Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович

Содержание к диссертации

Введение

Самособирающиеся ДНК-наноструктуры (обзор литературы) 7

1. Разветвленные наноструктуры, полученные из модифицированной ДНК 8

2. Дискретные ДНК-наноструктуры 13

3. Периодические ДНК-наноструктуры 21

4. Разветвленные наноструктуры, полученные модификацией ДНК 31

5. Молекулярные устройства на основе ДНК и обработка информации 37

Обсуждение результатов 40

1. Синтез реагентов для модификации олигонуклеотидов -

2. Отработка реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения на модельном азиде... 42

3. Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения 45

4. Синтез конъюгатов бисимида перилен-3,4,9,1О-тетракарбоновой кислоты 50

5. Синтез олигонуклеотидных триконьюгатов и сборка наноструктур на их основе ... 53

Экспериментальная часть 61

Выводы 89

Благодарности 90

Список литературы 91

• Разветвленные наноструктуры, полученные из модифицированной ДНК
• Разветвленные наноструктуры, полученные модификацией ДНК
• Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения
• Синтез олигонуклеотидных триконьюгатов и сборка наноструктур на их основе

Введение к работе

Развитие химии олигонуклеотидных конъюгатов оказало колоссальное влияние на прогресс в молекулярной биологии. Секвенирование ДНК, ПЦР в режиме реального времени, флуоресцентная детекция точечных мутаций, гибридизационно-иммуноферментный анализ, флуоресцентная in ^/^-гибридизация - это лишь несколько примеров молекулярно-биологических методов, невозможных без использования модифицированных олигонуклеотидов.

Существует ряд способов получения модифицированных олигонуклеотидов. Постсинтетические методы, связанные с введением реакционноспособной группы на стадии твердофазного олигонуклеотидного синтеза и ее последующей модификацией, предпочтительны для синтеза олигонуклеотидных конъюгатов с фрагментами, недостаточно стабильными в условиях олигонуклеотидного синтеза (ОНС) и деблокирования. Такими фрагментами являются некоторые флуоресцентные красители. Помимо этого, постсинтетические методы принципиально позволяют синтезировать конъюгаты, содержащие несколько олигонуклеотидных цепей, пептидно-олигонуклеотидные конъюгаты, а также решать задачу иммобилизации олигонуклеотидов на твердых подложках.

В настоящее время основной реакцией, используемой для постсинтетической конъюгации, является реакция аминов с активированными эфирами (сукцинимидными, сульфосукцинимидными и некоторыми другими). При всей простоте, недостатками ее является неустойчивость активированных эфиров в водной среде, зависимость хода реакции от рН и растворимости активированного эфира, а также плохая масштабируемость. Активированные эфиры реагируют с аминогруппами природных биомолекул, что во многих случаях является нежелательным.

Поэтому представляется весьма актуальной разработка метода синтеза олигонуклеотидных конъюгатов на основе альтернативной реакции, призванной устранить перечисленные недостатки. Такой реакцией стала получившая широкое распространение Си(1)-катализируемая реакция [3+2]-диполярного циклоприсоединения азидов к терминальным ацетиленам ("click chemistry").

Благодаря специфичности реакции и высокой стабильности исходных компонентов стал возможным синтез разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов - ранее весьма труднодоступных блоков, представляющих большой интерес для сборки ДНК-наноструктур. ДНК-наноструктуры являются сравнительно малоизученными и весьма интересными объектами, которые, возможно, в ближайшем будущем найдут применение в

медицинской диагностике и технологии изготовления электронных устройств. Исследованию самосборки разветвленных олигонуклеотидных конъюгатов с образованием наноструктур посвящена часть настоящей работы.

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

САМОСОБИРАЮЩИЕСЯ ДНК-НАНОСТРУКТУРЫ

(обзор литературы)

В последнее время все большее внимание исследователей привлекают наноструктуры - объекты, имеющие размер порядка нескольких нанометров, созданные из низкомолекулярных соединений посредством самосборки. Интерес к наноструктурам обусловлен новыми перспективами нанотехнологии: возможность расположения атомов в пространстве в строго определенном порядке позволит создать материалы с изменяемыми свойствами и огромный спектр наноустройств, таких как химические сенсоры, вычислительные устройства и компоненты памяти.

Принципиально, наноструктуры могут изготавливаться двумя путями — «сверху вниз» (top-down) и «снизу вверх» (bottom-up). Примером подхода «сверху вниз» является фотолитография, современный метод изготовления микропроцессоров — наноструктур, уже сейчас имеющих огромное применение.

Самосборка представляет собой гораздо более технологичный и существенно менее разработанный метод построения объектов нанометровых размеров «снизу вверх». В отличие от фотолитографии, она позволяет легко масштабировать производственный

процесс, представляющий собой

О О О О

ATTGGCATACG . Т Т А Т G G С ПрОСТОЄ СМЄШЄНИЄ ХИМИЧЄСКИ

TAACCGT ATGCAATACCG

3-' ' ' ' ' ' 5' 3' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 5' ^{синтези}Р^{ованных} компонентов

наноструктур в нужном

соотношении. Основная же сложность данного подхода состоит в дизайне этих

5' 3' 5' 3'

—і і і і і і і і і і і її— компонентов, способных к

ATTGGCATACGTTATGGC TAACCGTATGCAATACCG

—і і і і і і і і і і і і — предсказуемой и строго

3 о о 5

специфической агрегации.

ДНК представляет собой

прекрасную матрицу для создания

5' 3' нанообъектов [1—13];

—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—і—

ATTGGCATACGTTATGGC тг_ТТТ-

taaccgtatgcaataccg предполагается, что ДНК-

3' Рис. 1. Использование «липких концов»

наноструктуры могут найти
применение в области

I I I I I I I I I I I I I I I I I ^r ^

наноэлектроники [14], использоваться для создания новых материалов [15,16,17], а таюке для решения ряда биомедицинских задач, таких как детекция биомолекул и доставка лекарств в клетку [18,19].

Именно ДНК была выбрана в качестве материалов для создания нанообъектов потому, что ее самосборка легко программируется. В отличие от других синтетических полимеров и биополимеров, агрегация смеси одноцепочечных ДНК легко предсказуема и определяется их последовательностями. Одно- и двухцепочечные фрагменты ДНК различной длины и последовательности могут быть легко получены при помощи автоматизированного олигонуклеотидного синтеза и хорошо разработанных ферментативных методов молекулярной биологии. Так, например, уже более 35 лет известно [20], что два фрагмента двухцепочечной ДНК могут быть нековалентно связаны при помощи «липких концов» — взаимно комплементарных одноцепочечных последовательностей (рис. 1)

Параметры образующейся при гибридизации комплементарных цепей структуры ДНК-дуплекса хорошо известны [21]. ДНК-дуплекс имеет диаметр около 2 нм, что соответствует нижней границе размеров, интересных для нанотехнологии.

В то время как для создания двумерных и трехмерных наноструктур значительный интерес представляют разветвленные компоненты, одно- и двухцепочечная ДНК топологически линейна. В связи с этим возникает проблема синтеза топологически нелинейных структур из ДНК. В зависимости от природы точки ветвления топологически нелинейные ДНК-структуры можно разделить на наноструктуры из немодифицированной ДНК (ветвление которых основано исключительно на комплементарности), и наноструктуры, основанные на модификации ДНК (ковалентной или использующей нековалентно связывающие ДНК молекулы).

1. Разветвленные наноструктуры, полученные из немодифицированной ДНК

В 1964 году Холлидей предположил [22], что в биологическом процессе рекомбинации, приводящему к обмену хромосом гомологичными участками, происходит промежуточное образование необычной ДНК-структуры, получившей впоследствии название сочленения Холлидея (рис. 2а).

3'

5'

З'

З'

-і—і—і—і—і—і—г

А Т Т G А С А

Т А А С Т G Т

_І І І І і І L

5'

3'

ТАТА"

|-т А-CG-

I-CG-GC-АТ-

-ТА--CG--CG--ТА--GC--АТ--ТА-

т—і—і—і—і—і—Г"

G Т Т G С Т Т
С А А С G А А
J І І І І І і_

5'

(а) (б)

Рис. 2. Сочленения Холлидея

Сочленения Холлидея представляют собой простейшие разветвленные ДНК-структуры, поскольку они могут быть построены из немодифицированных олигонуклеотидов, имеющих подходящие последовательности. Известны синтетические сочленения, построенные из трех [23] (рис. 26), а также четырех [24], пяти и шести [25], семи и восьми [26] цепей ДНК.

Отличительной особенностью сочленений Холлидея, обладающих симметрией последовательностей относительно точки ветвления является возможность миграции точки ветвления [27] (рис. 3). Для предотвращения миграции последовательности синтетических олигонуклеотидов должны быть выбраны так, чтобы сочленения не были симметричными.

5'.

5'

3'

*3'

Рис. 3. Миграция точки ветвления в сочленениях Холлидея

Пространственная структура сочленений изучалась различными физико-химическими методами [28], в том числе FRET [29]. В соответствии с полученными данными, двухспиральные домены ДНК в 4-х-олигонуклеотидном сочленении располагаются так, что их оси не компланарны и располагаются под углом порядка 60 друг к другу; при этом теоретически возможны две различные конформации точки разветвления (рис. 4). В первой из них — антипараллельной (рис. 4а) — цепи ДНК не проходят через центр точки разветвления, в то время как во второй - параллельной (рис. 46) — две цепи пересекаются в нем. Оказалось, что для обычных 4-х-олигонуклеотидных сочленений более предпочтительна антипараллельная конформация. Предположение о том, что это связано с несколько большим электростатическим отталкиванием остатков ДНК в параллельной конформации было опровергнуто синтезом так называемых bowtie-сочленений, содержащих необычные олигонуклеотиды с З'-З' и 5'-5'-связями [30] (рис. 5). В то время как двухспиральные участки таких сочленений идентичны аналогичным участкам сочленений Холлидея, структура точки ветвления в них отлична.

(а) (б)

Рис. 4. Конформации сочленений Холлидея

С помощью экспериментов по изменению электрофоретической подвижности наноструктур при удалении частей двухспиральных доменов посредством рестриктаз было показано, что bowtie-сочленения существуют в параллельной конформации. Таким образом, на предпочтительность одной из конформации сочленения природа точки ветвления оказывает большее влияние, чем электростатическое отталкивание. Этот результат согласуется с предположением о том, что в процессе генетической рекомбинации сочленения Холлидея должны иметь параллельную конформацию, в которой гомологичные участки ДНК располагаются ближе друг к другу. Вероятно, в

клетке происходит специфическое изменение свойств точки разветвления; при этом отсутствует необходимость изменения электростатических свойств огромных спиральных доменов.

Для определения жесткости сочленений Холлидея были предприняты эксперименты по олигомеризации сочленений с комплементарными «липкими концами» [23, 31]. Предполагалось, что в случае жесткой фиксации двухспиральных доменов ДНК под определенными углами должны образовываться только определенные циклические олигомеры, состав которых определялся бы размерностью исходного сочленения. Однако, во всех случаях образовывались смеси олигомеров (от димеров до декамеров). Очевидно, это свидетельствует о некоторой вариабельности углов сочленений, образуемых ДНК-спиралями.

С G -G С -С G--АТ--АТ--Т А -С G' -С GH

3'*

5'

, У 5'

і і І І і і і і

GCACGAGT

CGTGCTCA
_1 I I I I І і і

5'

С G CG G С-

-АТ-

-АТ'

-ТА

G С'

С G'

3'

5'

3'

і I I I I I I R

TGATACCG

ACTATGGC

«J I I I I І і і

5'

3' 3'

5'

Рис. 5. Bowtie-сочленение

Наноструктуры, точками ветвления в которых являются только одиночные сочленения, известны (например, получаемые с высоким выходом и практически монодисперсные ДНК-дендримеры [32]); однако, недостаточная жесткость сочленений как точек разветвления часто является препятствием для синтеза наноструктур, в особенности периодических. Так, невозможность создания регулярной двумерной сетки из 4-х-олигонуклеотидного сочленения с «липкими концами» объясняется, по-видимому, гибкостью такого сочленения. В качестве более жестких строительных блоков для двумерных периодических ДНК-сеток Симэн и сотр. использовали необычные ДНК-структуры, содержащие несколько сочленений и названные ими кроссоверами [33, 34]. Было показано, что в экспериментах по циклизации кроссоверы являются более жесткими,

чем состоящие из трех сочленений треугольные структуры [35]. Образование кроссоверов можно представить как «взаимный обмен» двух ДНК-дуплексов фрагментами цепей. Впоследствии эта методология дизайна была обобщена авторами для создания других, более сложных мотивов для нанотехнологии [36,37].

DPE DPOW DPON DAE DAO DAE+J

Рис. 6. Двойные кроссоверы [36]. Стрелки соответствуют З'-концам олигонуклеотидов.

Двойные кроссоверы (рис. 6) содержат в себе четыре цепи ДНК, соединенные сочленениями; различают параллельные (DPE, DPOW, DPON и антипараллельные (DAE, DAO, DAE+J) двойные кроссоверы. Вследствие налагаемых на структуру параллельных двойных кроссоверов топологических ограничений, точки «перехлеста» параллельных ДНК-цепей в них могут быть разделены только целым числом полуоборотов двойной спирали. В зависимости от того, четным или нечетным является это число, меняется структура двойных кроссоверов. DPE и DAE содержат четное число полуоборотов между перехлестами; DPOW, DPON и DAO - нечетное. Различие между DPOW и DPON заключается в том, попадает ли дополнительный нечетный полувиток на большую или малую бороздку двойной спирали.

Антипараллельные двойные кроссоверы более устойчивы, чем параллельные, вследствие чего они предпочтительны для построения наноструктур. Антипараллельные кроссоверы могут быть также использованы для введения в структуру точек ветвления (рис. 6, DAE+J). Наличие дополнительной точки ветвления практически не сказывается на жесткости и стабильности структуры.

Известны и кроссоверы, содержащие большее количество «перехлестов» цепей, таких как тройные кроссоверы [37] и паранемные кроссоверы [38,39].

Двойные кроссоверы, содержащие две пары комплементарных цепей, способны к образованию четырех «липких концов». Это позволило использовать фрагменты

кроссоверов для синтеза множества самособирающихся дискретных, а также одномерных и двумерных периодических ДНК-структур.

2. Дискретные ДНК-наноструктуры

Синтез дискретных наноструктур на основе ДНК наиболее интересен с точки зрения создания молекулярных устройств, однако первыми синтезированными структурами были геометрические объекты. Для разветвления цепи ДНК были использованы сочленения.

Двухспиральная структура ДНК налагает ограничения на длину цепей, соединяющих вершины объектов (сочленения). Относительное расположение боковых цепей сочленений, имеющих общую цепь, зависит от числа полуоборотов двойной спирали в общей цепи. Простой механической аналогией этого случая могут быть две гайки, навернутые на болт: взаимная ориентация их граней зависит от числа оборотов резьбы между ними [1]. Поэтому, для того, чтобы замкнутые наноструктуры на основе сочленений могли образоваться, длина ребер (состоящих из двухспиральной ДНК) должна быть выбрана так, чтобы она соответствовала целому числу полуоборотов двойной спирали. Структуры полученных впоследствии ДНК-нанообъектов были спроектированы с учетом этого ограничения.

В 1989 году Симэном и сотр. был опубликован [40] синтез квадратной наноструктуры при помощи гибридизации и последующего лигирования четырех сочленений, содержащих «липкие концы» (рис. 7). Сочленения были получены гибридизацией синтетических олигонуклеотидов подходящей последовательности. Простое смешивание сочленений приводило к низкому выходу продуктов; однако, оказалось, что выход может быть существенно повышен при ступенчатом проведении самосборки: попарной гибридизации сочленений и последующем смешении в растворе образовавшихся компонентов квадрата. Продукт гибридизации ферментативно лигировали с образованием поликатенановой структуры. Поскольку желаемая наноструктура более не имела 3'-концов, обработка реакционной смеси 3'-экзонуклеазой приводила к деградации непрореагировавших цепей, оставляя полностью лигированный продукт интактным. Эти операции приводили к формированию желаемой наноструктуры с небольшой примесью более низкомолекулярного продукта лигирования, который был отделен гель-электрофорезом. Топология полученной наноструктуры была подтверждена при помощи секвенирования продуктов ее рестрикции.

Ilinf I

J^Hb

Fnu4H Г Рис. 7. Образование квадратной ДНК-наноструктуры, содержащей сайты рестрикции [40].

Топологические свойства двойной спирали приводят к тому, что замкнутые многоугольники и полиэдры, ребра которых представляют собой не имеющую разрывов двухцепочечную ДНК, являются поликатенанами. Как следствие, обработанные ДНК-лигазой после самосборки полиэдры устойчивы в денатурирующих условиях.

Возможность проведения очистки в денатурирующих условиях была использована в синтезе ДНК-куба, собранного из 10 олигонуклеотидных цепей [39]. Промежуточный продукт, полученный лигированием двух граней куба, бьш денатурирован с образованием трикатенана; ренатурация и лигирование двух пар «липких концов» привело к образованию целевой структуры. В последовательности олигонуклеотидов, использованных для построения куба, было включено четыре сайта рестрикции различных нуклеаз. Специфическое расщепление их позволило доказать наличие характерного для куба порядка связей, в то время как истинная геометрия структуры в растворе неизвестна.

Синтез ДНК-усеченного октаэдра [42] удалось провести лишь при использовании нового твердофазного подхода к сборке наноструктур [43]. Особенность синтеза заключалась в том, что каждый промежуточный продукт, образующийся на твердой фазе, являлся топологически замкнутым; помещение подложки в денатурирующие условия позволяло отделить все нежелательные продукты, не имеющие топологической связи с присоединенным к подложке фрагментом. «Липкие концы» для лигирования образовывались в результате рестрикции «шпилек», содержащих подходящие последовательности. Молекулярная масса полученной структуры составила около 790 кДа.

ДНК-тетраэдр (рис. 8) был собран из четырех олигонуклеотидов, каждый из которых содержал по 55 оснований [44]. В отличие от ранее упомянутых структур, ДНК-тетраэдр не был лигирован, и, как следствие, не являлся поликатенаном. Порядок связей в структуре был также доказан с использованием нуклеаз рестрикции; были выполнены и контрольные эксперименты по самосборке последовательностей, содержащих некомплементарные участки и, как следствие, неспособных к образованию тетраэдра.

Рис. 8. ДНК-тетраэдр [44].

Аналогичный ДНК-тетраэдр, но лигированный, был получен той же группой авторов позже [45]. Для проведения лигирования последовательности исходных олигонуклеотидов были выбраны таким образом, чтобы одноцепочечные разрывы приходились не на вершины, а на ребра тетраэдра. Полученная жесткая структура была использована для определения механических характеристик ДНК-дуплекса методом АСМ.

ДНК-тетраэдр благодаря своей жесткости является удачным конструкционным элементом для построения ДНК-наноструктур. Из модифицированных олигонуклеотидов был получен тетраэдр [46], содержащий в трех углах дисульфидные группы, и в одном -краситель СуЗ или биотин. Иммобилизация тетраэдра на золотой поверхности позволяет получить поверхность с контролируемой загрузкой и ориентацией функциональных групп. Исследования кинетики десорбции тиолированных ДНК-тетраэдров показали, что тетраэдр, содержащий три тиольные группы, имеет в 5000 раз большее сродство к золотой подложке, чем простой тиол-модифицированный олигонуклеотид.

Весьма жесткий ДНК-октаэдр (рис. 9, [47]) был синтезирован путем гибридизации длинного (1669 оснований) фрагмента ДНК с 5 короткими (40 оснований). Его ребра представляли собой двойные и паранемные кроссоверы, вершины -четырехходовые сочленения. Не только топология, но и геометрия ДНК-октаэдра (в отличие от ранее полученных многогранников) была подтверждена экспериментально

методом криоэлектроннои микроскопии с последующей компьютерной реконструкцией трехмерной структуры. Диаметр полученной наноструктуры составил около 20 нм.

Рис. 9. ДНК-октаэдр [47]. Верхние ряды - изображения, полученные криоэлектроннои микроскопией и соответствующие им проекции октаэдра на плоскость; снизу -реконструкция трехмерной структуры октаэдра по данным криоэлектроннои микроскопии.

Самосборка плиток, состоящих из двойных кроссоверов и содержащих гибкие линкеры переменной длины, приводила к образованию ДНК-тетраэдров, додекаэдров и «бакиболов» - аналогов фуллерена Сбо ([48]; рис. 10). Примечательно, что только лишь вариация длины гибкого линкера и концентрации ДНК позволила провести весьма специфичную самосборку этих наноструктур. Выход тетраэдра составил 90%, додекаэдра - 76%, а аналога Сбо - 69%.

Рис. 10. Слева направо: АСМ-изображения ДНК-тетраэдров, ДНК-додекаэдров и ДНК-бакиболов [48].

ДНК представляет собой интересный объект для построения наноструктур с топологической связью, таких как катенаны, ротаксаны и узлы. В отличие от аналогичных органических соединений, для получения топологически связанных ДНК-наноструктур можно использовать топологические свойства двойной спирали, а не только статистический синтез. Топологически связанные ДНК-наноструктуры таким образом легко получаются путем лигирования цепей подходящей длины; данный подход, использующий топологические свойства ДНК-дуплекса, был использован в синтезе ДНК-колец Борромео [49] (рис. 11). Кольца Борромео - топологический объект, состоящий из трех переплетенных колец; отличительным свойством колец Борромео является то, что при разрыве любого одного кольца оставшиеся два высвобождаются.

Необходимая для получения этой структуры левозакрученная ДНК-спираль была получена путем выбора для нее последовательности, способной к образованию Z-ДНК, и введения в нее 5-метилцитозина, облегчающего переход В-ДНК в Z-ДНК.

») б)

Рис. 11. Кольца Борромео: а) топологическое представление и б) модель синтезированной ДНК-наноструктуры [49].

Топология наноструктуры была подтверждена ее рестрикцией различными эндонуклеазами в трех сайтах, расположенных в различных кольцах. Таким образом было показано, что обработка любой из трех экзонуклеаз приводит к высвобождению двух кольцевых ДНК.

Ncol

EcoRI

a)

Рис. 12. ДНК-наноструктуры с топологической связью: а) топологическое присоединение репортерной группы [50] и б) конъюгат двух плазмид [51].

При использовании подобного подхода были получены и другие ДНК-наноструктуры, содержащие топологическую связь [50, 51, 52].

Широко используемые для сборки периодических ДНК-структур (см. ниже) плитки, построенные из двойных кроссоверов, были применены для получения дискретных плоских наноструктур (рис. 13; [53]).

180x180 нм

Рис. 13. Самосборка ДНК-плиток с образованием дискретных плоских структур [53]: а) структура исходных плиток («липкие концы» не показаны); б) наноструктура, получаемая при самосборке 13 плиток (А-М), содержащих «липкие концы»; в) и г) изображения наноструктур, полученные с различным разрешением с помощью атомно-силового микроскопа.

Для сборки были использованы как плитки, так и крестообразные фрагменты (также построенные из кроссоверов). Следует отметить, что симметрия исходных компонентов позволяет уменьшить их число, требуемое для сборки непериодической наноструктуры нужного размера. Так, для сборки наноструктуры размером 5x5 плиток, необходимо не 25 уникальных плиток, а лишь 13.

Плитки с закодированной в виде штрих-кода информацией объемом 5 бит были получены посредством самосборки в работе [54].

Для построения дискретных

iiil 1 I

iv +

4U 2 --3^ 4

jjl ^JLj A- Wtr

наноструктур в работе [55] был применен метод
ступенчатой самосборки (рис. 14). Для его
осуществления последовательности ДНК,
составляющие крестообразные фрагменты, были
выбраны так, чтобы иметь высокую (~60С)
температуру плавления. В то же время,
температуры плавления цепей ДНК,

формирующих связи между плитками, были более
низкими. Проводя отжиг смеси крестообразных
фрагментов от температуры 42С до комнатной,
авторам удалось достичь ступенчатой самосборки
ДНК-плиток, а также, используя

биотинилированную ДНК, декорировать плитки стрептавидином, формирующим на поверхности плиток буквы D, N и А.

Синтез наиболее сложных на настоящий
момент дискретных ДНК-наноструктур был
опубликован в 2006 году П. Ротемундом (рис. 15,
[56]). Для их получения был использован новый
подход - самосборка смеси длинного (7176
нуклеотидов) фрагмента генома фага М13тр18 с
200-250 короткими (32 нуклеотида)

Рис. 14. Ступенчатая самосборка дискретных ДНК-плиток [55].

синтетическими фрагментами ДНК,

выполняющими роль «скрепок». Их

последовательности были выбраны при помощи специально разработанного программного обеспечения.

Рис. 15. Самосборка сложных ДНК-наноструктур [56]: а) принцип построения плоских структур из длинной фаговой ДНК и олигонуклеотидных «скрепок»; б) схемы укладки фаговой ДНК в наноструктуры и их изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа (размер верхних изображений 165x165 нм, белая полоса на нижних соответствует 100 нм); в) и г) изображения наноструктур, содержащих шпильки, перпендикулярные плоскости подложки.

Преимуществом предложенного подхода является толерантность самосборки как к вариации соотношения концентраций олигонуклеотидов, так и к их чистоте. Для самосборки использовался 200-кратный избыток неочищенных синтетических олигонуклеотидов по отношению к матрице из фаговой ДНК; отмечается, что стоимость наноструктур в этом случае все же определяется стоимостью фаговой ДНК, а не олигонуклеотидов. Предложенный таким образом подход является перспективным с точки зрения создания самособирающихся электронных наноустройств.

3. Периодические ДНК-наноструктуры

Исторически изначальной целью исследований в области синтеза ДНК-наноструктур было решение проблемы кристаллизации макромолекулярных соединений [57]. Предполагалось, что если создать имеющую достаточно большие ячейки трехмерную периодическую сетку из ДНК, в ней можно было бы разместить макромолекулы; если их расположение будет одинаковым и периодическим, то рентгеноструктурный анализ подобного соединения включения позволил бы определить пространственную структуру молекулы-«гостя». Это было бы особенно полезно для белков и пептидов, кристаллизация которых часто представляет значительные трудности.

Впоследствии изучение периодических ДНК-наноструктур стимулировалось перспективами наноэлектроники; так, например, был описан метод использования ДНК-наноструктур в качестве матриц для литографии [58]. Полученные описанным методом золотые поверхности были структурированы с разрешением, труднодостижимым или вообще недоступным для современной фотолитографии.

Несмотря на гибкость сочленений Холлидея и малую пригодность их для создания периодических структур, в работе [59] описан синтез двумерной структуры, основанной на сочленениях. Относительная жесткость конструкции была достигнута путем предварительной сборки ромбических фрагментов из восьми олигонуклеотидов; самосборка этих фрагментов, содержащих «липкие концы», позволила получить одно- и двумерные структуры, охарактеризованные атомно-силовой микроскопией. При помощи аналогичной ромбической структуры были получены двумерные кристаллы регулируемой периодичности [60].

4 *

_{* л*.}

\

Рис. 16. ДНК-наноструктуры, построенные по принципу tensegrity [61]. а) Схема построения элементарной ячейки из олигонуклеотидов; б) изображение наноструктуры, полученное с помощью атомно-силовой микроскопии (размер 200 х 200 нм).

Одно- и двумерные структуры из сочленений были описаны в работе [61] (рис. 16). В этом случае жесткость наноструктур обеспечивалась использованием принципа

противодействия «стягивающих» олигонуклеотидов с «удерживающими» (tensegrity). Подобный принцип был ранее применен в строительстве Бакминстером Фуллером.

Несмотря на доказанную возможность сборки периодических ДНК-наноструктур только из сочленений, основная часть работ по их синтезу вьшолнена на основе блоков, содержащих кроссоверы.

В работе [62] авторами была впервые показана самосборка плиток, состоящих из двойных кроссоверов, с образованием периодических структур (рис. 17).

_{.) ГАЇ}

|В|

|А| |В| |С! |D] ВІ

б) DAO

DAE

36 п.о., 12.6 нм

47 П.О., 16.0 нм

н М

_&ОС*

г)

оатэосотсоэтттас умпсвммксосАтсв

аоаиито Л тсАастсстаостАассАТАС

САГГстоалсосслтА Дтстатсзтссоатоас

з*гэоса*САТсстосхостАта*ттАСАСхэоста^с*ггаА^АС^

АСТСОТАДСТвТОСОГСАв

«sjatcaao-juj

^

ЗСТСТАСАвОАТСГОО \ СОАСОАСАООСТАСОСХЛТГОАССААТСІООТ ACTАСОТЭССЛТСОС

ладхсамвАют \тААвттза»сллссаслтстс оатсдовспхгга^ссаАтасоаггсАСтааттлсг

"Г

атАтаосамсоо /тосААтагсстлАсашата* сшчхлтаАСсасАЛСАТзлтосаттлос

идятосд йтиме / оаогоосАссасстоосхггготАстлоскаАісстаооатАтоаАоо

Д) (***

/

СТЭСТАСЗТТ

ОАсвАтас

чі;

стсаствА

ОСТСТАСЛаСАТСТОС

ТЛСОССАЗТШкССЛЛГСЛОСІГАСТ АСОТЭССЛТСОС

ТЛАОГГОДАСААССОСАТСТС аЭТСАООСТОСТОТСа»Т\КООГ1АСУООТТАД?

Т9САЛТ9ТССТЛАСО0МТОЛ CqtOCTQUACCqCAfcr>T3ATqcgTTAQS

_S"

аас/ ос*зтсмс»саАсстоосоттотАстАСосААТсетоссатАТсаАСо

саоттатс

ОССААСАОТТ

Рис. 17. Самосборка плиток, состоящих из двойных кроссоверов [62]. а) Схема самосборки плиток; б) модели плиток на основе антипараллельных двойных кроссоверов типа DAO и DAE; в) топологическая схема элементарной ячейки образующегося двумерного кристалла; г) последовательности олигонуклеотидов, собирающихся в плоские плитки; д) последовательности олигонуклеотидов, образующие плитки со шпильками.

Из синтетических олигонуклеотидов авторами были собраны плоские плитки (рис. 17, г) и плитки, образующие выпуклые шпильки, перпендикулярные плоскости двойного кроссовера. С помощью метода АСМ авторами была доказана самосборка наноструктур, имеющих характерную и регулярную поперечную исчерченность, определяющуюся периодическим включением плиток, имеющих шпильки. Биотинилированные олигонуклеотиды вовлекались в самосборку с образованием периодически биотинилированных наноструктур; визуализация биотина конъюгатом стрептавидина с коллоидным золотом позволила наблюдать на АСМ-изображении наноструктуры, имеющие предсказанный характер поперечной исчерченности.

Впоследствии той же группой авторов было показано [63] изменение поперечной исчерченности при отщеплении шпилек, содержащих сайты рестрикции, соответствующими эндонуклеазами. Таким образом, была еще раз продемонстрирована возможность использования ферментов для изменения топологии и морфологии наноструктур. Аналогичное превращение без участия ферментов было осуществлено при включении в последовательность шпильки последовательности ДНКзима [64]. Отщепление шпилек в этом случае происходило при добавлении в буфер иона Си²⁺.

Аналогичный подход был применен [65] к самосборке тройных кроссоверов, содержащих три двухспиральных домена (рис. 18), а также дважды двойных кроссоверов (содержащих четыре двухспиральных домена) [66].

Рис. 18. Самосборка тройных кроссоверов [65]. а) Мономер - тройной кроссовер; б) изображение, полученное при помощи АСМ (1400^870 нм).

Двумерные ДНК-кристаллы различной симметрии были собраны из треугольных и звездообразных блоков. Так, смешение двух треугольных фрагментов (рис. 18, а), построенных из двойных кроссоверов и имеющих комплементарные «липкие концы», и охлаждение смеси от 45С до комнатной температуры приводит к образованию

псевдогексагональных наноструктур, визуализированных посредством АСМ (рис. 19, г) [67].

1.22 мкм 3.13 мкм 158 нм 108 нм

Рис. 19. Самосборка псевдогексагональных наноструктур [67]. а) Мономер - треугольный фрагмент, построенный из двойных кроссоверов; б), в) схема самосборки смеси треугольных фрагментов с комплементарными липкими концами; г) АСМ-изображения, полученные при различном поле сканирования.

Гексагональные сетки были получены самосборкой звездообразных элементов, имеющих вращательную ось симметрии С з [68]. Помимо АСМ, для характеризации доменов сеток была использована флуоресцентная микроскопия (после прокрашивания ДНК-связывающим флуоресцентным красителем YOYO-1). Так были найдены домены, имеющие размер до 1 мм. Образование столь больших и регулярно структурированных доменов объясняется примененным авторами оригинальным подходом к нивелированию периодических дефектов, свойственных ранее полученным ДНК-наноструктурам.

Эти дефекты возникают из-за недостаточного понимания и излишнего упрощения истинной структуры кроссоверов и других ДНК-мотивов на стадии их дизайна. Соединение элементов периодических структур имеет некоторую неидеальность, выражающуюся в нарушении геометрических параметров элементов и отличии числа полувитков ДНК между сочленениями от целого. При росте периодической наноструктуры эта неидеальность имеет свойство накапливаться, что приводит к все большему искажению структуры и, в конечном счете, прекращению ее роста.

Использованный же в данной работе подход заключается в сборке структуры из одного-единственного уникального самокомплементарного элемента таким образом, что соседние элементы оказываются «перевернутыми» относительно друг друга (рис. 20, а). При этом происходит компенсация и нивелирование неидеальности элементов, которая более не накапливается при росте двумерного кристалла.

Рис. 20. Самосборка звездообразных элементов [68]. а) Образование связи между мономерными элементами (черным треугольником обозначена ось Cj); б) АСМ-изображение наноструктуры.

Аналогичный подход был распространен той же группой авторов на получение двумерного кристалла с квадратной элементарной ячейкой [69]. Применение симметричного мономера вместо возможного несимметричного (рис. 21, а) позволило, помимо коррекции неточностей самосборки (рис. 21, б), обойтись меньшим числом олигонуклеотидных последовательностей (всего 3 вместо 9).

асимметричный симметричный

Рис. 21. Самосборка звездообразных элементов [69]. а) Асимметричный элемент, который мог бы использоваться для самосборки, и симметричный, примененный в эксперименте; б) коррекция неточностей самосборки при помощи «перевернутого» расположения соседних элементов; в) АСМ-изображения периодической наноструктуры.

Поскольку самосборку ДНК-наноструктур в будущем планируется использовать для различных технологических применений, весьма желательно было бы уже сейчас

разрабатывать методы самосборки, наиболее «экономные» с точки зрения числа вовлекаемых последовательностей ДНК. Возможно, в будущем ДНК-наноструктуры найдут применение для изготовления весьма больших и дискретных наноструктурированных объектов, например, микропроцессоров; несмотря на то, что число последовательностей ДНК, которые могут ортогонально гибридизоваться, весьма велико, желательным представляется сведение числа уникальных последовательностей к минимуму. Вследствие этого, в последнее время в области самосборки ДНК-наноструктур все большее внимание уделяется симметрии.

В этом свете существенного прогресса удалось добиться авторам работы [70], получившим двумерные периодические ДНК-сетки всего из двух олигонуклеотидов (26-мера и 52-мера), частично самокомплементарных и образующих мотив двойного

кроссовера (рис. 22).

Рис. 22. Самосборка двумерной структуры из двух олигонуклеотидов [70]. а) Схема самосборки; б) последовательности использованных в эксперименте олигонуклеотидов; в) АСМ-изображения периодической наноструктуры.

Известно, что кристаллографические группы симметрии могут содержать вращательные оси симметрии только 2, 3, 4 и 6 порядка. В то время как несколько работ было посвящено синтезу ДНК-наноструктур с осями 2, 3 и 4 порядка, первый синтез структуры с осью 6 порядка был описан в работе (рис. 23) [71]. Элементом этой структуры, опять же, был выбран звездообразный мотив. Циклическая цепь ДНК, составляющая его сердцевину, была получена ферментативным лигированием.

4 витка

Рис. 23. Самосборка двумерного ДНК-кристалла, содержащего ось Cg [71]. а) Схема самосборки; б) АСМ-изображение наноструктуры; в) изображение большого домена наноструктуры, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии.

Помимо двумерных периодических наноструктур, с помощью самосборки ДНК были получены различным образом построенные нанотрубки.

Две публикации, посвященные ДНК-нанотрубкам и выполненные разными группами исследователей независимо, вышли в 2004 году в одном и том же номере J. Am. Chem. Soc. В обоих случаях трубки были собраны из фрагментов кроссоверов, образующих при самосборке сворачивающиеся в трубки плоскости. В работе [72] сообщается о хиральных трубках, принцип образования которых был выяснен путем

анализа поперечной исчерченности стрептавидиновых конъюгатов трубок, собранных из биотинилированных кроссоверов (рис. 24).

Рис. 24. Самосборка ДНК-нанотрубок [72]. а) Схема самосборки; б) АСМ-изображение конъюгата биотинилированнои наноструктуры со стрептавидином. Масштабная полоса соответствует 200 нм.

Вторая работа [73] посвящена рациональному дизайну нанотрубок и изучению их структуры. Полученные трубки имели диаметр 7-20 нм при длине до 50 мкм. Особенно интересным представляется наблюдаемый авторами процесс раскрытия трубок с

образованием плоских структур при продолжительном сканировании их посредством АСМ. Более устойчивые нанотрубки, неспособные к такому раскрытию, были получены при ферментативном лигировани [74].

Рис. 25. ДНК-нанотрубки из шести двухспиральных доменов [77]. а) Последовательности использованных олигонуклеотидов; б) АСМ-изображение нанотрубок (размер 7.32x7.32 нм).

Самосборка связок трех [75], [76] и шести [77] спиральных доменов позволила получить одномерные структуры (рис. 25). В работе [76] обсуждается сборка двумерных и даже трехмерных структур из тройной связки двухспиральных доменов; однако, какая-

либо характеризация полученных структур отсутствует. Позже была продемонстрирована возможность контролируемого получения ДНК-нанотрубок, состоящих из 4, 5, 6, 7, 8, 10, или 20 двухспиральных доменов [78], а также программирование самосборки ДНК-нанотрубок с помощью золотых наночастиц [79].

Абсолютный предел экономии числа использованных для самосборки периодической наноструктуры олигонуклеотидов был продемонстрирован в работе [80], где было показано образование ДНК-нанотрубок из всего одного олигонуклеотида, содержащего комплементарные фрагменты последовательности (рис. 26).

) б)

1 мкм

Рис. 26. Самосборка ДНК-нанотрубки из одного олигонуклеотида [80]. а) Последовательность олигонуклеотида; б) димер олигонуклеотида, содержащий фрагмент двойного кроссовера типа DAO; в) самосборка димера олигонуклеотида; г) сворачивание нанотрубки; д) АСМ-изображение ДНК-нанотрубки; белой стрелкой отмечен дефект-неполное сворачивание плоскости в трубку; е) АСМ-сечение, проходящее через отмеченные серыми треугольниками точки.

Рис. 27. Биотинилированные самособирающиеся наноструктуры (слева); те же структуры после обработки стрептавидином (справа) [81].

Самособирающиеся ДНК-наноструктуры, содержащие биотин, использовались для пространственной организации молекул стрептавидина ([81], рис. 27) и конъюгатов флуоресцентных наночастиц со стрептавидином [82].

Несмотря на впечатляющие успехи в области создания наноструктур на основе немодифицированной ДНК, ожидается, что еще большее их разнообразие удастся получить при введении в ДНК модификаций - например, при синтезе разветвленных структур посредством разветвляющих реагентов и конъюгации олигонуклеотидов.

4. Разветвленные наноструктуры, полученные модифицикацией ДНК

Использование разветвляющих реагентов для автоматизированного ДНК-синтеза представляет собой альтернативный метод введения точек ветвления в синтетические олигонуклеотиды (схема 1). В отличие от олигонуклеотидных сочленений, синтезированные при помощи разветвляющих реагентов олигонуклеотиды стабильны в денатурирующих условиях, что в ряде случаев может оказаться желательным.

DMTCV/ODMT

ІЛЛЛЛЛЛЛЛЛПІ*

_or

ллллллллпл/»

DMTCX. ,ODMT

1. 0._p.N(/-Pr)₂

^CN

2. Стандартные реагенты цикла ОНС

1.0НС

2. Аммонолиз

-р^ ^0<:р-

точка ветвления Схема 1. Использование разветвляющих реагентов для синтеза нелинейных ДНК-структур

С помощью разветвляющих реагентов было достигнуто раздваивание (например, реагенты 1а, 16 [83]) и растраивание (реагент 2 [84]) растущей цепи олигонуклеотида. Реагент 2 применялся и для синтеза олигонуклеотидных дендримеров; пять последовательных конденсаций 2 приводят к 240-кратному увеличению числа гидроксильных групп на твердофазной подложке при введении спейсерных последовательностей из 5-10 оснований между конденсациями.

ODmt

N(/-Pr)₂

ODmt DmtO

ODmt

1a:n = 1 16: n = 9 1в:п = 2

DmtO

ODmt

(/-Pr)₂N

P-0 .0

HN-

.ODmt

\ ODmt

iDmt

Посредством реагента 3 были получены самокомплементарные «изогнутые» олигонуклеотидные конъюгаты, которые самособирались в циклические наноструктуры, состоящие главным образом из 2—7 мономерных единиц [85].

Гибридизация двух олигонуклеотидов, синтезированных с использованием аналогичного реагента 4 и имеющих комплементарные 5'-концевые цепи, приводит к образованию структур, названных авторами «наноацетиленом» и «наноциклобутадиеном» [86]. Названия структур отражают их аналогию со скелетами соответствующих органических молекул; каждый двухспиральный домен ДНК рассматривается как углерод-углеродная связь, а каждая точка ветвления - как атом углерода. Наличие трех «связей» в «наноацетилене» подтверждено обработкой наноструктур нуклеазой, специфично расщепляющей одноцепочечную ДНК; показано, что «наноацетилен» содержит только двухцепочечные ДНК-фрагменты.

При помощи реагентов 1а и 1в были синтезированы разветвленные олигонуклеотидные структуры, в том числе Н-образные, содержащие четыре попарно одинаковые последовательности, и структуры, меченные биотином. Строение разветвленных олигонуклеотидов подтверждалось, в том числе, электронной микроскопией продуктов их гибридизации с комплементарными последовательностями, конъюгированными с частицами коллоидного золота [87].

Основным препятствием для использования аналогов реагентов 1—3 в нанотехнологии является невозможность синтеза с их помощью разветвленных олигонуклеотидов, содержащих различные цепи. Для устранения этого недостатка были синтезированы разветвляющие реагенты, содержащие ортогональные защитные группы [88]. Следует отметить, что снятие нестандартных защитных групп не может быть произведено непосредственно в автоматизированном синтезаторе.

О ⁴NH

N(/-Pr)₂

Реагент 5 позволяет синтезировать разветвленные олигонуклеотиды с

различными цепями без использования нестандартных защитных групп [89]. Разница в

реакционной способности первичной и третичной ОН-групп позволяет вначале

синтезировать последовательность от 5'-гидроксила разветвляющего реагента (при

уменьшенной в два раза концентрации фосфорамидитных реагентов), а затем — 2'-последовательность. Конденсация первого фосфорамидита по третичной ОН-группе требует увеличения его концентрации в три раза при одновременном увеличении времени конденсации до 12 мин. Путем двухкратного использования разветвляющего реагента были синтезированы Н-образные олигонуклеотиды с четырьмя концами, имеющими различные последовательности.

OLev

ODmt

С помощью реагента 6 [90] были получены разветвленные ДНК-структуры, состоящие из трех цепей, имеющих произвольные последовательности. Из этих разветвленных структур были получены наноструктуры - аналоги бензола и нафталина [91], а также флуоресцентный рН-индикатор, основанный на обратимом образовании триплексной структуры [92].

Постсинтетическая конъюгация отдельных олигонуклеотидных цепей представляет собой наиболее гибкий подход к синтезу разветвленных ДНК-структур. С его помощью принципиально возможно получение разветвленных структур, содержащих любое число цепей произвольной последовательности, соединенных в любом желаемом порядке. Для проведения конъюгации необходимо, чтобы исходные олигонуклеотиды содержали функциональные группы, способные к специфическому образованию ковалентной связи и инертные по отношению к реагентам синтетического цикла ОНС; введение функциональных групп достигается использованием модифицирующих реагентов. Число работ, посвященных синтезу наноструктур путем постсинтетической конъюгации к настоящему моменту ограничено высокой стоимостью модифицированных олигонуклеотидов и малой коммерческой доступностью амидофосфитных реагентов с подходящими функциональными группами; большинство работ по конъюгации выполнено на основе продажных амино-модифицирующих реагентов.

В работе [93] описывается синтез конъюгата 7 посредством реакции гидразид-модифицированных олигонуклеотидов с 1,3,5-триформилбензолом. Исключительно несимметричное замещение в полученном аддукте определяется использованием матрицы 8. Олигонуклеотидные цепи матрицы образуют частично комплементарные пары с исходными гидразид-модифицированными олигонуклеотидами, что приводит к катализу конъюгации, приводящей к продукту 7. В отсутствие матрицы 8 образования конъюгатов с тремя цепями не происходит.

R³'0.

OR³'

~R³

R¹ R² R³

5'-pATT-ATG-GAC-CG-3'

5'-pATT-AGA-CGC-CAT-C-3'

5'-pTGG-TAG-CCG-CTA-GAT-3'

R¹' R²' R³'

3'-pTGG-TAG-CCG-CTA-GAT-5' 3'-pTAA-TAC-CTG-GCT-AAA-5' 3'-pACC-ATC-GGC-GAT-CTA-5'

Синтез необычного рутений-трис-бипиридильного комплекса, содержащего две 5'-олигонуклеотидных цепи, был осуществлен путем постсинтетического сшивания 5'-ОН-групп растущих олигонуклеотидных цепей на твердой фазе бис-амидофосфитным реагентом [94]. Следует отметить, что аналогичную структуру можно синтезировать посредством стандартного ОНС только при использовании весьма дорогих З'-О-диметокситритил-5'-0-амидофосфитов.

Ковалентное связывание (схема 2) синтезированных с использованием разветвляющих реагентов олигонуклеотидов описано в работе [95]. В этом случае селективное образование связи между фрагментами салицилового альдегида, несущими комплементарные олигонуклеотиды объясняется образованием ДНК-дуплекса, сближающего реагирующие группы. Конъюгация олигонуклеотидов, содержащих два или три фрагмента салицилового альдегида, приводит к образованию различных линейных и разветвленных наноструктур.

З'

5'

HN^ ^NH ^H^

,NH,

Mn²⁺, KCI

З',,— 5'

HN NH

О О

о_ч?і_хо

n' ⁴n

Схема 2. Ковалентное темплатное связывание модифицированных олигонуклеотидов

Разветвленные ДНК-структуры типа 9, содержащие атомы металлов в точке разветвления, были также описаны в работе [96].

_Г?

3'

5. Молекулярные устройства на основе ДНК и обработка информации

с

_5"

-I II г

-1ИП1ІІІЦ

ПІК

В то время как синтез геометрических и топологических объектов представляет собой прекрасную иллюстрацию современных возможностей ДНК-нанотехнологии, основной целью многих исследований является создание молекулярных устройств на основе ДНК, способных к осуществлению определенной функции.

Рис. 28. Молекулярное устройство

Механические наноустройства на основе ДНК [97] способны к изменению конформации при изменении состава среды. Для изменения конформации удобно использовать образование трех- и четырехцепочечных структур, устойчивость которых в существенной степени зависит от присутствия в растворе ионов.

Описанное в работе [98] механическое
молекулярное устройство включает и
выключает флуоресценцию в зависимости от
рН. Устройство содержит области

Рис. 29. Плитки Вонга[16]

одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, флуоресцентный краситель (родамин) и тушитель (BHQ-1). Последовательности подобраны таким образом, что в кислой среде происходит образование ДНК-триплекса; при этом краситель и тушитель сближаются, а флуоресценция тушится. При повышении рН триплекс становится нестабильным и диссоциирует на дуплекс и одноцепочечную ДНК, краситель отдаляется от тушителя и флуоресценция восстанавливается. Процесс обратим, что было показано многократным переключением устройства из одного состояния в другое.

Для измерения энергии связывания белка IHF с ДНК была использована механическая система, содержащая два соединенных между собой участком двухцепочечной ДНК фрагмента тройных кроссоверов [99]. К одному из красителей присоединена молекула флуоресцеина, к другому - красителя СуЗ. При связывании белка с двухцепочечным участком происходит изменение геометрии двойной спирали, что в свою очередь приводит к изменению расстояния между красителями. Анализ спектров флуоресценции позволяет по изменению интенсивности FRET оценить расстояние между молекулами красителей. Если фрагменты двойных кроссоверов дополнительно связать между собой двухцепочечным участком (рис. 28), имеющим определенную температуру плавления, то становится возможной оценка энергии связывания белка с ДНК.

Помимо механических наноустройств, предпринимаются попытки создания на основе ДНК систем обработки информации. Молекулярное запоминающее устройство емкостью 3 бита [100] было сконструировано из пяти олигонуклеотидных цепей. Запись и стирание информации производятся путем добавления в среду олигонуклеотидов определенной последовательности; чтение информации — измерением спектров флуоресценции.

Для осуществления вычислений при помощи ДНК-структур предложено использовать ДНК-аналоги плиток Вонга (рис. 29). Плитки Вонга [101] - набор квадратов, имеющих цветные грани. Плитками можно выложить плоскость, при этом соседние грани плиток должны иметь одинаковый цвет. Было показано, что работу любой машины Тьюринга (являющейся математической моделью любой вычислительной системы) можно формализовать набором плиток Вонга. Физическим эквивалентом формальных плиток с цветными гранями можно считать плоские ДНК-структуры, имеющие четыре «липких конца».

В работе [102] описаны плитки Вонга на основе двойных кроссоверов. Кодирующие единицу плитки содержали перпендикулярную плоскости шпильку, считываемую с получаемых массивов атомно-силовым микроскопом. Построенные из плиток массивы демонстрируют возможность счета при помощи плиток; каждый ряд плиток соответствует разряду двоичного числа (рис. 30). Использованию этого подхода для специфической пространственной организации молекулярных компонентов на настоящий момент препятствует достаточно большая доля ошибок (около 10%), однако принципиальная возможность программируемой сборки непериодического массива таким образом экспериментально доказана.

Рис. 30. Счет при помощи ДНК-плиток Вонга

Таким образом, ДНК-нанотехнология представляет собой весьма интересное, перспективное и динамично развивающееся направление исследований в области химии нуклеиновых кислот. Несмотря на то, что говорить о широком применении полученных результатов на практике пока рано, перспективы данной области поражают воображение.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Синтез реагентов для модификации олигонуклеотидов

В Си(1)-катализируемой реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения принимают участие терминальные ацетилены (10) и органические азиды (11, схема 3). Поскольку азидогруппа не совместима со стандартным фосфорамидитным олигонуклеотидным синтезом, для введения в олигонуклеотиды нами были выбрана ацетиленовая группа.

RV ^N3 кат.Си(І) ^RV\l

_^4 ⁺ _{V — чГ}

Н₂0, комн. т. 'л ,

10 11 ² R²

Схема 3

С целью сравнения поведения алкил- и арилацетиленов в условиях конъюгации, были синтезированы реагенты для введения как алкилэтинильной, так и арилэтинильной группы.

Реагент 14 (содержащий алкилацетиленовую группу) был получен посредством раскрытия коммерчески доступного энантиомерно чистого 2-гидроксибутиролактона 12 пропаргиламином, диметокситритилирования промежуточного продукта, и последующего фосфитилирования предшественника 13 (схема 4). Последнее соединение было также иммобилизовано на стекле контролируемой пористости для получения твердофазного носителя 15, на котором синтезировались олигонуклеотиды, содержащие 3'-ацетиленовую модификацию.

DmtO

93%

86% : N ^%.

ОН О

15.R-

12 ^R ""Y^^T^O

О CPG

Реагенты и условия: /, Пропаргиламин, МеОН, 60С, 48 ч; DmtCl, Ру, 48 ч; И, 2-цианэтоксибис(диизопропиламино)фосфин, тетразолид диизопропиламмония, СНгС1₂, 12 ч; ш, сукциноиламинопропил-CPG (60 мкмоль/г), диизопропилкарбодиимид, DMAP, Py/DMF, 150 ч.

Схема 4

Для введения арилацетиленовой модификации был синтезирован терминирующий фосфамидитный реагент 20 (схема 5).

со₂н

81%

Me₃Si

N(/-Pr)₂

99%

89%

Реагенты и условия: /, триметилсилилацетилен, Pd(PPh₃)4, Cul, EtsN, DMF, 12 ч; HCl; И, трис(пирролидин-1 -ил)бенотриазол-1 -илоксифосфоний гексафторфосфат, этилдиизопропиламин, 20 мин; тира7/с-4-гидроксициклогексиламмоний хлорид, этилдиизопропиламин, 4 ч; //'/, фторид тетрабутиламмония, THF, 10 мин; iv, 2-цианэтоксибис(диизопропиламино)фосфин, тетразолид диизопропиламмония, СН₂С1₂, 12 ч.

Схема 5

С использованием носителя 15 и фосфамидитов 14 и 20 был синтезирован ряд олигонуклеотидов. Для этого был применен стандартный фосфамидитный протокол олигонуклеотидного синтеза. Последовательности синтезированных олигонуклеотидов представлены в табл. 1. Структура олигонуклеотидов подтверждена спектрами MALDI-TOF.

Таблица 1. Синтезированные модифицированные олигонуклеотиды.

Шифр

Последовательность (5'^->-3')

Остаток X

XCA-TTA-CAT-CCA-GAC

НО

XGT-CTG-GAT-GTA-ATG

_\л ^н

_"'а

О

GTC-TGG-ATG-TAA-TGX

о4- і-

ON4 ON5

XCA-TTA-CAT-CCA-GAC XTC-TGG-ATG-TAA-TGG

O-R

О"/ V"N.H /=\

Для очистки олигонуклеотидов использовался как денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле, так и ВЭЖХ. Во втором случае 5'-концевая диметокситритильная группа по окончании ОНС не снималась, благодаря чему время удерживания целевого олигонуклеотида на колонке с обращенной фазой существенно увеличивалось по сравнению с нетритилированными укороченными олигонуклеотидами, образующимися на промежуточных стадиях синтеза.

Оказалось, что нетритилированные олигонуклеотиды ON1-ON3, модифицированные реагентом 5 по 5'-концу, неустойчивы в условиях аммонолиза (используемого для удаления защитных групп с синтезированного олигонуклеотида). В смеси, образующейся при аммонолизе олигонуклеотида на подложке, можно обнаружить (помимо укороченных цепей) два продукта, частично разделяющихся электрофорезом. Согласно MALDI-TOF, один из них представляет собой целевой олигонуклеотид ONI, а второй — соответствующий незамещенный амид. Очевидно, к потере остатка пропаргиламина приводит процесс, включающий в себя образование 2-гидрокси-у-бутиролактона (схема 6). Незамещенный амид образуется при раскрытии лактона аммиаком.

но.

НО.

,о

Олигонуклеотид'

Олигонуклеотид'

,о о

Олигонуклеотид''

NH,

Схема 6

В то же время было показано, что диметокситритилированные олигонуклеотиды устойчивы к аммонолизу и могут быть превращены в целевой продукт после очистки ВЭЖХ и снятия защитной группы водной уксусной кислотой.

2. Отработка реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения на модельном азиде

Для отработки условий реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения был синтезирован флуоресцентный азид 27. Выбор структуры модельного азида обусловлен присутствием флуоресцентной группы (позволяющей легко визуально обнаруживать конъюгат на гель-электрофорезе), а также гидрофобностью молекулы (что дает возможность легко детектировать конъюгат на обращенно-фазовой ВЭЖХ).

Реагенты и условия: /,7ре/и-бутоксикарбонилметилентрифенилфосфоран, ЕЮАс, 4 ч, Д; и, Н₂, Pd/C, ЕЮАс, 2 сут; Hi, UAIH4, Et₂0/THF; /v, 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон, PhMe, 100C, 30 мин; v, Ph₃COH, (CF₃C0₂)0, CF₃C0₂H, A, 12 ч; vi, CH₃S0₂C1, Et₃N, CH₂C1₂, 1 ч; NaN₃, DMF, 12 ч.

Схема 7

Исходным соединением в синтезе флуоресцентного азида служил 3-формилперилен 21 (схема 7). Соединение 22 было получено по реакции Виттига. Гидрирование двойной связи в нем привело к частичному восстановлению ароматической системы (соединение 23). Восстановление сложного эфира 23 дает спирт 24. Дегидрирование гексагидропериленового производного 24 оказалось сложной задачей: действие DDQ дает периленовый спирт 26 с выходом лишь 9%, а основной продукт был идентифицирован как ненасыщенный альдегид 25. Ароматизация с помощью тритил-катиона оказалась более удобной, но и тут удалось добиться выхода только 16%. Полученный спирт 26 был переведен в целевой азид посредством мезилирования и последующего нуклеофильного замещения под действием азид-иона.

Реакцию конъюгации проводили в водном DMSO или водном ацетонитриле в присутствии соединений Cu(I), генерируемых in situ действием аскорбат-иона или трис(2-карбоксиэтил)фосфина на Си²⁺. Было показано, что природа восстановителя не влияет на выход конъюгата. Однако, избыток трис(2-карбоксиэтил)фосфина может приводить к восстановлению азидогрупп, поэтому применение аскорбат-иона предпочтительно.

Оказалось, что для успешного протекания конъюгации обязательно проводить ее в инертной атмосфере. Проведение реакции на воздухе отрицательно сказывается на выходах конъюгатов вследствие катализируемого Cu(I) процесса окислительной деградации олигонуклеотидов, сопровождающегося расщеплением их цепей.

Было показано, что реакция одинаково эффективно протекает при значениях рН от 4 до 10. Оптимальная концентрация Cu(I) была найдена равной 500-1000 рМ. С использованием оптимизированных условий был получен ряд модельных конъюгатов (табл. 2). Реакция протекала наполовину за 3 ч при комнатной температуре. Полное превращение заняло 12 ч. При соотношении азида к ацетилену, равном 10:1, по окончании реакции методом ВЭЖХ не детектировалось следов исходного ацетилена. Оценивая эффективность этого процесса, следует отметить, что крайне низкая растворимость модельного азида в реакционной смеси не мешает протеканию реакции.

Таблица 2. Выходы полученных конъюгатов с 3-(3-азидопропил)периленом и результаты MALDI-TOF анализа.

Исходный олигонуклеотид

ON1 ON3 ON4 ON5

Неколичественный выход продукта в модельных реакциях был связан, по-видимому, с окислительной деградацией олигонуклеотидов под действием следов Ог, имеющей большое значение при малом масштабе реакции (4 нмоль олигонуклеотида). Было показано, что выход конъюгатов можно увеличить до практически количественного посредством использования лиганда ТВТА, стабилизирующего медь в степени окисления +1 и препятствующего таким образом каталитической окислительной деградации.

ТВТА

Для синтеза флуоресцентных олигонуклеотидных конъюгатов посредством реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения нами были предприняты синтезы азидопроизводных некоторых флуоресцентных красителей.

3. Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-д и полярного циклоприсоединения

Из смеси изомеров карбоксифлуоресцеина 28 были получены изомерно чистые азидопроизводные 5-карбоксифлуоресцеина 31 и 6-карбоксифлуоресцеина 32 (схема 8).

Реагенты и условия: /, Chc₂0, DMF, 72 ч; PfpOH, DCC, EtOAc, 0C -» it, 14 ч; разделение изомеров; ii, 3-азидопропиламин, THF; NH3

Схема 8

Разветвленные наноструктуры, полученные из модифицированной ДНК

Пространственная структура сочленений изучалась различными физико-химическими методами [28], в том числе FRET [29]. В соответствии с полученными данными, двухспиральные домены ДНК в 4-х-олигонуклеотидном сочленении располагаются так, что их оси не компланарны и располагаются под углом порядка 60 друг к другу; при этом теоретически возможны две различные конформации точки разветвления (рис. 4). В первой из них — антипараллельной (рис. 4а) — цепи ДНК не проходят через центр точки разветвления, в то время как во второй - параллельной (рис. 46) — две цепи пересекаются в нем. Оказалось, что для обычных 4-х-олигонуклеотидных сочленений более предпочтительна антипараллельная конформация. Предположение о том, что это связано с несколько большим электростатическим отталкиванием остатков ДНК в параллельной конформации было опровергнуто синтезом так называемых bowtie-сочленений, содержащих необычные олигонуклеотиды с З -З и 5 -5 -связями [30] (рис. 5). В то время как двухспиральные участки таких сочленений идентичны аналогичным участкам сочленений Холлидея, структура точки ветвления в них отлична.

С помощью экспериментов по изменению электрофоретической подвижности наноструктур при удалении частей двухспиральных доменов посредством рестриктаз было показано, что bowtie-сочленения существуют в параллельной конформации. Таким образом, на предпочтительность одной из конформации сочленения природа точки ветвления оказывает большее влияние, чем электростатическое отталкивание. Этот результат согласуется с предположением о том, что в процессе генетической рекомбинации сочленения Холлидея должны иметь параллельную конформацию, в которой гомологичные участки ДНК располагаются ближе друг к другу. Вероятно, в клетке происходит специфическое изменение свойств точки разветвления; при этом отсутствует необходимость изменения электростатических свойств огромных спиральных доменов.

Для определения жесткости сочленений Холлидея были предприняты эксперименты по олигомеризации сочленений с комплементарными «липкими концами» [23, 31]. Предполагалось, что в случае жесткой фиксации двухспиральных доменов ДНК под определенными углами должны образовываться только определенные циклические олигомеры, состав которых определялся бы размерностью исходного сочленения. Однако, во всех случаях образовывались смеси олигомеров (от димеров до декамеров). Очевидно, это свидетельствует о некоторой вариабельности углов сочленений, образуемых ДНК-спиралями.

Наноструктуры, точками ветвления в которых являются только одиночные сочленения, известны (например, получаемые с высоким выходом и практически монодисперсные ДНК-дендримеры [32]); однако, недостаточная жесткость сочленений как точек разветвления часто является препятствием для синтеза наноструктур, в особенности периодических. Так, невозможность создания регулярной двумерной сетки из 4-х-олигонуклеотидного сочленения с «липкими концами» объясняется, по-видимому, гибкостью такого сочленения. В качестве более жестких строительных блоков для двумерных периодических ДНК-сеток Симэн и сотр. использовали необычные ДНК-структуры, содержащие несколько сочленений и названные ими кроссоверами [33, 34]. Было показано, что в экспериментах по циклизации кроссоверы являются более жесткими, чем состоящие из трех сочленений треугольные структуры [35]. Образование кроссоверов можно представить как «взаимный обмен» двух ДНК-дуплексов фрагментами цепей. Впоследствии эта методология дизайна была обобщена авторами для создания других, более сложных мотивов для нанотехнологии [36,37].

Двойные кроссоверы (рис. 6) содержат в себе четыре цепи ДНК, соединенные сочленениями; различают параллельные (DPE, DPOW, DPON и антипараллельные (DAE, DAO, DAE+J) двойные кроссоверы. Вследствие налагаемых на структуру параллельных двойных кроссоверов топологических ограничений, точки «перехлеста» параллельных ДНК-цепей в них могут быть разделены только целым числом полуоборотов двойной спирали. В зависимости от того, четным или нечетным является это число, меняется структура двойных кроссоверов. DPE и DAE содержат четное число полуоборотов между перехлестами; DPOW, DPON и DAO - нечетное. Различие между DPOW и DPON заключается в том, попадает ли дополнительный нечетный полувиток на большую или малую бороздку двойной спирали.

Антипараллельные двойные кроссоверы более устойчивы, чем параллельные, вследствие чего они предпочтительны для построения наноструктур. Антипараллельные кроссоверы могут быть также использованы для введения в структуру точек ветвления (рис. 6, DAE+J). Наличие дополнительной точки ветвления практически не сказывается на жесткости и стабильности структуры. Известны и кроссоверы, содержащие большее количество «перехлестов» цепей, таких как тройные кроссоверы [37] и паранемные кроссоверы [38,39].

Разветвленные наноструктуры, полученные модификацией ДНК

Использование разветвляющих реагентов для автоматизированного ДНК-синтеза представляет собой альтернативный метод введения точек ветвления в синтетические олигонуклеотиды (схема 1). В отличие от олигонуклеотидных сочленений, синтезированные при помощи разветвляющих реагентов олигонуклеотиды стабильны в денатурирующих условиях, что в ряде случаев может оказаться желательным. С помощью разветвляющих реагентов было достигнуто раздваивание (например, реагенты 1а, 16 [83]) и растраивание (реагент 2 [84]) растущей цепи олигонуклеотида. Реагент 2 применялся и для синтеза олигонуклеотидных дендримеров; пять последовательных конденсаций 2 приводят к 240-кратному увеличению числа гидроксильных групп на твердофазной подложке при введении спейсерных последовательностей из 5-10 оснований между конденсациями. Посредством реагента 3 были получены самокомплементарные «изогнутые» олигонуклеотидные конъюгаты, которые самособирались в циклические наноструктуры, состоящие главным образом из 2—7 мономерных единиц [85].

Гибридизация двух олигонуклеотидов, синтезированных с использованием аналогичного реагента 4 и имеющих комплементарные 5 -концевые цепи, приводит к образованию структур, названных авторами «наноацетиленом» и «наноциклобутадиеном» [86]. Названия структур отражают их аналогию со скелетами соответствующих органических молекул; каждый двухспиральный домен ДНК рассматривается как углерод-углеродная связь, а каждая точка ветвления - как атом углерода. Наличие трех «связей» в «наноацетилене» подтверждено обработкой наноструктур нуклеазой, специфично расщепляющей одноцепочечную ДНК; показано, что «наноацетилен» содержит только двухцепочечные ДНК-фрагменты.

При помощи реагентов 1а и 1в были синтезированы разветвленные олигонуклеотидные структуры, в том числе Н-образные, содержащие четыре попарно одинаковые последовательности, и структуры, меченные биотином. Строение разветвленных олигонуклеотидов подтверждалось, в том числе, электронной микроскопией продуктов их гибридизации с комплементарными последовательностями, конъюгированными с частицами коллоидного золота [87].

Основным препятствием для использования аналогов реагентов 1—3 в нанотехнологии является невозможность синтеза с их помощью разветвленных олигонуклеотидов, содержащих различные цепи. Для устранения этого недостатка были синтезированы разветвляющие реагенты, содержащие ортогональные защитные группы [88]. Следует отметить, что снятие нестандартных защитных групп не может быть произведено непосредственно в автоматизированном синтезаторе.

Реагент 5 позволяет синтезировать разветвленные олигонуклеотиды с различными цепями без использования нестандартных защитных групп [89]. Разница в реакционной способности первичной и третичной ОН-групп позволяет вначале синтезировать последовательность от 5 -гидроксила разветвляющего реагента (при уменьшенной в два раза концентрации фосфорамидитных реагентов), а затем — 2 -последовательность. Конденсация первого фосфорамидита по третичной ОН-группе требует увеличения его концентрации в три раза при одновременном увеличении времени конденсации до 12 мин. Путем двухкратного использования разветвляющего реагента были синтезированы Н-образные олигонуклеотиды с четырьмя концами, имеющими различные последовательности.

С помощью реагента 6 [90] были получены разветвленные ДНК-структуры, состоящие из трех цепей, имеющих произвольные последовательности. Из этих разветвленных структур были получены наноструктуры - аналоги бензола и нафталина [91], а также флуоресцентный рН-индикатор, основанный на обратимом образовании триплексной структуры [92].

Постсинтетическая конъюгация отдельных олигонуклеотидных цепей представляет собой наиболее гибкий подход к синтезу разветвленных ДНК-структур. С его помощью принципиально возможно получение разветвленных структур, содержащих любое число цепей произвольной последовательности, соединенных в любом желаемом порядке. Для проведения конъюгации необходимо, чтобы исходные олигонуклеотиды содержали функциональные группы, способные к специфическому образованию ковалентной связи и инертные по отношению к реагентам синтетического цикла ОНС; введение функциональных групп достигается использованием модифицирующих реагентов. Число работ, посвященных синтезу наноструктур путем постсинтетической конъюгации к настоящему моменту ограничено высокой стоимостью модифицированных олигонуклеотидов и малой коммерческой доступностью амидофосфитных реагентов с подходящими функциональными группами; большинство работ по конъюгации выполнено на основе продажных амино-модифицирующих реагентов. В работе [93] описывается синтез конъюгата 7 посредством реакции гидразид-модифицированных олигонуклеотидов с 1,3,5-триформилбензолом. Исключительно несимметричное замещение в полученном аддукте определяется использованием матрицы 8. Олигонуклеотидные цепи матрицы образуют частично комплементарные пары с исходными гидразид-модифицированными олигонуклеотидами, что приводит к катализу конъюгации, приводящей к продукту 7. В отсутствие матрицы 8 образования конъюгатов с тремя цепями не происходит.

Синтез флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов по реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения

Олигонуклеотидные конъюгаты бисимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты (БПТК) представляют большой интерес с точки зрения их флуоресцентных свойств и способности к образованию триплексных ДНК-структур. Кроме того, производные БПТК проявляют интересные полупроводниковые свойства в органических полевых транзисторах и имеют перспективы использования в молекулярной электронике.

Существенной сложностью для получения таких конъюгатов является крайне низкая растворимость производных БПТК. Мы решили использовать реакцию [3+2]- диполярного циклоприсоединения, хорошо зарекомендовавшую себя в синтезе конъюгатов малорастворимого азида 27, для получения аддуктов с БПТК.

Синтез исходного диазида 57 показан на схеме 12. Диол 55 оказался недостаточно растворимым для характеризации посредством ЯМР; с целью характеризации он был переведен в описанный ранее силиловый эфир 56. Попытки синтезировать диазид 57 с помощью мезилирования или тозилирования диола 55 и последующего нуклеофильного замещения в соответствующем сульфонате под действием азид-иона были неудачными, по-видимому, из-за низкой растворимости диола 55. В результате, азид 57 был с высоким выходом синтезирован по реакции Мицунобу с использованием дифенилфосфорилазида в качестве донора азидогруппы. Растворимость азида 57 в DMSO при 90С составляет всего около 10"5 М; растворимость его в водно-органических фазах еще ниже. Тем не менее, с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения в 70% водном DMSO удалось достичь приемлемых (40-50%) выходов диаддуктов (табл. 3). Примечательно, что, изменяя соотношение азида и ацетиленового олигонуклеотида, с помощью реакции циклоприсоединения можно получать как моно-, так и диаддукты. Структуры аддуктов были подтверждены данными масс-спектров MALDIOF (данные не приведены).

Интересно отметить, что в случае аддукта A3D, содержащего 3 -терминальную модификацию, в процессе реакции происходило гидролитическое расщепление одной из фосфодиэфирных связей диаддукта, сопровождавшееся образованием моноаддукта аномальной структуры и олигонуклеотидфосфата (схема 13). Продукты реакции были выделены с помощью гель-электрофореза и идентифицированы методом MALDIOF. Такой процесс гидролиза фосфодиэфирной связи не является типичным и особенно удивителен в свете стабильности как исходного олигонуклеотида ON3, так и образующегося аномального моноаддукта АЗМ. По-видимому, этот процесс связан с участием функциональных групп второй олигонуклеотидной цепи и является следствием особенностей вторичной структуры диконъюгата A3D.

Высокая эффективность реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения, а также устойчивость исходных азидов и ацетиленов в условиях реакции позволили получить олигонуклеотидные триконъюгаты. Для конъюгации по схеме 14 были синтезированы симметричные триазиды.

В качестве исходного нами было выбрано доступное соединение - розоловая кислота 58. Ее восстановление боргидридом натрия привело к образованию Cjv-симметричного производного трифенилметана, которое через трифлат 60 и реакцию Соногаширы с гомопропаргиловым спиртом было переведено в триол 61. Из соединения 61 гидрированием был синтезирован восстановленный триол 62. Из триолов 61 и 62 действием карбонилдиимидазола были получены триимидазолиды, которые, без выделения, действием 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламина переводились в карбаматные азидопроизводные 63 и 64. Эти производные имеют сходную структуру, но несколько различную жесткость линкеров. При этом линкеры имеют достаточно большую длину и гидрофильность, что способствует протеканию [3+2]-диполярного циклоприсоединения с ацетиленовыми олигонуклеотидами сразу по трем азидогруппам.

Реагенты и условия: /, NaBHi, EtOH, АсОН; ii, Tf20, Ру, 0C- rt, 12 ч; Ш, бутин-4-ол, Et3N, Pd(PPh3)4, Cul, DMF, 12 ч; /v, H2, 10% Pd/C, MeOH, 12 ч; v, ЛдУ-карбонилдиимидазол, СН2С12, 5 ч; 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламин, 12 ч.

Реакцию конъюгации проводили в отработанных на соединениях перилена условиях. Содержание DMSO в реакционной смеси, благодаря относительной гидрофильности исходных азидов, стало возможным снизить до 20%. Продукт конъюгации выделяли гель-электрофорезом или ВЭЖХ. Типичная электрофореграмма продуктов реакции показана на рис. 36.

Синтез олигонуклеотидных триконьюгатов и сборка наноструктур на их основе

Трис(4-гидроксибутилфенил)метан (62). Трис(4-гидроксибутин-2-илфенил)метан (348 мг, 0.78 ммоль) растворяли в МеОН (15 мл) и добавляли 10% Pd/C (192 мг). Смесь выдерживали в течение 12 ч при перемешивании в атмосфере водорода. Затем реакционную смесь фильтровали через фильтр из стекловолокна, фильтрат упаривали, остаток хроматографировали на силикагеле в системе 30% Ме2СО в PhMe. Выход 251 мг (70%). Вязкое бесцветное масло, впоследствие застывшее в кристаллическую массу. Rf 0.40 (Me2CO-PhMe 1:1). ЯМР !Н (DMSO-sfc): 1.42 (м, 6Н), 1.56 (м, 6Н) (АгСН2СН2СН2), 2.53 (т, 6Н, J= 7.4, АгСЯ2), 3.39 (кв., 6Н, J= 5.2, С#2ОН), 4.33 (т, ЗН, J= 5.2, ОН), 5.45 (ушир, с, 1Н, АгзСЯ), 6.99 (д, 6Н, J = 8.0, Н-2,6), 7.10 (д, 6Н, J= 8.0, Н-3,5). ЯМР 13С (DMSO-rf ): 27.39 (ЗС), 32.14 (ЗС), 34.53 (ЗС), 54.88 (Аг3СН), 60.51 (ЗС), 128.14 (6С), 128.78 (6С), 140.01 (ЗС), 141.38 (ЗС). (63). Трис(4-гидроксибутин-2-илфенил)метан (246 мг, 0.55 ммоль) растворяли в СН2С12 (10 мл) под аргоном, добавляли ЛуУ-карбонилдиимидазол (384 мг, 2.37 ммоль), и выдерживали 4 ч при перемешивании. Затем добавляли 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламин (600 мг, 3.4 ммоль), реакционную смесь выдерживали в течение 12 ч. Смесь упаривали, хроматографировали на силикагеле в системе 40% Ме2СО в PhMe. Выход 406 мг (70%). Желтоватое вязкое масло. Rf= 0.64 (Me2CO-PhMe 1:1). ЯМР Н (DMSO-c/б): 2.70 (т, 6Н, J= 6.4), 3.13 (кв, 6Н, ./= 5.8, C#2NH), 3.44-3.34 (м, ЮН), 3.63-3.46 (м, 20Н), 4.09 (т, 6Н, ./= 6.4), 5.66 (ушир, с, 1Н, Аг3СЯ), 7.05 (д, 6Н, J- 8.0, Н-2,6), 7.19 (т, ЗН, J= 5.4, N#), 7.10 (д, 6Н, У = 8.2, Н-3,5). ЯМР 13С (DMSO-fik): 19.77 (ЗС), 49.97 (ЗС), 54.82 (АгзСН), 69.07 (ЗС), 69.21 (ЗС), 69.53 (ЗС), 69.60 (ЗС), 69.77 (ЗС), 69.71 (ЗС), 72.34 (ЗС), 81.10 (ЗС), 87.18 (ЗС), 121.07 (ЗС), 129.15 (6С), 131.43 (6С), 143.06 (ЗС), 156.00 (ЗС, СО).

Трис(4-гидроксибутилфенил)метан (246 мг, 0.55 ммоль) растворяли в CH2CI2 (10 мл) под аргоном, добавляли ІУД-карбонилдиимидазол (384 мг, 2.37 ммоль), и выдерживали 4 ч при перемешивании. Затем добавляли 2-(2-(2-азидоэтокси)этокси)этиламин (600 мг, 3.4 ммоль), реакционную смесь выдерживали в течение 12 ч. Смесь упаривали, хроматографировали на силикагеле в системе 50% Ме2СО в PhMe. Выход 222 мг (75%). Желтоватое вязкое масло. Rf= 0.64 (Me2CO-PhMe 1:1). ЯМР JH (DMSO-ufc): 1.55 (м, 12Н), 2.55 (т, 6Н, J= 6.7), 3.11 (кв, 6Н, J= 5.8, СЯ2ЫН), 3.44-3.34 (м, ЮН), 3.62-3.46 (м, 20Н), 3.94 (т, 6Н, J= 5.8), 5.46 (ушир, с, 1Н, Аг3С#), 7.00 (м, 9Н, Ntf, Н-2,6), 7.10 (д, 6Н, J= 8.0, Н-3,5). ЯМР I3C (DMSO-cfc): 27.28 (ЗС), 28.35 (ЗС), 34.27 (ЗС), 49.97 (ЗС), 54.86 (Аг3СН), 60.20 (ЗС), 63.44 (ЗС), 69.15 (ЗС), 69.22 (ЗС), 69.53 (ЗС), 69.60 (ЗС), 69.70 (ЗС), 69.76 (ЗС), 72.34 (ЗС), 128.14 (6С), 128.83 (6С), 139.70 (ЗС), 141.46 (ЗС), 156.34 (ЗС, СО).

Олигонуклеотидный синтез проводили в автоматическом режиме с использованием стандартных амидофосфитов (dA z, dT, dC z, dG u) по протоколам изготовителя прибора. Конденсацию терминального амидофосфита 7 осуществляли в течение 1 мин (стадии кэпирования и удаления диметокситритильной группы опускали). Отщепление олигонуклеотида от носителя и деблокирование осуществляли концентрированным (28%) аммиаком (0.75 мл). После деблокирования полученный раствор упаривали, остаток растворяли в воде (150 мкл) и олигонуклеотид осаждали 0.5М ІЛСЮ4 в ацетоне (1.5 мл), центрифугировали, промывали ацетоном (1 мл), растворяли в 200 мкл 50%-ного водного формамида и очищали при помощи электрофореза в 20% денатурирующем (7 М мочевина) полиакриламидном геле (400В, 20мА, контроль по бромфеноловому синему и ксиленцианолу). Олигонуклеотиды визуализировали в геле по поглощению, элюировали 0.5М LiC104 в течение 12 ч, фильтровали от геля и обессоливали на колонках с Sephadex G-50. Концентрацию олигонуклеотида определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение на 260 нм. При регистрации масс-спектров олигонуклеотидов в качестве матрицы для ионизации использовали смесь растворов 2,6-дигидроксиацетофенона (40 мг в 1 мл метанола) и двузамещенный цитрат аммония (80 мг в 1 мл воды) 1:1 по объему, которую готовили непосредственно перед каждым измерением.

Общая методика проведения конъюгации. В одноразовой пластиковой пробирке емкостью 1.5 мл смешивали DMSO (15 мкл), водный ацетат триэтиламмония (0.2 М, рН 7, 32 мкл), раствор азида в DMSO (около 20 мкл, в зависимости от концентрации) и водный раствор пентагидрата сульфата меди (II) (7.94 мМ, 12.6 мкл). Раствор дегазировали путем пропускания через него аргона в течение 30 с, после чего добавляли водный раствор аскорбиновой кислоты (12.5 мМ, 8.0 мкл) и раствор исходного олигонуклеотида (0.1 мМ, 20 мкл). Пробирку продували еще раз аргоном, закрывали и выдерживали при комнатной температуре в течение суток, после чего осаждали олигонуклеотид ацетоном (1.4 мл) и центрифугировали. Осадок растворяли в 15 мкл 50%-ного водного формамида и очищали при помощи ВЭЖХ либо посредством электрофореза в 20% денатурирующем (7 М мочевина) полиакриламидном геле (550В, 15мА, контроль по бромфеноловому синему и ксиленцианолу). Олигонуклеотиды визуализировали в геле по флуоресценции, элюировали 0.5М ІЛСІО4 в течение 12 ч, фильтровали от геля и обессоливали на колонках с Sephadex G-50.

Общая методика синтеза ДНК-наноструктур. В пластиковой пробирке объемом 100 мкл готовили 6 мкл водного раствора, содержащего каждый конъюгат в концентрации 0.1 шМ. Раствор нагревали на водяной бане (имеющей температуру 95С), после чего охлаждали на воздухе. Полученные конъюгаты анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.

Анализ ДНК-наноструктур методом АСМ. В пластиковой пробирке объемом 100 мкл готовили 6 мкл водного раствора, содержащего каждый конъюгат в концентрации 0.1 тМ и 10 тМ MgCb. Раствор нагревали на водяной бане (имеющей температуру 95С), после чего охлаждали на воздухе. Раствор наносили на свежерасколотую атомарно-гладкую слюду и выдерживали в течение 5 мин. Каплю раствора сдували аргоном, подложку промывали этанолом, сушили в токе аргона и анализировали на приборе Veeco Nanoscope III.

Похожие диссертации на Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур

Синтез фрагментарных поли-(гликозилфосфатов) с помощью водородфосфонатного методаИванова, Ирина Анатольевна

Синтез фрагментов поли (гликозилфосфатов) с помощью водородфосфонатного методаИванова, Ирина Анатольевна

Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6Нестерчук Михаил Васильевич

Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3'-концевого процессингаАгапкина Юлия Юрьевна

Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга Агапкина Юлия Юрьевна

СИНТЕЗ НОВЫХ ЛЮМИНОФОРОВ С ПОМОЩЬЮ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ 3-ЙОД-7-АМИНОКУМАРИНОВГордеева, Наталья Александровна

Синтез полициклических азотсодержащих гетеросистем на основе реакций [3+2]-циклоприсоединения нитробензоазолов с азометинилидамиПеченкин, Сергей Юрьевич

Реакции [3+2]циклоприсоединения C,N-дизамещенных нитрилиминов к гетероциклическим соединениям, содержащим экзоциклические C=S и C=N связиБударина Екатерина Викторовна

Влияние высокого внешнего давления на скорость и равновесие реакций [4+2]- и [3+2]-циклоприсоединенияШихаб Махди Салих

Реакции [6+2]- и [6+4]-циклоприсоединения с участием 1,3,5-циклогептатриена, катализируемые соединениями переходных металловКадикова, Гульнара Назифовна