Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 3
2. Литературный обзор 6
2.1. Источники выделения каррагинан 8
2.2. Химическая структура каррагинанов 10
2.3. Факторы, влияющие на биосинтез каррагинанов 15
2.4. Физико-химические свойства каррагинанов 19
2.5. Методы установления структуры каррагинанов 26
2.6. Биологическая активность каррагинана 32
2.7. Области использования каррагинанов 40
3. Результаты и обсуждение 44
3.1 Структура и свойства каррагинанов из Tichocarpus crinitus 45
3.1.1.Физико-химические свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм Т. crinitus 49
3.1.2. Структура полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм Т. crinitus 56
3.2. Структура и свойства каррагинанов из Chondruspinnulatus 69
3.2.1. Физико-химические свойства полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм С. pinnulatus 69
3.2.2. Структура полисахаридов, выделенных из вегетативной и репродуктивной форм С. pinnulatus 75
3.3. Влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) и температуры воды на структуру каррагинанов 83
3.4. Антивирусная активность каррагинанов 92
4. Экспериментальная часть 95
Выводы 100
- Химическая структура каррагинанов
- Методы установления структуры каррагинанов
- Структура и свойства каррагинанов из Chondruspinnulatus
- Влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) и температуры воды на структуру каррагинанов
Введение к работе
Красные водоросли содержат в значительных количествах сульфатированные полисахариды - каррагинаны, которые выполняют ряд важнейших функций в макрофитах. Эти полисахариды обладают уникальными физико-химическими "свойствами, благодаря чему широко используются в различных областях пищевой промышленности, и относятся к так называемым «пищевым» или «диетическим» волокнам. Не менее важными являются биологические свойства каррагинанов, среди которых наибольший интерес представляют антиязвенная, антикоагулирующая, иммуностимулирующая, противоопухолевая и противовирусная активности.
Физико-химические и биологические свойства этих полисахаридов находятся в тесной взаимосвязи с их структурой, которая характеризуется большим разнообразием и "замаскированной регулярностью". Каррагинаны построены из повторяющихся дисахаридных звеньев D-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися Р-(1—»4) и а-(1— 3) гликозидными связями. В настоящее время установлены структуры около 20, так называемых, «идеализированных» типов каррагинанов, различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп. Природные каррагинаны редко соответствуют таким регулярным структурам, состоящим из одинаковых дисахаридных звеньев, чаще всего они содержат повторяющиеся звенья нескольких типов, что объясняется многоступенчатым биосинтезом полисахаридов в клеточной стенке водоросли.
Структура каррагинанов зависит от множества факторов, которые условно можно разделить на экзогенные, определяемые условиями произрастания водоросли, а именно освещенностью, температурой и соленостью воды, и эндогенные, связанные с физиологией водоросли, в частности их видовой принадлежностью и стадиями развития. Последний фактор особенно важен, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Первые работы по структуре каррагинанов проводились в основном на образцах полисахаридов, выделенных из смеси водоросли разных генераций -гаметофитов и спорофитов. Такой подход часто приводил к получению противоречивых результатов. В последние годы структурные исследования каррагинанов, проводят учитывая фазы жизненного цикла водоросли, из которой они выделены. Это позволяет, во-первых, более точно установить структуру новых типов каррагинанов, а во-вторых, оценить влияние этого фактора на биосинтез полисахаридов. Взаимосвязь между условиями обитания водорослей и их физиологией, а также биохимическим составом изучалась несколькими группами иностранных исследователей. Были получены данные, свидетельствующие как о наличии корреляции между скоростью роста водорослей и биосинтезом ими каррагинанов, так и ее отсутствии. При этом, данные о влиянии таких важных параметров, как температура воды и фотосинтетически активная радиация (ФАР) на структуру и свойства синтезируемых полисахаридов немногочисленны. Вместе с тем, эти исследования могут служить хорошей основой для развития морской биотехнологии. В нашей стране, обладающей промысловыми запасами водорослей, подобные работы отсутствуют, хотя глубоким и систематическим изучением структуры полисахаридов водорослей занимается группа под руководством профессора А.И. Усова в Москве. Однако отдаленность источника предмета исследования от исполнителей не всегда позволяет учитывать те особенности, которые во многом определяют структуру и свойства выделяемых полисахаридов.
В морях Дальнего Востока обширные промысловые запасы водорослей образованы представителями семейств Gigartinaceae {Chondrus armatus и Chondrus pinnulatus) и Tichocarpaceae {Tichocarpus crinitus). Водоросль Tichocarpus crinitus, являясь эндемиком тихоокеанского побережья, представляет особый интерес, так как благодаря своему быстрому росту, крупным размерам и особенностям развития может рассматриваться как перспективный вид для производства полисахаридов Ранее было показано, что и Т. crinitus и С. pinnulatus относятся к каррагинанофитам. Однако, одно только таксономическое положение водоросли не дает полной информации о структуре синтезируемого полисахарида каррагинана. Оценка влияния различных факторов на структуру и свойства каррагинанов из промысловых видов водорослей имеет как фундаментальный, так и прикладной интерес. Эти исследования с одной стороны могут дополнить и уточнить общую концепцию биосинтеза полисахаридов в процессе .онтогенеза водорослей, а с другой стороны могут быть полезными при решении вопросов рационального использования водорослей, в частности их плантационного культивирования и промышленного производства каррагинанов.
Химическая структура каррагинанов
Хотя промышленный выпуск каррагинана начался в 1937 году, данные об его структуре появились значительно позже. Было показано, что каррагинаны представляют собой сульфатированные галактаны, состоящие из У: QMrJC повторяющихся дисахаридных звеньев - D-галактозы и ее производных, соединенных регулярно чередующимися Р-(1—»4) и а-(1— 3) гликозидными связями [15]. Благодаря многочисленным работам Риса с соавторами было установлено несколько "предельных" или идеализированных структур каррагинана, что позволило разделить каррагинаны на "типы", различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, местоположением и количеством сульфатных групп [16-19]. Различное количество и местоположение сульфатных групп, а так же присутствие или отсутствие 3,6-ангидро-0-галактозы позволяет предположить существование 45 дисахаридных звеньев. К настоящему времени известно около 20 из них [20]. Регулярные полисахариды, молекулы которых построены из повторяющихся дисахаридных звеньев одного типа, получили собственные названия. На схеме 1 представлены дисахаридные звенья основных типов каррагинана. В соответствии со структурными особенностями повторяющегося звена особо выделяют 6, так называемых, идеализированных, структур каррагинана, которые представлены строго чередующимися звеньями дисахаридной цепи - A,, v, ц, к, 0, t. Некоторые каррагинаны, кроме сульфатных групп, могут содержать и другие заместители. Небольшое количество б-О-метил-Э-галактозы было обнаружено в к-каррагинане из Kappaphycus alvarezii [21]. Во многих каррагинанах присутствует ксилоза, но ее местоположение часто остается неопределенным. В случае необычного полисахарида из Phacelocarpus peperocarpos по результатам анализа ЯМР-спектроскопии было установлено положение ксилозного остатка-при С-3 4-a-D-галактозы, а в і-каррагинане из Eucheuma denticulatim этот моносахарид находился при С-6 З-Р-О-галактозы [22, 23]. Каррагинаны с высоким содержанием пирровиноградной кислоты были выделены из водорослей рода Callophycus (Solieraceae) [24]. Пирровиноградная кислота образует циклические ацетали при С-4 и С-6 галактозного остатка, которые часто встречаются в дисахаридных звеньях а- и Є-каррагинанов [25, 26, 27]. Во многих видах водорослей семейств Cryptonemiales, Rhodymeniales и Bonnemaisoniales были обнаружены сульфатированные галактаны, имеющие D/L-гибридную структуру, то есть содержащие агар [29-30]. В водорослях семейства Gigartinales, известных как классические источники каррагинана, содержатся в небольшом количестве подобные гибриды [31].
Природные полисахариды редко соответствуют структурам, состоящим из одного повторяющегося дисахаридного звена, обычно наблюдается комбинация двух или более в одной полимерной молекуле [32, 33]. Так, например, полисахариды, выделенные из промысловых водорослей Sarcothalia crispata, Mazaella laminarioides и Chondrus crispus, имеют гибридную структуру к/і-каррагинанов [34]. Высоко сульфатированный полисахарид со сложной структурой из красной водоросли Melanema dumosum, растущей у берегов Австралии, был идентифицирован как гибрид і/к/р-каррагинанов [35]. Исследование полисахаридов из пяти видов водорослей Dicranemataceae показало, что все они имеют гибридную структуру р/к-каррагинана [9]. Структура выделяемых полисахаридов зависит от условия проведения экстракции. Так, при проведение предварительной обработки водоросли щелочью из А,-каррагинана формируется 9, но этот процесс происходит редко, более часто из к- и і-каррагинанов образуются р.- и v- , соответственно [36]. На соотношение различных типов каррагинана в экстракте влияет и температура, при которой происходит процесс выделения. Например, в экстракте, полученном при комнатной температуре из G. skottsbergii с гаметофитами, соотношение к- и і-каррагинанов составляет 1:0.30, в то время как при повышении температуры увеличивается содержание і-каррагинанов (1:0,43) и дополнительно экстрагируется значительное количество предшественников [37]. Полисахариды, полученные экстракцией при разных температурных режимах из Agardhiella subulata, не отличались по структуре. Небольшое различие заключалось в присутствии предшественников в экстракте, полученном при температуре 24С [38]. Предполагается, что наличие гибридной структуры объясняется ступенчатым биосинтезом галактанов, в процессе которого вначале из остатков галактозы строится регулярная основа полимерной молекулы, затем происходит сульфатирование и, наконец, ферментативное элиминирование сульфатов из положения 6 4-0 замещенных остатков галактозы. Ферментативное элиминирование приводит к образованию ангидроциклов. Поскольку реакции модификации полимерных молекул могут протекать не полностью, то конечным продуктом биосинтеза может быть "молекулярный гибрид", содержащий одновременно звенья нескольких типов каррагинанов [13]. Поэтому в настоящее время все известные каррагинаны сгруппированы в четыре основных семейства: к, р, X, со, что отражает путь биосинтеза данных полисахаридов. Для Р-семейства характерно полное отсутствие сульфатных групп, в к-, Х- и со-типах сульфатные группы локализованы при С-4, С-2 и С-6, соответственно [39, 40, 41]. Внутри каждой группы существуют полисахариды с более сложной гибридной структурой. Eucheuma gelatinnae, являющаяся источником р-каррагинана, содержит молекулы с гибридной структурой, относящейся к Р" и к-типам, и небольшое количество олигосахаридов, полученных при расщеплении к-каррагиназой [42]. Галактаны, выделенные из Furcellaria lumbricali (Huds.) Lamour. могут быть отнесены, по крайне мере, к трем выделенным семействам: (3, к и со [43]. В тоже время термин "каррагинан" довольно старый и является общим названием для структур, содержащих чередующиеся З-р-О-галактопиранозное и 4-оЯ пиранозное звенья.
В связи с этим, Кнутсен с соавторами предложил новую номенклатуру: для полисахарида, в основе которого лежат эти чередующиеся фрагменты, сохраняется прежнее название - каррагинан, а для структуры, в которой присутствует 3,6-ангидрогалактоза предложен новый термин - каррагиноза. Кроме этого, вводится буквенный код, где 4-0-галактоза обозначается через D, а З-Э-галактоза - G, а различным заместителям присваивается свой код (табл.1) [44]. Биосинтез каррагинана в клеточной стенке водоросли зависит от множества факторов, которые можно разделить на экзогенные, определяющиеся условиями произрастания водоросли - температура, соленость, освещение и сезонность; и на эндогенные, связанные с видовой принадлежностью водоросли и ее физиологией, в частности, со стадией ее жизненного цикла" и возраста водоросли. [15, 32, 46, 47]. Последнее особенно важно, так как красные водоросли имеют сложный жизненный цикл, включающий в себя чередование вегетативного, полового и бесполого размножения. Наиболее простым является вегетативное размножение, когда водоросль размножается фрагментами слоевища или путем образования дополнительных побегов. Бесполое размножение осуществляется с помощью специальных спор - моноспорами у простейших и тетраспорами у высших. При половом размножении происходит оплодотворение, в результате которого образуются карпоспоры у простейших или цистокарпы у высокоорганизованных растений. Цистокарпы это достаточно крупные видимые невооруженным глазом плотные выпуклые образования на поверхности или внутри слоевища. Многие ученые признают цистокарпы третьей фазой в цикле развития водорослей -карпоспорофитами, которые ведут паразитический образ жизни на женском гаметофите. Растения, образующие споры, называют спорофитами, а образующие гаметы - гаметофитами. Спорофиты и гаметофиты могут резко различаться по внешнему виду (нередки случаи, когда их ошибочно относили к разным родам), но могут быть и очень сходными (изоморфными) [48]. Первые структурные работы по каррагинану были выполнены на смеси различных типов полисахарида, выделенных из неразделенных в соответствии с фазой развития водорослей. Этот факт существенно затруднял интерпретацию полученных данных и не позволял корректно установить структуру исследованных полисахаридов. Позже появились структурные исследования каррагинанов, выделенных из водорослей, строго соответствующих определенной стадии жизни. Было установлено, что водный экстракт из водоросли Chondrus crispus с карпоспорофитами содержит, по крайне мере, три различных типа каррагинана, тогда как полисахариды, выделенные из тетраспорофитов, представляли собой практически чистый Х-каррагинан [49].
Методы установления структуры каррагинанов
Каррагинаны находят применение во многих областях промышленности, обладают широким спектром биологических свойств, и поэтому необходимо установление точной структуры и определение таких параметров как молекулярная масса, полидисперсность, степень сульфатирования полисахарида. В настоящее время для этих целей используют классические методы химии углеводов, комбинирование методов структурной химии и ядерномагнитного резонанса, методы химической и ферментативной модификации, хроматографические методы (ГЖХ, ВЭЖХ, гель-проникающая хроматография), а так же методы световой микроскопии и электрофорез [94-102]. Использование химических методов при установлении структуры галактанов красных водорослей имеет ряд особенностей, связанных с присутствием 3,6-ангидрогалактозы и сульфатных групп [103]. Полный кислотный гидролиз, который является распространенной "процедурой определения моносахаридного состава, приводит к полному разрушению 3,6-ангидрогалактозы. Проведение гидролиза в присутствии кислото-устойчивого восстановителя, например 4-метил-1морфолин борана, предохраняет кислото-чувствительные моносахариды от разрушения в момент их выделения в процессе гидролиза [94, 104, 105]. Восстановительный гидролиз может быть проведен и на биомассе водорослей, но при этом, кроме основных моносахаридов, образуются дополнительные компоненты, такие как ксилоза, манноза и глюкоза, образующиеся при гидролизе ксиланов, маннанов и флоридного крахмала, соответственно [106]. В тоже время этот метод нечувствителен к неуглеводным компонентам, присутствующим в биомассе водорослей. Этот анализ позволяет быстро получить предварительные сведения о полисахаридном составе больших серий образцов и особенно полезен при поиске новых источников практически ценных полисахаридов. Восстановительный гидролиз галактанов, проведенный при низкой температуре и с низко концентрированной кислотой, приводит к образованию дисахаридов, имеющих на конце 3,6-ангидрогалактозу, - каррабиитов. Абсолютную конфигурацию 3,6-ангидрогалактозы можно определить с помощью газо-жидкостной хроматографии, анализируя ацетаты каррабиитов [107]. Абсолютная конфигурация других моносахаридов может быть так же определена хроматографически при анализе гликозидов хиральных спиртов (бутанол-2, октанол-2) или восстановительным аминированием с хиральным амином с последующим ацетилированием [108, 109].
Картину замещения соседних остатков дает частичный восстановительный гидролиз метилированных образцов с последующим десульфатированием, ацетилированием и анализом с помощью ГЖХ-МС. Определение местоположения заместителей может быть достигнуто путем сравнения метилированных нативных полисахаридов с метилированными десульфатированными [ПО, 111]. Хорошо известно щелочное десульфатирование при котором происходит удаление сульфатной группы при шестом атоме углерода с образованием 3,6-ангидрогалактанов [112, 113]. Такая щелочная обработка полисахаридов обычно используется в промышленности дляулучшения желирующих свойств каррагинанов [114]. Удаление сульфатных групп при других атомах углерода происходит при сольволитическом десульфатировании, где прямое действие кислоты на полисахарид исключено. Большинство методов сольволиза включают нагревание пиридиновой соли сульфатированного полисахарида в диметилсульфоксиде и пиридине в присутствии метанола или воды [115]. При таком десульфатировании происходит разрушение полисахарида, а процент удаленных сульфатных групп незначителен. Для избежания разрушения, десульфатирование проводят в присутствии Ы,0-бис-(триметилсилил) ацетамида, хлорметилсилана или пиромелитовой кислоты с избытком пиридина или натрия, триоксида мышьяка [116-118]. В структурном анализе сульфатированных полисахаридов широко применяется ИК- и ЯМР-спектроскопия. ИК-спектроскопия является классическим методом при изучении галактанов водорослей. Впервые этот метод был использован при изучении сульфатированных полисахаридов в середине 70-хх гг. [119]. Развитие ИК-Фурье спектроскопии дает значительные преимущества в применении видимой спектроскопии в структурных исследованиях полисахаридов. Вторые производные, полученые для ИК-Фурье спектров, дают больше информации за счет увеличения количества и разрешения полос поглощения по сравнению с исходными спектрами [120].
В настоящее время ИК-спектроскопия является очень эффективным и в тоже время простым методом для определения 3,6-ангидрогалактозы, общего содержания и местоположения сульфатных групп по характеристическим полосам поглощения. На модельных образцах каррагинанов установлено, что связь S=0 имеет полосу поглощения при 1240 см"1, С-О 3,6-ангидрогалактозы при 930-940 см"1, C-0-S аксиальной вторичной сульфатной группы при С-4 галактозы - 845 см 1, C-O-S экваториальной первичной сульфатной группы при С-6 - 820 см"1, C-0-S аксиальной вторичной группы при С-2 3,6-ангидро-0-галактозы - 805 см 1 [99]. Соотношение площадей полос поглощения при 805 и 845 см"1 к 1250 см 1 позволяет рассчитать содержание сульфатных групп [121]. С помощью этого метода могут быть обнаружены минорные компоненты, например предшественники желирующих каррагинанов - ji и v- типы, присутствующие в концентрации менее чем 5%. Кроме того, ИК-спектроскопия часто используется для контроля над степенью сульфатирования при проведении химических модификаций галактанов [122]. Совокупность данных, полученных методом ИК-спектроскопии, представляет достаточно обширную информацию, которая может быть использована при структурных исследованиях полисахаридов. Более того, был разработан новый метод ИК-спектроскопии, позволяющий определить присутствие каррагинанов в высушенных образцах водоросли [123]. Спектры ПМР и С-ЯМР дают более полную информацию о составе и строении полисахаридов. Использование С-ЯМР спектроскопии для установления первичной структуры галактанов из красных водорослей было предложено в 1978 [124]. Известно, что С-ЯМР-спектры регулярных полисахаридов соответствуют спектрам дисахаридов и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов. По величине химического сдвига аномерного сигнала 3,6-ангидрогалактозного остатка можно определить к какому типу галактана относится изучаемый полисахарид - агару или каррагинану [125]. Заместители типа О-метильных и сульфатных групп вызывают смещение сигналов ближайших атомов углеводов на 6-Ю м.д. в слабое поле для атома, несущего заместитель, и на 2-4 м.д. в сильное поле для двух соседних атомов [103]. Знание всех закономерностей позволяет локализовать такие заместители по данным С-ЯМР-спектра. К настоящему времени описаны и сведены в таблицу 13С-ЯМР-спектры дисахаридных повторяющихся звеньев, наиболее известных галактанов красных водорослей (табл. 1) [96]. Спектроскопию С-ЯМР успешно используют в сочетании с химическими методами структурного анализа, например для оценки результатов химической модификации полисахаридов, ферментативного гидролиза и т.д. [96,126-128].
Структура и свойства каррагинанов из Chondruspinnulatus
Водоросли С. pinnulatus были собраны в конце августа в заливе Петра Великого и разделены на две группы в соответствии со стадией их жизненного цикла - вегетативную и репродуктивную. Полисахариды из С. pinnulatus были экстрагированы горячей водой и фракционированы хлористым калием на желирующие (KCl-нерастворимые) и нежелирующие (KCl-растворимые) фракции. В отличие от Т. crinitus, полисахариды из С. pinnulatus практически не удается выделить при 24С. Выход и состав полученных фракций приведен в табл.11. Общее содержание полисахаридов, выделенных из вегетативной формы водоросли С. pinnulatus, в 1,4 раза больше, чем из репродуктивной. В репродуктивной форме количество желирующей и нежелирующей фракций примерно одинаково, тогда как в вегетативной форме преобладает желирующая. Как показали результаты химического анализа, основными моносахаридами всех фракций являются галактоза и 3,6-ангидрогалактоза. Как видно из табл.11, только для полисахаридов желирующей фракции из репродуктивной формы водоросли наблюдается регулярность в полимерной цепи. Как и в случае нежелирующих полисахаридов из Т. crinitus, нежелирующие фракции их двух форм С. pinnulatus содержат 3,6-ангидрогалактозу. Для" оценки молекулярно-массового распределения полисахаридов был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Shodex GS-620. Как видно из рис. 23, выходная кривая для полисахаридов желирующей фракции из вегетативной формы водоросли носит бимодальный характер. Основная часть полисахарида имеет молекулярную массу около 100 Ша, а небольшой пик с молекулярной массой 500 Ша указывает на гетерогенность этих полисахаридов. В тоже время для полисахаридов желирующей фракции, выделенных из репродуктивной формы С. pinnulatus, выходная кривая содержат один ассиметричный пик, который соответствует молекулярной массе порядка 600 Ша. Как видно из рис. 24, выходная кривая для полисахаридов нежелирующей фракции из вегетативной водоросли имеет ассиметричную форму с широким плечом, значение молекулярной массы которого находится в пределах порядка 400 kDa. Полисахариды из репродуктивной формы имеют подобное значение молекулярной массы, но они характеризуются незначительной полидисперсностью полимера.
Для определения средневесовой молекулярной массы исследуемых полисахаридов был использован метод вискозиметрии. Значения характеристической вязкости, полученные для растворов полисахаридов при 25С, приведены-в табл. 12. На основании уравнения Марк-Хаувинка-Куна и параметры констант, расчитанные для к-каррагинанов в 0,2 М NaCl (К=3-10 , ос=0.95), были определены молекулярные массы исследуемых полисахаридов, значения которых приведены в табл. 12. Как видно из табл. 12, наибольшую средневесовую молекулярную массу (около 400 Ша) имеют полисахариды нежелирующей фракции из репродуктивной формы водоросли, что согласуется с результатами ВЖХ. Были определены некоторые реологические свойства полисахаридов. Как известно, желирующие типы полисахаридов образуют прочные гели в присутствии ионов К+ [70]. В связи с этим, было изучено влияние концентрации КС1 на прочность образуемых гелей 1% растворами полисахаридов. Как видно из рис. 25, с увеличением концентрации КС1 прочность геля полисахаридов из двух форм водоросли возрастает, достигая максимального значения в 1,5 % растворе КС1, а потом резко падает. Прочность гелей полисахаридов из репродуктивной формы С. pinnulatus при оптимальной концентрации КС1 больше в 2 раза, чем для полисахаридов из вегетативной водоросли. Таким образом, показано, что общее содержание полисахаридов в вегетативной форме С. pinnulatus в 1,4 раза больше, чем в репродуктивной. Согласно результатам анализа высокоэффективной хроматографии, выделенные полисахариды являются полидисперсными и их молекулярные массы находятся в пределах 400 Ша. Желирующие полисахариды, выделенные из репродуктивной С. pinnulatus, образуют более прочные гели, чем полисахариды из вегетативной формы водоросли. Для идентификации выделенных полисахаридов были использованы методы ИК- и _ 13С-ЯМР-спектроскопии. Как было сказано ранее, полисахариды, выделенные даже из одного вида водоросли, часто представляют собой смесь нескольких типов каррагинана. ИК-спектры смеси полисахаридов имеют довольно сложный контур, так как полосы поглощения, отвечающие каждому типу, могут перекрываться. Для улучшения разрешения спектров и оценки каждого типа каррагинана сложный спектр был разложен на индивидуальные компоненты, что позволило не только идентифицировать каррагинаны, но и рассчитать соотношение дисахаридных звеньев отдельных типов каррагинана в смеси. В ИК-спектрах интенсивная полоса поглощения в области 1250 см"1 , наблюдаемая для всех исследуемых полисахаридов, указывает на присутствие значительного количества сульфатных групп [231]. ИК-спектры полисахаридов желирующего типа из двух форм водоросли в характеристической, области 1000-700 см"1 см похожи (Рис. 26). В этих спектрах наблюдается интенсивная полоса поглощения при 930 см"1, характерная для 3,6-ангидрогалактозы и полоса поглощения при 848 см 1, относящаяся к сульфатной группе при С-4 остатка галактозы [232].
На основании этих данных полисахариды желирующих фракций можно отнести к к-каррагинанам. Полоса поглощения в области 804 см 1 указывает на присутствие сульфатной группы при С-2 остатка 3,6-ангидрогалактозы, что является характерным для і-каррагинана [232]. Как видно из рис. 27, в ИК-спектрах, полученных для стандартного образца і-каррагинана, присутствуют две полосы поглощения в области 806 (сульфатная группа при С-2 остатка 3,6-ангидрогалактозы) и 851 см"1 (сульфатная группа при С-4 остатка галактозы ). Так как полосы поглощения при 848 и 851 см 1 близки, то их наложение, в случае смеси і- и к-каррагинанов, может дать одну полосу в области 848 см"1, наблюдаемую на рис. 26. Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты позволило оценить содержание к- и і-звеньев в исследуемых каррагинанах (Рис. 28, 29). Для этого были рассчитаны соотношения площадей полос поглощения при 848 и 806 см 1 см. Если для стандартного образца величина этого соотношения составила 1,16, то для полисахаридов из репродуктивной и вегетативной форм водорослей оно равнялось 1,63 и 2,05, соответственно. Увеличение величины соотношения S848/Sso6 в ИК-спектрах исследуемых полисахаридах по сравнению с величиной S852/Sgo6 Для стандарта указывает на присутствие смеси к- и і-каррагинанов. Таким образом, согласно данным ИК-спектроскопии, желирующие полисахариды могут быть отнесены к к/ьтипам каррагинана, при этом в вегетативной форме водоросли содержание і-каррагинана меньше, чем в репродуктивной. С-ЯМР-спектры полисахаридов желирующих фракций из вегетативной и репродуктивной форм водоросли содержат более 12 сигналов, что говорит об их нерегулярной структуре. Как видно из рис. 30 и рис. 31, в области резонанса аномерных сигналов наблюдаются 4 сигнала. Двойные сигналы с 8" 95.9 м.д. относятся к атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-В-галактозы к-каррагинана, а сигналы с 5 92.7 м.д. соответствуют атомам С-1 остатков 3,6-ангидро-0-галактозы і-каррагинана. Двойные сигналы с химическими сдвигами 103.2 и 103.1 м.д. относятся к атомам С-1 остатков галактозы к- и і-типов каррагинанов. В добавление к основным сигналам, в спектрах полисахаридов желирующих фракций из двух форм водоросли наблюдаются сигналы с 8 105.5 м.д. Согласно 0-JJ литературным данным эти сигналы соответствуют С-1 остатков"1 галактозы, v имеющих сульфатную группу при С-4, и которые могут быть отнесены к предшественникам к-типа каррагинанов.
Влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) и температуры воды на структуру каррагинанов
Как было сказано выше, состав и количество экстрагируемого полисахарида зависят не только от фазы жизненного цикл водоросли, но и условий ее обитания. Изучено влияние фотосинтетически активной радиации (ФАР) на общее содержание полисахаридов в трех видах красных водорослей - Tichocarpus crinitus, Chondrus pinnulatus, Iridaea cornicopia. Интенсивность ФАР имеет большое значение для характеристики фотосинтетических процессов. В системе СИ ее величина выражается количеством микромолей квантов света, падающих на 1 м поверхности за 1 с, или идентичной, но не входящей в систему СИ, "7 1 9 1 единицей микроэйнштейн (мкЕ) на 1 м -1-е" (мкЕ-м" -с ), который составляет 6,02-1017 квантов м -с"1 [235, 236]. Полисахариды были выделены и фракционированы как описано в гл.3.1. Как видно из диаграммы на рис. 34, общее содержание полисахаридов в талломах водорослей меняется в зависимости от количества поступающей на поверхность воды ФАР. Для всех видов водорослей максимальное количество каррагинана (до 50%) наблюдается при низкой освещенности (10% ФАР). С увеличением интенсивности падающего света до 70 % ФАР, количество синтезируемого полисахарида уменьшается в 2,5 раза. Более подробно влияние интенсивности света и температуры воды на полисахаридный состав было изучено на примере водоросли Т. crinitus, способной долгое время находятся в вегетативном состоянии. Водоросли были собраны с июня по октябрь месяц, когда они были представлены вегетативной формой. Это позволило ограничить круг факторов, влияющих на биосинтез полисахарида, исключив такой важный параметр, как фаза развития водоросли. Водоросль Т. crinitus была взята из естественных условий ее обитания с глубины 1,5 м и размещена для дальнейшего роста в различные световые условия, а именно на глубину 1,5 м, где количество падающего света, измеренного в единицах ФАР, составляло 30-35% и на глубину 4 м с 10-15% ФАР. Сбор водоросли производили каждый месяц - с июля по октябрь. Было установлено, что Т. crinitus адаптируется к световым условиям обитания через изменения как морфологических и анатомических характеристик, так и через биохимические процессы, связанные с биосинтезом полисахаридов. Наибольшая скорость роста наблюдается у водоросли, растущей при 10-15% ФАР в августе месяце при температуре воды 24С (Рис. 35).
Полисахариды были экстрагированы горячей водой и фракционированы осаждением КС1 на желирующие (KCl-нерастворимые) и нежелирующие (КС1-растворимые) фракции. Характеристика полученных фракций приведена в табл. 14. Как видно из таблицы, все фракции содержат белок, причем содержание его в экстрактах водоросли, выращенной на глубине (10-15% ФАР), меньше чем у водоросли, взятой с поверхности. Высокое содержание 3,6-ангидрогалактозы (до 30%) было обнаружено в желирующих фракциях полисахаридов из водорослей, выращенных при разных световых условиях. Вместе с тем, нежелирующие фракции полисахаридов также содержат 3,6-ангидрогалактозу, количество которой уменьшается от 8 до 5% с понижением интенсивности падающего света. Как видно из табл. 14, с изменением интенсивности падающего света изменяется и качественный состав полисахаридов. Общее содержание полисахаридов в талломах водоросли хорошо коррелировало с ростовыми процессами. Наибольшее количество полисахарида было выделено в августе из водоросли, растущей при температуре 24С и на глубине, где интенсивность падающего на поверхность воды света составляет 10-15% ФАР. С увеличением освещенности до 30-35% ФАР количество продуцируемого в водоросли полисахарида уменьшается в 1,5 раза. С августа по октябрь с понижением температуры воды с 24 до 11С наблюдается постепенное уменьшение содержания полисахарида во всех образцах водорослей независимо от количества падающего света. Как видно из диаграммы на рис. 36, с изменением интенсивности падающего света изменяется и качественный состав полисахарида. С августа по октябрь содержание желирующей фракции полисахаридов в водоросли, растущей при низкой освещенности, было постоянным, тогда как количество нежелирующей фракции постепенно уменьшается. В тоже время в водоросли, выращенной при 30% ФАР, в течение всего экспериментального периода соотношении этих фракций практически не меняется. У водоросли, выращенной при 10-15% ФАР преобладает содержание нежелирующих полисахаридов. Причем, в августе содержание нежелирующих полисахаридов в 3 раза больше, чем желирующих, тогда как при 30-35% ФАР и этой же температуре воды их количество примерно одинаковым. ИК-спектры полисахаридов желирующих фракций из водорослей, выращенных при разных световых условиях, были похожими и идентичными ИК-спектрам желирующих полисахаридов, выделенных из вегетативной формы Т. crinitus (Рис. 37). Как было установлено в гл. 3.2.2., желирующие полисахариды имеют структуру к/р-типов каррагинана. Разложение ИК-спектров на индивидуальные компоненты позволило оценить соотношение к- и р-звеньев в исследуемых каррагинанах в зависимости от места произрастания водоросли. Для этого были рассчитаны соотношения площадей пиков, характеризующих остатки несульфатированной галактозы и 3,6-ангидрогалактозы (889з/$9зз)- Величина этого соотношения составила 0,66 и 0,27 для полисахаридов, выделенных из водорослей, растущих в затемнении и на свету, соответственно. Следовательно, с уменьшением освещенности от 30-35% до 10-15% ФАР количество Р-звеньев в полимерной цепи каррагинана увеличивается в 2,4 раза. Можно предположить, что низкая освещенность способствует дополнительному десульфатированию полисахаридов, продуцируемых водорослями.
ИК-спектры нежелирующих полисахаридов из водорослей, выращенных при 10-15% и 30-35% ФАР имеют некоторые различия (Рис. 38). Широкие полосы поглощения в области 841-812 см"1, наблюдаемые для полисахаридов из водоросли, растущей при 30-35% ФАР, могут быть результатом наложения полос поглощения при 845, 830 и 820 см 1, характеризующих Х-каррагинан [99]. В тоже время в ИК-спектрах полисахаридов из водоросли, выращенной при 10-15% ФАР, наблюдаются интенсивные полосы поглощения при 933 и 851 см 1, указывающие на присутствие значительного количества желирующих типов каррагинана с низким содержанием сульфатных групп. Как было показано в гл. 3.1.2. этот полисахарид представляет собой в основном каррагинан, отнесеный к х-типу. Вариации зависимостей количественных и качественных характеристик каррагинана от интенсивности света показали, что фотосинтетически активная радиация является не только важным фактором ростовых процессов Т. crinitus, но и определяющим параметром биосинтеза основного структурного полисахарида клеточных стенок красных водорослей. Значительное влияние на характеристики каррагинана оказывает и температура воды. 3.4. Изучение биологической активности каррагинанов. Среди большого спектра биологической активности каррагинана особый интерес исследователей вызывает его антивирусная активность. Различные типы каррагинанов оказывают in vitro ингибирующее влияние на репликацию ряда ДНК- и РНК-вирусов человека и животных [167, 172, 173, 179]. В тоже время литературные "данные по изучению действия каррагинанов на фитопатогенные вирусы отсутствуют. Поэтому нами было исследовано действие различных типов каррагинанов - к, X, к/р\ кЛ, х - на модели вируса табачной мозаики. Структуры к- и .-каррагинанов из С. armatus были установлен в лаборатории ЛМОАБИ ранее [14]. Согласно результатам химического анализа выделенные каррагинаны отличаются друг от друга содержанием сульфатных групп и 3,6-ангидрогалактозы (табл. 5, 9). Действие каррагинанов на вирус табачной мозаики оценивали по числу локальных некрозовл индуцированных вирусом. Проявление антивирусной активности заключалось в значительном уменьшении количества ВТМ-индуцированных локальных некрозов, образующихся на листьях табака Ксанти-нк при инокуляции их смесью вируса и каррагинана, в сравнении с листьями, инокулированными только ВТМ.
