Содержание к диссертации
Введение
I. Структура и функции интегразы вич-1 (обзор литературы) 10
1.1. Строение интегразы ВИЧ-1 12
1.1.1. Строение каталитического домена 13
1.1.2. Строение N-концевого домена 17
1.1.3. Строение С-концевого домена 20
1.1.4. Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы 22
1.1.5. Мультимерная организация интегразы 25
1.2. Функционирование интегразы вич-1 28
1.2.1. Реакции, катализируемые интегразой 28
1.2.2. Связывание ДНК интегразой 32
1.2.3. Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК 34
1.2.4. Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК 35
1.2.5. Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК 40
1.2.5.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата на каталитическую активность интегразы 40
1.2.5.2. Моделирование предпочтительной нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата 44 1.2.6. Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК 46
1.3. Моделирование структуры полноразмерного фермента и его комплекса с ДНК 49
ii. Интеграза вич-1: влияние структуры днк-субстрата на активность в реакции з -концевого процессинга
(Результаты и обсуждение) 53
II.1. Дизайн модифицированных аналогов ш-субстрата интегразы ВИЧ-1 54
П.2. Термическая устойчивость модифицированных аналогов ш-субстрата интегразы вич-1 59
113. Особенности выделения используемой в работе интегразы 61
Связывание интегразы с различными днк-дуплексами 62
II.4.1. Изучение связывания интегразы с ДНК методом торможения в геле 63
Н.4.2. Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции 68
И.4.3. Изучение связывания интегразы с ДНК методом фотоаффинной модификации 73
II.5. Влияние модификаций ш-субстрата на специфическую активность интегразы 78
П.5.1. Модификации нуклеозидов
в 3-ем положении Ш-субстрата 82 И.5.2. Модификации нуклеозидов
в 5-ом и 6-ом положениях Ш-субстрата 86
Н.5.3. Модификации нуклеозидов
в 7-ом и 8-ом положениях Ш-субстрата 89
Н.5.4. Модификации нуклеозидов
в 9-ом положении Ш-субстрата 94
Н.5.5. Модификации нуклеозидов
в 12-ом положении Ш-субстрата 96
П.6. Влияние Дестабилизации Днк В Районе Расщепляемой Связи На Активность Интегразы 97
П.6.1. Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями 98
П.6.1.1. Синтез субстрата интегразы
с ковалентно связанными цепями 98
П.6.1.2. Реакция 3 -концевого процессинга субстрата
с ковалентно связанными цепями 103
П.6.2. Процессинг субстратов, в которых консервативный динуклеотид
СА расположен во внутренней части дуплекса 105
П.7. Изучение контактов аденина в третьем положении процессируемой цепи ш-субстрата с интегразой 107
ІІ.8. Модель взаимодействия интегразы вич-1 с днк-субстратом 111
Экспериментальная часть 114
Ш.1. Реактивы и материалы 114 Ш.2. Методы 118
III.2.1. Изучение связывания интегразы ВИЧ-1 с ДНК-дуплексами 120
Ш.2.2. Изучение влияния модификаций Ш-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1 123
Щ.2.3. Синтез дуплексов с ковалентно связанными цепями 124
Выводы 125
Литература
- Строение каталитического домена
- Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК
- Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции
- Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями
Введение к работе
Вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), относящийся к классу ретровирусов, поражает иммунную систему организма человека и вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) [1]. Для лечения этого опасного заболевания в настоящее время применяется комплексная терапия, основанная на использовании ингибиторов двух ферментов ВИЧ-1: обратной транскриптазы и протеазы [2]. Однако эта терапия не приводит к полной остановке репликации вируса, а позволяет лишь подавлять ее до низкого уровня, продлевая жизнь ВИЧ-инфицированным пациентам [3, 4]. В связи с этим внимание ученых сосредоточено на поиске новых мишеней и новых ингибиторов репликации вируса. Одной из самых привлекательных и актуальных мишеней на сегодняшний день является третий вирусный фермент - интеграза (ИН). Она катализирует одну из ранних стадий репликативного цикла ВИЧ - встраивание вирусной ДНК в клеточную [5]. Понятно, что подавление этого ключевого для развития вируса процесса должно необратимо привести к полной остановке репликации ВИЧ. Важно, что ИН не участвует в процессах, необходимых для жизнедеятельности самой клетки, поэтому её ингибирование является одним из наиболее перспективных приемов селективного подавления репликации на раннем этапе развития вирусной инфекции.
Однако создание эффективных ингибиторов ИН во многом тормозится из-за того, что ИН является наименее изученным ферментом ВИЧ-1. Известно, что она узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3'-концов каждой цепи. Это - первая стадия интеграции, она называется 3'-концевой процессинг [6]. Далее ИН осуществляет перенос цепи - встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК. Однако детальный механизм, по которому ИН взаимодействует с вирусной и с клеточной ДНК, не известен. До настоящего времени не известна полная структура ни всего фермента, ни его комплекса с ДНК-субстратом, поскольку не удается закристаллизовать полноразмерный каталитически активный белок и сделать его рентгеноструктурный анализ или ЯМР. Понятно, что выяснение механизма узнавания вирусной ДНК интегразой и дальнейшей ее интеграции в клеточную ДНК позволит более системно и рационально подойти к созданию ингибиторов этого фермента.
В настоящее время для изучения взаимодействий ИН с ДНК in vitro используется рекомбинантный фермент и модифицированные аналоги вирусной ДНК. Необходимо отметить, что ИН активна только в присутствии кофактора - иона двухвалентного металла. Природным кофактором является Mg2+, in vitro чаще используется ион Мп , поскольку в его присутствии активность ИН выше. Однако в последнее время установлено, что субстратная специфичность ИН и ее ингибирование различными соединениями зависят от природы используемого кофактора. Так ряд ингибиторов ИН, активных in vitro в присутствии Мп2+, не ингибируют этот фермент в присутствии ионов Mg2+ и, следовательно, оказываются неактивными в экспериментах на клеточных культурах [7, 8].
В связи с этим в настоящей работе взаимодействие ИН с ДНК изучалось в присутствии обоих кофакторов: и Мп2+, и Mg2+. Целью нашей работы было изучить влияние структуры вирусной ДНК на специфичность ее взаимодействия с ИН ВИЧ-1 и выявить те структурные элементы, которые определяют эту специфичность. Для этого использовались ДНК-дуплексы, последовательность которых соответствовала последовательности сайта узнавания ИН в Ш-участке длинного концевого повтора ДНК ВИЧ-1. Природные нуклеозиды в определенных положениях дуплекса заменяли на ненуклеозидные вставки (остатки 1,3-пропандиола) или 2'-аминонуклеозиды и изучали связывание модифицированных дуплексов с ИН и их 3'-концевой процессинг. Оказалось, что введение модификаций в структуру субстрата ИН не влияет на его связывание ферментом, но оказывает очень сильное воздействие на скорость 3'-концевого процессинга.
На основании полученных результатов предложена модель взаимодействия ИН с вирусной ДНК. В соответствии с этой моделью, основной вклад вносят контакты ИН с углеводофосфатным остовом первых девяти нуклеотидов ДНК-субстрата, а специфичность взаимодействия, в первую очередь, определяется наличием в структуре ДНК последовательности 5'-СА -3' в 3-ем и 4-ом положениях от З'-конца процессируемой цепи, причем со стороны аденина из этой последовательности с ИН взаимодействуют Ш-атом и экзоциклическая аминогруппа. Также предполагается, что с положениями 3-6 в составе субстрата взаимодействует каталитический домен ИН, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен фермента. Впервые обнаружено, что в положениях субстрата с 5-ого по 8-ое ИН взаимодействует с непроцессируемой цепью субстрата в большей мере, чем с процессируемой. Помимо этого установлено, что модификации субстрата с
положениях с 3-его по 6-ое оказывают значительно более сильное влияние на активность ИН в присутствии ионов Mg2+, чем Мп2+.
Введение 2'-аминонуклеозидов в терминальные положения U5-субстрата позволило нам получить аналог вирусной ДНК с ковалентно связанными на конце цепями. С использованием такого дуплекса показано, что «расплетание» цепей вирусной ДНК не является необходимым условием З'-процессинга. В то же время, для эффективного З'-процессинга ДНК-субстрата необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой связью.
Работа включает обзор литературы, посвященный строению и функциям интегразы ВИЧ-1.
Строение каталитического домена
Авторы показали, что в растворе N-концевой домен ИН образует димер. При этом мономеры, входящие в состав димера, могут находиться в двух структурно -различных формах, Е и D, способных переходить друг в друга. Каждый мономер состоит из четырех а-спиралей. Спирали 2, 3 и 4 идентичны для обеих форм и включают аминокислотные остатки 19-25, 30-39 и 41-45, соответственно. Различия в строении двух форм мономера связаны со структурной организацией а 1-спирали. Так в Е-форме ее образуют аминокислотные остатки со 2 по 14, тогда как в D-форме - со 2 по 8. Кроме того, четыре аминокислотных остатка (с 14 по 17), которые в случае Е-формы входят в состав петли, соединяющей al и а2-спирали, в случае D-формы образуют спиральный поворот.
Нижняя часть каждой субъединицы стабилизирована гидрофобным кором, который образуется при участии al, a2 и аЗ-спиралей, посредством гидрофобных взаимодействий между Пе5 и А1а8 a 1-спирали, Met22 а2-спирали, Phe26 и Leu28, расположенными в петле между а2 и аЗ-спиралями, Val32 и ПеЗб аЗ-спирали. Структура верхней части мономера стабилизирована участием His 12, His 16, Cys40 и Cys43 в координации иона цинка. Расположение иона цинка и цистеиновых аминокислотных остатков идентично для обеих форм, а положение His 12 и His 16 различно. Кроме того, в разных формах мономера в координации иона цинка принимают участие различные атомы азота имидазольного кольца. В случае Е-формы His 12 расположен в а 1-спирали, и в связывании цинка участвует є-атом азота имидазольного кольца (Рис. 7). В D-форме His 12 находится в петле, соединяющей al и а2-спирали, и для координации Zn2+ используется 8-атом азота имидазольного кольца. И в той, и в другой форме 5-атомы азота имидазольного кольца His 16 принимают участие в координации иона Zn , при этом в Е-форме His 16 расположен в петле между al и а2-спиралями, а в D-форме он находится в спиральном повороте.
Е-форма мономера N-концевого домена существует предпочтительно при низких температурах. При этих условиях аминокислотные остатки с 9 по 14 также участвуют в образовании а-спирали, т.е. данный участок более структурирован, а в координации иона Zn2+ участвует менее предпочтительная таутомерная форма имидазольного кольца. При этом водород у 5-атома азота образует дополнительную водородную связь с атомом серы Met22. При повышении температуры часть al-спирали плавится, имидазольное кольцо принимает обычную для себя таутомерную форму, Zn2+ координирует 5-атом азота, Е-форма мономера переходит в D-форму.
Формирование димера происходит за счет образования межмолекулярных связей между ос-спиралями 1, 3 и 4. Отмечено формирование лишь гомодимеров, т.е. димеров, состоящих из мономеров либо в Е-форме, либо в D-форме. Две субъединицы, входящие в состав димера, располагаются почти параллельно друг относительно друга. Все межсубъединичные связи между al и аЗ-спиралями имеют гидрофобную природу. Phel (a 1-спираль) одной субъединицы взаимодействует с РЬеГ (al-спираль), Рго29 и Val32 (аЗ-спираль) другой субъединицы; Leu2 (al-спираль) с Рго29 , РгоЗО и УаІЗГ (аЗ-спираль); Пе5 (al-спираль) с УаІЗГ. Надо отметить, что аЗ-спирали двух субъединиц ориентированы друг относительно друга под углом 60. Их взаимное пространственное расположение стабилизировано гидрофобными взаимодействиями между Val31, Val32 и А1а38, а также, возможно, за счет образования солевого мостика между Glu35 одной субъединицы и Lys34 другой. В то же время, а4-спирали двух мономеров располагаются под углом 110, при этом Leu45 и Leu45 находятся друг напротив друга, кроме того, возможно образование водородной связи между амидными группами боковых цепей Gln44 и Gln44\
Важно отметить структурное сходство N-концевого домена ИН ВИЧ-1 с некоторыми ДНК-связывающими доменами, такими как репрессор триптофанового оперона, содержащими так называемый фрагмент спираль-поворот-спираль [37]. Однако в то время как вторая спираль в подобных белках отвечает за узнавание ДНК, эквивалентная спираль в N-концевом домене ИН ВИЧ-1 участвует в формировании димера. Поэтому связывание ДНК димерной структурой N-концевого домена невозможно. Более того, распределение заряда на этой спирали неблагоприятно для связывания ДНК. Сходство с мотивом спираль-поворот-спираль ДНК-связывающих доменов некоторых белков может быть случайным и не является основанием для предположения, что N-концевой домен ИН связывает ДНК.
В ряду ретровирусных интеграз С-концевой домен обладает наименьшей консервативностью по сравнению с N-концевым или каталитическим доменами. По результатам работ [19, 35, 38] данному домену приписывают функцию неспецифического связывания ДНК. Показано, что участок С-концевого домена, содержащий с 220 по 270 аминокислотный остаток, способен связывать ДНК с эффективностью полного фермента [38].
Структура ДНК-связывающего домена ИН ВИЧ-1 была определена методом ЯМР-спектроскопии (Рис. 8) [39]. Несмотря на различия в первичной структуре, топологически С-концевой домен ИН имеет много общего со структурой Src homology 3 (SH3) домена. Показано, что в растворе он образует димер. Полипептидная цепь каждого мономера формирует структурный мотив типа /3-барреля. состоящий из пяти антипараллельных /3-цепей (222-229, 232-245, 248-253, 256-262 и 266-270 аминокислотные остатки, соответственно). Кор /3-барреля образуют Val225, Туг227, Ala239, Val249, Пе251, Val260 и А1а265. С-концевой домен ИН. А - структура мономера; В структура димера (PDB код 11HV).
В структуре мономера 02, /33 и /34-цепи образуют антипараллельный /3-лист. Перекрывание /3-листов от двух субъединиц приводит к формированию димернои структуры, в которой мономеры ориентированы антипараллельно. Структура димера стабилизирована гидрофобными контактами между Тгр243 одной субъединицы и Leu242, Val250, Пе257 другой субъединицы: между А1а248 первого мономера и Пе257 второго; между Val250 первого и Val250, Пе257 второго мономера; между Val259 первого мономера и Пе257, Va!259 второго мономера, а также водородной связью между Glu246 одной субъединицы и Gln252 другой.
В результате образования двумя С-концевыми доменами димернои структуры происходит формирование большой седлообразной бороздки, ограниченной петлей, соединяющей 01 и /32 цепи. Размеры бороздки составляют 24 х 23 х 12 А. Она содержит положительно заряженные аминокислотные остатки Arg231, Lys244, Lys258, Arg262, Arg263, Lys264, Lys266, которые, по мнению авторов работы [39], могут участвовать в связывании ДНК. В случае ИН ВИЧ-2, тройная замена Arg262
Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК
В ходе осуществления процесса интеграции ИН должна связать две молекулы ДНК: вирусную и клеточную. Причем, расщепление вирусной ДНК идет строго по определенной последовательности, узнаваемой ИН. Специфичность взаимодействия ИН с вирусной ДНК может проявляться на уровне связывания или на уровне катализа. До сих пор не известно, имеет ли ИН различные или перекрывающиеся сайты связывания вирусной и клеточной ДНК [80, 36, 33, 81, 76, 74] или, возможно, она имеет один сайт связывания ДНК [82, 19], потому что in vitro ИН приблизительно с одинаковой аффинностью связывает ДНК-субстрат и неспецифическую ДНК [67, 83,79]. Каталитический домен ИН ВИЧ-1 играет важную роль в узнавании динуклеотида С А на конце вирусной ДНК [84]. Тем не менее, взаимодействие с вирусной ДНК не ограничивается лишь специфическим узнаванием аминокислотами каталитического домена; важную роль в связывании также играют другие участки ИН [36].
Считается, что ДНК-связывающие свойства ИН обеспечиваются в первую очередь С-концевым доменом [67, 68, 73, 38, 83, 19, 35]. На поверхности С-концевого домена находится полоса положительно заряженных аминокислот, которая может быть платформой для неспецифического связывания ДНК за счет электростатических взаимодействий. Таким образом, за неспецифическое связывание ДНК-мишени может отвечать С-концевой домен. Вместе с тем, существуют данные, полученные из экспериментов с участием химерных интеграз, свидетельствующие о том, что в связывании ДНК-мишени также может участвовать каталитический домен ИН [85, 86].
Как отмечалось в разделе 1.1.2., N-концевой домен ИН содержит характерный ННСС-мотив, напоминающий цинк-связывающий мотив некоторых ДНК-связывающих белков. Однако удаление N-концевого домена ИН не сказывается на её способности связывать ДНК [33]. . Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК
Выше упоминалось, что каталитический и С-концевой домены ИН способны связывать ДНК, однако контакты между ИН и вирусной ДНК или ДНК-мишенью еще определены далеко не полно. Одним из используемых для этого методов является метод фотоиндуцируемых сшивок. В работе [87] определяли остатки лизина, контактирующие с вирусной ДНК. Первоначально с помощью мутаций ИН была выявлена важность пары остатков Lysl56 и Lys 159 для всех трех реакций, катализируемых ИН in vitro. Параллельно, по данным спектров КД и гель-фильтрации, было показано, что мутации по этим остаткам не влияют на вторичную структуру и мультимерное состояние фермента. Для установления контактов использовались Ш-субстраты, содержащие остатки 2 -дезокси-5-иодуридина, которые реагировали с аминокислотами ИН под действием УФ-излучения с длиной волны 302 нм. При этом происходила мягкая активация исключительно 5-иодуридиновых звеньев [87]. Место присоединения определяли протеолизом белка с последующим секвенированием связанного пептида по Эдману. Оказалось, что Lysl59 взаимодействует с 2 -дезокси-5-иодуридином, введенным в четвертую позицию процессируемой цепи, что соответствует консервативному району. Поскольку в структуре двуспиральной ДНК С5-положение пиримидина (урацила) эквивалентно -положению пурина [87], было сделано предположение, что Lysl59 взаимодействует с Ы7-азотом аденозина из консервативного динуклеотида СА. Также предполагается, что аденозин из консервативного динуклеотида СА и соответственно атакуемый при процессинге фосфат расположены около Glu 152 из каталитической триады D,D(35)E.
Позднее также с использованием метода фотоприсоединения была показана возможность взаимодействия Туг143 и Glnl48 с 5 -концевым аденозином непроцессируемой цепи Ш-субстрата, а также пептидов ИН51"64 и ИН247"270 со вторым цитидином непроцессируемой и с седьмым тимидином процессируемой цепей, соответственно [88].
В работе [89] в С-концевом домене фермента 246-ую природную аминокислоту заменяли на остаток цистеина (мутация Е246С). В Ш-дуплекс вместо остатков 2 -дезоксиаденозина вводили показанные на рисунке 12 аналоги нуклеозидов, содержащих в гетероциклических основаниях группы, способные реагировать с Cys. Образование ковалентной связи между Cys246 и модифицированным Ш-субстратом лучше всего происходило в том случае, когда реакционноспособный аналог нуклеозида вводится вместо 7-го аденозина в непроцессируемой цепи. На основании этого результата авторы делают вывод, что в структуре комплекса аминокислотный остаток ИН Glu 246 сближен с аденозином в 7-ом положении непроцессируемой цепи вирусной ДНК.
Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции
Поскольку метод торможения в геле не позволил нам дискриминировать специфический комплекс ИН с субстратом от неспецифического комплекса ИН с мишенью, мы решили использовать другой метод - поляризации флюоресценции. Суть этого метода заключается в следующем. При взаимодействии белка с субстратами, содержащими флюорофор, наблюдается зависимое от времени изменение поляризации флюоресценции, вызванное образованием фермент-субстратного комплекса. Большим достоинством этого метода является то, что он легко позволяет определить скорость связывания ДНК белком. Мы хотели выяснить, различаются ли скорости связывания ДНК-субстрата и ДНК-мишени с ИН, и изучить, изменяются ли скорости связывания модифицированных субстратов по сравнению с немодифицированным.
В нашей работе использовались ДНК-дуплексы, содержащие в качестве флюорофора остаток флюоресцеина. Для оценки скорости связывания аналогов субстрата, содержащих модификации в В-цепи, составлялись дуплексы, в которых А-цепь содержала остаток флюоресцеина на 3 -конце (U5A-fl). Для оценки скорости связывания субстратов с модификациями в А-цепи флюоресцеин присоединяли на 5 -конец процессируемой цепи (U5B-fl). Таким образом, остаток флюоресцеина в обоих случаях был максимально удален от места З -процессинга.
Синтез конъюгата олигонуклеотида U5A с флюоресцеином проводили по схеме, представленной на рисунке 28. При этом олигонуклеотид U5A содержал на 3 -конце алифатическую аминогруппу, присоединенную через линкер к 3 -концевому фосфату. Введение аминолинкера в состав олигонуклеотида осуществляли в процессе автоматического амидофосфитного синтеза, для чего применяли модифицированный полимерный носитель З -Amino-Modifier СЗ CPG.
Таким же способом был синтезирован олигонуклеотид, содержащий амногруппу на 3 -конце, для получения флюоресцентно меченого неспецифического дуплекса ND-fl.
По аналогичной схеме присоединяли флюоресцеин к олигонуклеотиду U5B, содержащему на 5 -конце алифатическую аминогруппу, которая вводилась на заключительной стадии автоматического амидофосфитного синтеза с помощью коммерческого амидофосфита С6-аминолинкера 5 -Amino-Modifier C3FA.
Присоединение флюоресцеина к олигонуклеотидам осуществляли обработкой их водного раствора (рН 11,0) раствором изотиоцианата флюоресцеина в диметилформамиде. При рН 11,0 алифатическая аминогруппа полностью депротонирована, что облегчает ее нуклеофильную атаку по атому углерода в составе изотиоцианатной группировки и повышает выход целевого продукта реакции. Образовавшиеся конъюгаты выделяли и очищали с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях.
Далее нами были получены кривые зависимости изменения поляризации флюоресценции от времени, характеризующие связывание ИН с природным и модифицированными субстратами, а также с дуплексом случайной последовательности ND, содержащим флюоресцеин в одной из цепей. Связывание модифицированных дуплексов сравнивали со связыванием U5 субстрата, содержащего флюоресцеин на З -конце А-цепи (U5B/U5A-fl) или на 5 -конце В-цепи (U5B-fl/U5A) (рис. 29. А, Б). Важно отметить, что ИН образует с ДНК очень устойчивые комплексы, которые не разрушаются после З -процессинга (комплекс ИН/ДНК распадается только после осуществления второй стадии интеграции -перенос цепи) [8]. По этой причине мы могли изучать процесс связывания в тех же условиях, в которых проводили З -процессинг (глава И.5.): рН 7.0, Mg2+, 37С. Иными словами, мы изучали формирование каталитически активного комплекса ИН с Ш-субстратом или его аналогами.
На основании полученных кривых связывания рассчитывали коп, равные произведению константы скорости связывания на концентрацию ИН (табл. 3). Видно, что все дуплексы связываются с ИН, хотя их коп и несколько различаются. Так для немодифицированного субстрата, содержащего флюоресцеин в разных цепях (дуплексы U5B-fl/U5A и U5B/U5A-fl), коп отличаются (0,77 и 1,17 соответственно), а значение коп для дуплекса случайной последовательности ND (1,09) находится между ними. Значения коп для модифицированных субстратов находятся в том же интервале величин. Следовательно, полученные нами различия в коп модифицированных и модифицированных субстратов несущественны и находятся в пределах ошибки эксперимента. Мы не смогли получить значения констант скорости связывания дуплексов с ИН, поскольку нам неизвестна точная концентрация активного фермента и его мультимерное состояние в комплексе с ДНК.
Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями
Необходимость дестабилизации ДНК именно в районе расщепляемой связи подтвержается также результатами, полученными в работе [96]. Показано, что замена третьей пары А/Т на другие комплементарные пары приводила к более чем десятикратному снижению начальной скорости 3 -процессинга в присутствии как ионов Mg , так и Мп [88]. В то же время, замена пары А/Т на некомплементарные пары нуклеозидов в присутствии ионов Мп+ практически не влияла на эффективность процессинга, несмотря на то, что консервативный аденин отсутствовал [96]. Интересно также отметить, что аналог U5-субстрата, содержащий вместо 2 -дезоксиаденозина в 3-й позиции В-цепи апуринизованный остаток нуклеозида (АН), процессировался также эффективно, как немодифицированный субстрат [95]. Этот результат также был получен в присутствии ионов Мп2+.
Таким образом, для эффективного процессинга субстрата ИН важно локальное нарушение его структуры в районе расщепляемой связи, которое в случае вирусной ДНК обеспечивается за счет повышенной конформационной подвижности CA/TG участка.
Вместе с тем, важность последовательности С А для эффективного 3 -процессинга вирусной ДНК нельзя объяснить только изгибом двойной спирали. Как уже отмечалось (раздел 1.4.), предполагается, что Lysl59 из каталитического домена ИН взаимодействует с Ы7-атомом 2 -дезоксиаденозина из этой последовательности [87]. Этот контакт важен для активности ИН, поскольку замена аденина на 7-деазааденин приводит к трехкратному снижению эффективности 3 -процессинга [105]. Кроме того, в нашей работе аналог Ш-субстрата, не содержащий аденина (дуплекс BP3/U5A) и, следовательно, неспособный образовать водородные связи с ИН, вообще не процессировался (раздел П.5.1).
Видимое противоречие наших результатов и данных работы [105], свидетельствующих о важности гетероциклического основания третьего нуклеозида В-цепи, с результатами, приведенными в работах [95, 96], заставило нас более подробно изучить протекание 3 -процессинга в аналогах Ш-субстрата, содержащих
В качестве непроцессируемой цепи во всех случаях использовался олигонуклеотид АРЗ. Скорости З -процессинга дуплексов BG3/AP3, ВТЗ/АРЗ и ВСЗ/АРЗ сравнивались с субстратом U5. Общей чертой всех модифицированных дуплексов является отсутствие комплементарной пары в 3-ем положении субстрата ИН. Мы не анализировали З -процессинг дуплексов, в которых замена нуклеозида в В-цепи сопровождалась заменой соответствующего нуклеозида в А-цепи с сохранением комплементарной пары, поскольку, по данным работы [88], они не процессируются ИН.
Для того чтобы объяснить результаты, полученные в присутствии ионов Мп , мы проанализировали, какие водородные связи может формировать с ИН остаток аденина в структуре Ш-субстрата, и сравнили их с тем, какие водородные связи могут образовывать С, G и Т, а также 7-деазааденин (7-деазаА) и апуринизованный остаток нуклеозида (АН) (Рис. 48). В структуре ДНК аденин, участвующий в образовании комплементарной пары, способен взаимодействовать с ИН со стороны большой бороздки за счет N7 (акцептор протона) и экзоциклической аминогруппы (донор протона). Также возможны контакты со стороны малой бороздки (N3 - донор протона). В случае 7-деазаА контакт с N7 отсутствует, что снижает эффективность З -процессинга на 70-75% [105]. В случае АН возможно формирование двух водородных связей с ИН за счет альдегидной группы при С Г (акцептор протонов) и гидроксильной группы при С4 (донор протонов) (Рис. 48). Поскольку АН-содержащий субстрат процессировался с той же эффективностью, что и природный [95], можно предположить, что для формирования активного фермент-субстратного комплекса, во всяком случае, в присутствии Мп достаточно двух водородных связей, т.е. основные контакты осуществляются ИН со стороны большой бороздки ДНК. Взаимодействие ИН с консервативным аденином со стороны большой бороздки ДНК также было показано в работе [105]. В этом случае остатки цитозина и гуанина могут образовать только по одной водородной связи (N7 в G и NH2 в С, рис. 48). Соответственно скорость З -процессинга дуплексов ВСЗ/АРЗ и BG3/AP3 составляет 50-60% от природного субстрата U5 (Рис. 47 В), а эффективность (20-25% за 1ч, рис. 47 Б) сравнима с эффективностью З -процессинга субстрата, содержащего 7-деазаА [105]. Остаток тимина, участвующий в образовании комплементарной пары, может сформировать с белком со стороны большой бороздки только одну водородную связь за счет 04, но ее геометрия будет существенно отличаться от геометрии связи, формируемой N7 аденина. Однако, если комплементарной пары нет, возможно формирование такой же пары водородных связей, как и в случае аденина. В качестве акцептора протона в тимине может выступать карбонильная группа при С4, а в качестве донора иминная группа (Рис. 48).
Водородные связи, которые могут образовывать различные гетероцикличиские основания с аминокислотами интегразы. Стрелкой указано направление от донора протона к акцептору.
Понятно, что геометрия всех контактов, которые могут образовать с активным центров ИН остатки G, С, Т и АН, существенно отличается от геометрии контактов, образуемых аденином. В присутствии ионов Mg активный центр ИН жестко организован (раздел II.5.1.) и не способен узнать модифицированный субстрат, поэтому З -процессинг не идет. В присутствии же ионов Mn + структура активного центра более гибкая и подвижная, он способен подстроиться к измененной структуре субстрата и осуществить гидролиз межнуклеотидной связи. Причем эффективность этой "подстройки", и следовательность, скорость и эффективность З -процессинга зависят от количества контактов, которые ИН может сформировать с модифицированным субстратом.
Таким образом, на основании анализа всех полученных нами результатов и литературных данных, мы можем сделать вывод о том, что во взаимодействии с ИН принимает участие не только И7-атом консервативного аденина из последовательности СА, но и его экзоциклическая аминогруппа. Кроме того, полученые результаты еще раз показали, что специфичность ИН по отношению к субстрату существенно выше, если в качестве кофактора используется ион Mg2+.
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")
