. содержит длинные концевые повторы длиной 462 п.о. (15). В результате последующих работ были охарактеризованы другие HERV-L элементы, в наибольшей степени близкие к пенистым вирусам человека и обезьян (HFV, SFV-1, SFV-2)(29,30). Клоны, содержащие в себе последовательности ещё одного представителя семейства эндогенных ретровирусов, HERV-K(CUU), были независимо изолированы в трёх лабораториях при использовании в качестве зонда генома MMTV (mouse mammary tumor vims) или же мышиной intracistemal A particle (LAP) (31, 32,41). HERV-K(CUU) имеет геном длиной 9 т.п.о. и длинные LTR (968 п.о.) (18). В геноме человека содержится порядка 50 копий представителей семейства, помимо этого имеется большое количество (15000-25000) последовательностей, родственных LTR HERV-K(CUU) (17,33). В процессе исследования генов комплемента С4 в области комплекса гистосовместимости человека класса III был продемонстрирован полиморфизм в тандемно дуплицированной области, содержащей гены С4А и С4В. Этот полиморфизм обусловлен наличием 6,5 т.п.о. элемента в генах С4А и 2/3 генов С4В, в остальных же генах С4В он наличием 6,5 т.п.о. элемента в генах С4А и 2/3 генов С4В, в остальных же генах С4В он отсутствует (38). Дальнейшие исследования показали, что этот элемент является представителем нового семейства эндогенных ретровирусов человека (14). Анализ первичной структуры выявил наличие сайта связывания праймера, комплементарного 3 -концу tPHKbys (антикодон CTJU). Этот ретроэлемент получил название HERV-K(C4) (19). HERV-K(C4) имеет геном длиной 6,4 т.п.о. и длинные концевые повторы длиной 546 п.о. Сравнение последовательностей HERV-K(C4) с базами данных показало, что ближайшим к нему является HERV-K10, принадлежащий к семейству HERV-K(CUU) (13), но они в значительной степени отличаются.
Свиные эндогенные ретровирусы, PERVs
Ксенотрансплантация - это использование живых тканей и органов животных для пересадки человеку. В настоящее время проходят клинические испытания применимости свиных клеток и тканей в качестве аллогенного источника, в частности, при имплантации инкапсулированных клеток панкреатических островков для больных инсулин-зависимым сахарным диабетом (122), имплантации зародышевой нервной ткани для терапии болезни Паркинсона (123), использования свиной почки ex vivo (124). В то же время, в связи с развитием ксенотрансплантации вызывает большое беспокойство возможность перенесения инфекционных агентов от животных к людям-реципиентам (125). Некоторые патогены, например вирусы, могут быть перенесены от приматов человеку (126). В частности, эпидемия СПИД, вызываемого вирусом иммунодефицита человека типа 1, началась как зооноз (общее название инфекционных и инвазионных болезней животных, которыми болеет и человек), переданный, возможно, от шимпанзе (127). В связи с этим человекообразные приматы признаны неприемлемыми донорами для ксенотрансплантации (128,129), хотя их ткани и органы имеют наибольшее сходство с человеческими и менее подвержены отторжению по сравнению с более филогенетически удалённым животными. В настоящее время наиболее перспективным источником органов для ксенотрансплантации признаны карликовые свиньи (130). Было разработано несколько различных стратегий для того, чтобы преодолеть основное препятствие для ксенотрансплантации - гиперострый эффект отторжения (hyperacute rejection, HAR), который уничтожает трансплантированный орган в течение нескольких часов. Были созданы трансгенные свиньи, которые экспрессируют человекоподобные гены (131). Одной из основных опасностей при ксенотрансплантации свиных органов человеку является потенциально возможный перенос свиных эндогенных ретровирусов (PERVs) в геном человеческих клеток. В связи с этим в последнее время изучению PERVs уделяется значительное внимание. Эндогенные ретровирусы генома свиней были описаны почти 30 лет назад и обнаруживают сходство с ретровирусами С-типа других животных (132). Геном свиней содержит от 20 до 50 копий PERVs, 10-20 из которых соответствуют полноразмерному провирусу (133). Анализ последовательности полноразмерных клонов показывает, что геном PERVs сходен с геномами вирусов лейкоза гиббонов (gibbon аре leukemia virus, GaLV) и лейкоза мышей (murine leukemia vims, MuLV) (134), степень идентичности аминокислотных последовательностей достигает 60% в областях генов gag и рої. PERVs, продуцируемые линиями клеток свиньи, способны инфицировать человеческие клетки в культуре (135,136,137,138).
Известно три вида PERVs, различающихся по нуклеотидной последовательности и тропизму in vitro, названные PERV-A, PERV-B, и PERV-C (139). Из них А и В способны инфицировать клеточные линии млекопитающих, включая человека, тогда PERV-C в основном инфицируют клетки свиного происхождения (140). Исследование пациентов, которым были трансплантированы свиные ткани, не показало заметного переноса PERVs при кратковременном искусственном кровообращении печени, почек, перфузии селезёнки, имплантации клеток панкреатических островков и трансплантации кожи (141,142). Применённые методы детекции базировались как на ДНК и РНК-зависимой ПЦР с PERV-специфическими праймерами, так и на вестерн-блот анализе, позволяющем выявлять иммунный ответ на PERVs. Тем не менее, сомнения в безопасности пересадки свиных тканей человеку остаются (143). Существует дополнительный фактор риска при ксенотрансплантации -возможность рекомбинации PERVs и присутствующих в геноме реципиента HERVs, в результате чего могут появиться вирусы с новыми свойствами. Необходимо отметить, что до сих пор не был идентифицирован ни один HERV, способный к репликации (7). Например, среди представителей семейства эндогенных ретровирусов человека HERV-K, последовательность которого, по-видимому, наиболее близка к последовательности экзогенного предшественника, не обнаружено ни одного, способного кодировать репликационно компетентный вирус (149). Тем не менее, экспрессия полноразмерных мРНК HERV-K была обнаружена во многих тканях. Так как PERVs принадлежат к реггровирусам С-типа, возможна их рекомбинация с родственными последовательностями HERVs, например, с ERV-3 (HERV-R), дефектным провирусом С-типа, кодирующим белок env массоой 65 Ша, который во время дифференцировки плацентарных синцитиотрофобластов экспрессируется в больших количествах (150). Хотя PERVs реплицируются в человеческих клетках не так эффективно, как политропные крысиные и кошачьи ERVs, возможно, что PERVs или рекомбинантные вирусы могут инфицировать реципиента ксенотрансплантатов и, подобно их близким родственникам MuLV, FeLV, и GaLV, вызывать лейкозы. Помимо PERVs, другае горизонтально передающиеся вирусы свиньи, включая недавно обнаруженные вирусы гепатита и герпеса (151), расширяют список возможных человеческих патогенов свиного происхождения. Ген env - основная детерминанта ретровирусного тропизма и поэтому важен при определении того, какие PERVs являются способными к инфицированию человеческих клеток. Эта область была клонирована из провирусов, экспрессирующихся в клеточной линии свиньи РК15. Анализ последовательностей клонов показал, что существуют два класса этих последовательностей (принадлежащих генам env PERV-A и PERV-B) с открытыми рамками считывания длиной 660 и 657 п.о., соответственно. Два предсказанных белка env очень похожи в трансмембранной области, но обнаруживают большие различия в области, предположительно расположенной на поверхности клетки.
Самые большие различия в последовательностях наблюдаются в областях, ответственных за связывание рецептора. Хотя рецептор PERV до сих пор не идентифицирован, предполагается, что два класса PERVs используют различные рецепторы. В сердце, селезёнке и почке свиньи обнаружена экспрессия обоих классов PERVs. Показано, что и PERV-A и PERV-B экспрессируются также в культивируемых клетках этих тканей (139). К настоящему времени не существует опубликованных данных, касающихся молекулярных механизмов трансактивации длинных концевых повторов PERVs. Неизвестны и клеточные транскрипционные факторы, которые регулируют экспрессию генов PERVs, Понимание роли этих факторов может являться ключевым для предсказывания того, какие клетки и ткани наиболее вероятно будут продуцировать инфекционные PERVs in vivo. LTR PERVs содержит участок, гомологичный участку узнавания рецепторами гормонов. В LTR PERVs внутри области U5 в 3 -сторону от ТАТА-бокса обнаружен потенциально функциональный одиночный нуклеотидньш полиморфизм (SNP, single nucleotide polymorphism), по которому различаются субтипы PERV-A, PERV-B и PERV-C. SNP возникает внутри потенциальной области связывания рецептора гормонов, где он существенно влияет не только на связывание эстрогенового рецептора, но также на связывание с этим участком других транскрипционных факторов. Было обнаружено (141), что в результате однонуклеотидной замены в участке SNP, три перекрывающихся элемента связывания рецепторов гормонов (HRE), представленных в LTR PERV-A, превращаются в один потенциальный участок в LTR PERV-B и С. Последовательность AGAACAimnTGTTCT LTR PERV включает в себя консенсусные сайты связывания рецепторов гормонов, глкжокортикоидного рецептора, рецептора андрогена, минералокортикоидного рецептора, и рецептора прогестерона. (142, 143). Участок связывания рецепторов гормонов PERV-B/C (HRE) содержит одиночный «несовершенный» эстроген-чувствительный элемент (ERE) с SNP, расположенным в линкерной области. Этот ERE также представлен и в PERV А. LTR PERVs как внутри, так и в окружении HRE весьма сходны с некоторыми LTR эндогенных ретровирусов других животных, в частности с LTR эндогенного ретровируса мыши (MuERV). Необходимо отметить, что непосредственная близость HRE к ТАТА-боксу наблюдается в LTR обоих провирусов. Гомология участков связывания рецепторов гормонов PERVs с аналогичными областями других эндогенных ретровирусов, а также наличие SNP внутри перекрывающихся HRE в LTR PERVs дает основания предположить, что, во-первых, экспрессия PERVs и, в конечном счёте, продукция инфекционных вирусов могут регулироваться гормонально.
Приготовление ДНК-аффинного носителя
Олигонулеотиды после синтеза (примерно по 250 мкг каждого) очищали электрофорезом в ПААГ и растворяли в 100 мкл воды. По 100 мкл раствора каждого из олигонуклеотидов помещали в пробирку и добавляли 25 мкл 10х буфера для полинуклеотидкиназы (0,5 М Трис-HCl рН 7,9,100 мМ MgCU, 50 мМ ДТТ, 1 мМ спермидина, 1 мМ ЭДТА), 5 мкл 100 мМ АТР, и полинуклеотидкиназу (150 ед. в 10 мкл). Объем реакции доводили водой до 250 мкл. Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение 2 час, добавляли ЭДТА до 20 мМ, и инкубировали при 65С в течение 15 мин. Далее пробирку помещали в 500 мл стакан, содержащий воду, нагретую до 80С, и оставляли на ночь при 4С для отжига, К реакционной смеси добавляли NHOAc до 2 М, 2,5 объёма этанола и инкубировали не менее 6 час при -20С. Двуцепочечный олигонуклеотид осаждали при 12000 об/мин в течение 15 мин при 4С, промывали метанолом, высушивали и растворяли в 200 мкл ТЕ. К раствору добавляли MgCb до 15 мМ, 25 мкл 3 М NaOAc рН 5,5 и 2,5 объёма этанола. Инкубировали ночь при —20С. Олигонуклеотиды осаждали при 12000 об/мин и 4С в течение 15 мин и растворяли в 100 мкл буфера для лигирования (40 мМ Трис-HCl рН 7,9, 10 мМ MgCb, 10 мМ ДТТ, 1 мМ спермидина). Добавляли 5 мкл 100 мМ АТФ и 2 мкл (40 Weiss units) ДНК-лигазы фага Т4. Инкубировали при 12С в течение ночи и еще 2 часа при комнатной температуре. Степень лигирования проверяли, анализируя аликвоту в 1 мкл в 2% агарозном геле. Лигазную смесь экстрагировали один раз смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1), добавляли 10 мкл 3 М NaOAc рН 5,5,2,5 объёма этанола, и осаждали ДНК в течение ночи при -20С. Смесь центрифугировали как описано выше, дважды промывали метанолом, высушивали и растворяли в 10 мМ HEPES-Na рН 8,0. 2.10. Приготовление ДНК-сефарозы. 2.10.1. Активация сефарозы. 10 мл Сефарозы CL-2B (Pharmacia) промывали 250 мл воды, ресуспендировали в воде в конечном объёме 20 мл и помещали в водяную баню при 15С. BrCN (1,1 г) растворяли в 2 мл ацетонитрила и по каплям добавляли к суспензии сефарозы при помешивании на магнитной мешалке. NaOH (5 М, около 1,8 мл) добавляли по каплям в течение 10 мин, поддерживая рН 10. Реакцию останавливали добавлением ледяной воды (100 мл) и немедленным промыванием на стеклянном фильтре 300 мл ледяной воды и 100 мл 10 мМ К-фосфатного буфера рН 8,0.
Смеси не давали высохнуть полностью. Использовали немедленно. 2.10.2. Иммобилизация ДНК Промытую сефарозу переносили в полипропиленовую пробирку (50 мл) и добавляли 10 мМ К-фосфатный буфер рН 8,0 так, чтобы сформировалась плотная суспензия (около 0,4 мл). Затем добавляли ДНК, растворённую в буфере HEPES (около 0,5-1 мг ДНК в 100 мкл), инкубировали при покачивании в течение 16 час при комнатной температуре. Сефарозу собирали на фильтре, промывали 200 мл 10 мМ К-фосфатного буфера рН 8,0, 100 мл 1 М этаноламина и ресуспендировали в 1М этаноламине в конечном объёме 14 мл. Суспензию инкубировали 6 час при комнатной температуре при покачивании. Сефарозу собирали на стеклянный фильтр, промывали 100 мл 10 мМ К-фосфатного буфера рН 8,0,100 мл 1 М К-фосфатного буфера рН 8,0,100 мл 1 М КС1,100 мл ТЕ и 100 мл буфера с азидом натрия (10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 1 мМ ЭДГА, 0,3 М NaCl, 0,02% (w/v) азид натрия). Хранили в этом же буфере при 4С. 100 мкл осадка ДНК-сефарозы и 100 мкл осадка исходной сефарозы CL-2B промывали дважды 0,5 мл буфера для микрококковой нуклеазы (50 мМ Трис-HCl рН 7,9, 3 мМ СаСЬ), ресуспепдировали в 1 мл этого буфера, добавляли 0,5 ед. микрококковой нуклеазы и оставляли на 1 час при 37С при перемешивании. Сефарозу осаждали центрифугированием, оптическую плотность супернатанта относительно контроля измеряли при 260 им и рассчитывали количество ДНК, связавшейся с носителем. Количество пришитой ДНК составило 5 мкг/мл носителя. 2.11. Фракционирование ядерного экстракта на ДНК-аффинной колонке Все операции проводили при 4С. К 0,8 мл ядерного экстракта с концентрацией тотального белка примерно 2,5 мг/мл добавляли 0,4 мл воды, и разведённый экстракт наносили на проточно-охлаждаемую колонку с 0,5 мл гепарин-агарозы (Sigma), уравновешенную буфером С. Нанесение проводили при скорости примерно 0,1 мл/мин, прошедшие фракции собирали и вновь наносили на колонку. Процесс повторяли 5 раз. Затем колонку промывали 5 объёмами буфера С, содержащего 0,2 М КС1 и 5 мл буфера С. Белки, связавшиеся с гепарином, элюировали буфером С, содержащим 0,5 М КС1. Белок собирали фракциями по 3-4 мл и хранили при -70С. Содержащие белок фракции объединяли и буфером С, не содержащим соли, доводили концентрацию КС1 до 60 мМ. Затем фракции наносили на колонку со 100 мкл ДНК-сефарозы, уравновешенной буфером С. Процесс повторяли 5 раз. Колонку с ДНК-сефарозой промывали буфером С, содержащим 0,1 М KCI и снова 1 мл буфера С. Специфически связавшиеся с ДНК-сефарозой белки элюировали 500 мкл буфера С, содержащего 0,4 М КС1. Белок высаживали 12% ТХУ, промывали и растворяли в 20 мМ HEPES рН 7,9. 2.12. Фракционирование ядерного экстракта методом аффинной элюции Все операции проводили при 4С. К 0,8 мл ядерного экстракта с концентрацией тотального белка примерно 2,5 мг/мл добавляли 0,4 мл воды, и разведённый экстракт наносили на проточно-охлаждаемую колонку и промывали так, как указано выше для ДНК-аффинной хроматографии.
Для аффинной элюции LTR-связывающие белки элюировали 5 мл буфера С с добавлением двухцепочечного олигонуклеотида С1/С2 (см. таблицу 3), содержащего сайт связывания белкового комплекса, при конечной концентрации 30 нМ. Фракции собирали, объединяли, белок высаживали 12% ТХУ, промывали и перерастворяли в 20 мМ HEPES рН 7,9. Колонку снова промывали 5 мл буфера С, для повторного использования промывали 1М КС1 и уравновешивали 5 мл буфера С. 2.13. Высаживание белков К полученному после элюции раствору белка добавляли ТХУ до 12%, и инкубировали в течение 5 минут при 4С. После инкубации препараты центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Супернатант убирали, содержимое пробирки промывали 500 мкл ацетона и центрифугировали 5 мин при тех же условиях. Промывку повторяли еще раз, белок высушивали и растворяли в 20 мМ HEPES-КОН рН 8,0. Перед нанесением на ДДС-электрофорез к раствору добавляли 1/5 объёма буфера для нанесения и инкубировали на кипящей водяной бане 5 мин. 2.14. Электрофорез белков в присутствии ДДС Белковый электрофорез проводили по стандартной методике (86) при силе тока в 10 мА. Затем гель переносили в красящий раствор (0,25% Brilliant Blue R-250, 20% этанол, 20% изопропанол), окрашивали при 50-60С в течение 30 мин и отмывали в 7% растворе уксусной кислоты. Окраску серебряным реагентом проводили по описанной методике (105) при помощи набора реактивов Silver Stain Kit (Bio-Rad). 2.15. Вестерн-блот анализ Белки, фракционированные в денатурирующем ДЦС-ПААГ, методом полусухого переноса в трех буферах (анодный буфер I, анодный буфер II, катодный буфер, состав буферов см. выше) переносили на мембрану Immobilon Р (Millipore) при токе 2 мА/см2 в течение 1 часа. После этого мембрану инкубировали 2 раза по 5 мин в PBS, затем в течение 2 часов в растворе Blotto (5% раствор обезжиренного сухого молока в PBS, 0,2% азида натрия) при помешивании и комнатной температуре. Затем мембрану промывали 2 раза по 5 мин PBS и далее инкубировали в 5 мл раствора первичных антител (разведение 1:2000 для поликлональной антисыворотки) в 3% БСА в течение 1 часа при комнатной температуре и перемешивании. Затем мембрану промывали 4 раза по 5 мин PBS и инкубировали в 5-10 мл раствора конъюгата вторичных антител с пероксндазой хрена (разведение 1:10000) в 3% БСА в течение 1 час при комнатной температуре и перемешивании. Мембрану проявляли 12 мл раствора 4-хлор-1-нафтола в буфере TBS. Обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов проводили согласно протоколам (106) с некоторыми модификациями.
Получение ядерных экстрактов
Белки, специфически связывающиеся с регуляторными элементами LTR человеческих эндогенных ретровирусов семейства HERV-K (см. Обзор литературы), были впервые идентифицированы в нашей лаборатории в ядерных экстрактах клеток линий Jurkat и СНО, и обозначены как ERF1, 2 и 3 (Endogenous Retrovirus Factors) (87). Для дальнейшей функциональной характеристики этих белков необходимо клонирование или иная идентификация их генов. Наиболее прямой и распространённый до последнего времени метод идентификации генов белковых факторов заключается в очистке белка, определении его N-концевой последовательности, синтезе на основании этой последовательности вырожденных праймеров, комплементарных З -концевой области мРНК искомого белка, и клонировании этих мРНК путём ПЦР-амплификации с этим праймером и олиго-оТ-праймером на матрице кДНК, синтезированной на суммарной мРНК из содержащих искомые белки клеток. Определение первичной структуры геномов человека и других организмов привело к появлению геномных баз данных, которые уже содержат нуклеотидные последовательности большинства генов. Это позволяет во многих случаях обходиться без секвенирования белков и клонирования кДНК, пользуясь, например, методами масс-спектрометрии (см. ниже). Тем не менее, в любом случае, для нахождения соответствующего белку гена необходимо получение белка в чистом виде в определённом количестве. Основная трудность при этом состоит в весьма малом содержании регуляторных белков — обычно не более десятков или сотен молекул на клетку. Ядерный экстракт из клеток Jurkat содержит относительно много белков ERF (до 50 нг/мл при общей концентрации 2,5 - 3 мг/мл), тем не менее, для их очистки в необходимых количествах (5-30 мкг) требуются десятки миллилитров ядерного экстракта, что соответствует десяткам литров суспензионной культуры клеток. Получение и обработка такого количества клеток весьма трудоёмки и дорогостоящи. Поэтому на первом этапе в качестве источника исследуемых белков нами была выбрана плацента человека, как наиболее доступный тип человеческой ткани. Известно, что в плаценте наблюдается активная транскрипция HERV-K (89), что позволило предположить присутствие в ней интересующих нас регуляторных белков. Оказалось, что искомые белки в плаценте содержатся, однако их количество слишком мало для эффективного вьщеления (данные не приведены).
Так как группа факторов ERF была ранее обнаружена нами в клетках китайского хомячка, а системы регуляции транскрипции у человека и грызунов весьма похожи, мы предположили, что искомые белки могут содержаться и в опухолевых клетках грызунов. Поэтому было предложено в качестве источника ядерных белков использовать клетки асцитной карциномы мышей, которые можно получать в значительных количествах. В результате заражения мышей линии BALB/c была получена асцитная жидкость, содержащая клетки эпителиальной асцитной карциномы мышей Krebs-H, из которых далее был выделен ядерный экстракт. Как видно из рис. 9, в ядерном экстракте из асцитной опухоли мышей содержится интересующий нас специфический белковый комплекс в количествах, сравнимых с содержанием его в клетках Jurkat. Таким образом, нами был подобран удобный источник ядерных белков, с высокой аффинностью связывающихся с идентифицированными ранее участком 5 -конца области U3 LTR HERV-K. Для выделения и очистки ДНК-связывающих белков из ядерных экстрактов клеток асцитнои карциномы мышей Krebs-II первоначально нами был использован метод ДНК-аффинной хроматографии (90), схема которого приведена на рис. 10. Известно, что белки, способные связываться с ДНК, хорошо взаимодействуют с гепарином, так как структура его повторяющегося олигосахаридного звена напоминает углеводно-фосфатный скелет нуклеиновых кислот. На первом этапе белки, связавшиеся с гепарин-агарозой, элюировали с колонки буфером с высокой концентрацией соли (0,5 М КС1). Полученные элюаты наносят на аффинную колонку с пришитыми к носителю двунитевыми олигонуклеотидами. Аффинный носитель был получен в результате предварительного лигирования олигонуклеотидов, содержащих сайт связывания ERF белка (олигонуклеотиды С1 и С2, см. таблицу 3), с последующей их пришивкой к сефарозе (99). На колонке с таким сорбентом задерживаются белки, образовавшие комплексы разной степени сродства с пришитыми олигонуклеотидами. На следующем этапе были подобраны условия солевой элюции с сорбента белков, образующих с олигонуклеотидами наименее прочные комплексы (для белковых факторов ERF — 0,1 М КС1). Специфические белки, образующие с олигонуклеотидом прочные комплексы, элюировали с сорбента буфером с высокой концентрацией соли 0,4-0,5 М КС1. При использовании этого метода на стадии элюции слабо связывающихся белков наблюдаются, как правило, большие потери (до 80%) специфических белков (таблица 4), что значительно снижает их окончательный выход. Таким образом, рассматриваемый метод ДНК-аффинной хроматографии достаточно трудоёмок, так как требует приготовления специального аффинного носителя для каждого выделяемого белка или комплекса белков. Кроме того, большие потери специфических белков в процессе их выделения приводят к значительному увеличению объемов исходного материала (в данном случае - ядерного экстракта из клеток асцитнои карциномы мышей Krebs-II) и к маспггабированшо расходов сопутствующих материалов на всех этапах получения белков в количествах, необходимых для их надежной идентификации.
Хотя с помощью метода ДНК-аффинной хроматографии нам удалось выделить белковые факторы ERF1, 2 и 3 в практически гомогенном виде (рис. 15Б), выход белка был невелик (таблица 4) и недостаточен для секвенирования или идентификации белков методом масс-спектрометрии. Для упрощения процедуры выделения и повышения выхода факторов ERF мы разработали альтернативный метод получения связывающихся с ДНК белков с использованием иммобилизованного на агарозе гепарина. Гепарин широко используется при выделении ДНК-связывающих белков из разных источников (100-102). Этот отрицательно заряженный полимер можно рассматривать как аналог фосфатного остова ДНК, в связи с этим большинство белков, специфически связывающихся с ДНК, имеют сродство к гепарину. Тем не менее, сродство этих белков к ДНК, содержащей последовательность их специфических участков связывания, значительно выше, чем к гепарину, что дает возможность быстро и эффективно их очищать при помощи эшоции низкосолевым буфером, содержащим такую ДНК (рис. 11). На первом этапе мы сорбировали белки ядерного экстракта из клеток асцитной карциномы мышей Krebs-II были сорбированы на гепарин-агарозном носителе, аналогично тому, как описано выше для первого этапа ДНК-аффинной хроматографии. Далее колонку промывали буфером, содержавшим КС1 в такой концентрации, при которой специфические белки с колонки не элюируются (в нашем случае 0,2 М КС1, см. выше). Белковые факторы ERF далее элюировали тем же буфером, содержащим меченый 32Р двунитевой синтетический олигонуклеотид с последовательностью, соответствующей участку связывания ERF (С1/С2). Элюированные с колонки фракции анализировали методом EMS А (рис. 12). Олигонуклеотид вытесняет белки из комплексов с гепарином, в результате чего на выходе с колонки обнаруживаются высокоаффннные комплексы белков с олигонуклеотидом, совпадающие по электрофоретической подвижности с комплексами, получаемыми в присутствии исходного ядерного экстракта. Таким образом, предложенный нами метод очистки ДНК-связывающих белков позволяет получать эти белки в виде комплексов с олигонуклеотидом. Для оптимизации процесса очистки факторов ERF были проделаны следующие эксперименты: 1. Определена ёмкость гепарин-агарозной колонки. Для этого колонку с гепарин-агарозой (0,5 мл) последовательно нагружали увеличивающимися количествами ядерного экстракта. Как видно из рис. 13, насыщение гепарин-агарозы факторами ERF происходило при нанесении на колонку 6,4 мг белка ядерного экстракта. Во всех последующих экспериментах на такую колонку наносили около 4 мг исходного белка.
