Содержание к диссертации
Введение
1. Структурная характеристика нуклеофозмина него роль в клеточных процессах 8
1.1. Основные свойства и характеристики нуклеофозмина 8
1.1.1. Структура гена нуклеофозмина 8
1.1.2 Аминокислотная последовательность и доменная организация нуклеофозмина 11
1.1.3 Внутриклеточная локализация нуклеофозмина 14
1.1 4. Иуклеофозмин - фосфопротеин 15
1.1.5. Отгомеризация нуклеофозмина 16
1.1.6. Нуклеофозмин - молекулярный шаперон 19
1.1.7. Взаимодействие нуклеофозмина с нуклеиновыми кислотами 20
1.1.8 Взаимодействие нуклеофозмина с другими белками 21
1.2. Структурно-функциональное состояние нуклеофозмина в процессе митоза и апоптоза 22
1.2.1. Структура и свойства нуклеофозмина в митозе 22
1.2.1 Структура и свойства нуклеофозмина при апоптоза 26
2. Структура и свойства ключевого ядрышкового белка- нуклеофозмина в клетках HeLa 34
2.1. Анализ мономср-олиюмерного состояния нуклеофозмина в опухолевых клетках человека 35
2.1.1. Состояние мономерных и SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa 36
2 1.2. Состояниемопоиерных и SDS-устойчивых олигомерных фор и нуклеофоз мина в различных опухолевых клетках человека 41
2.2. Свойства SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa 44
2.3 Структурный анализ нуклеофозмина в клетках HeLa 48
2.3.1. Состояние мономерных и SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в ядрах и ядрышках клеток HeLa 50
2.3.2 Получение фракции, содержаний нуклеофозмип из ядер клеток HeLa 55
2 3.3 Структурный анализ нуклеофозмина в составе ядер клеток HeLa 62
2 4. Состояние мономерных и SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa при апоптозе, индуцируемом TNF-a 68
2.4.1 Индукция апоптоза и получение апоптозных клеток 69
2.4 2 Изменения UBF при апоптозе 75
2 4.3 Изменения нуклеофозмина при апоптозе 79
3. Экспериментальная часть 85
Выводы 102
- Структурно-функциональное состояние нуклеофозмина в процессе митоза и апоптоза
- Свойства SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa
- Структурный анализ нуклеофозмина в составе ядер клеток HeLa
- Изменения нуклеофозмина при апоптозе
Введение к работе
Все клетки имеют обязательные внутриядерные структуры - ядрышки. Это правило имеет исключения, которые только подчеркивают важность и необходимость участия ядрышка в жизненных отправлениях клетки. К таким исключениям относятся клетки дробящихся яиц, где ядрышки отсутствуют на ранних этапах эмбриогенеза, или клетки, закончившие развитие и необратимо специализировавшиеся, например некоторые клетки крови.
Ядрышко - дискретная часть ядра, где происходит синтез и процессинг (созревание) рибосомных РНК (рРНК) и формируются рибосомные частицы. Ядрышко является одной из наиболее динамичных структур клетки, которая в течение клеточного цикла претерпевает глубокие структурные и функциональные перестройки, В ядрышке происходит транскрипция основных рибосомных генов (рДНК), т.е. генов, которые кодируют три из четырех рРНК, специфических для рибосом (18S, 5,8S и 28S рРНК) [Shaw and Jordan, 1995] Первые электронно-микроскопические работы показали, что ядрышки самых разных объектов, несмотря на их разнообразие, построены из одинаковых компонентов: помимо молекул рРНК и рДІІК в состав ядрышек входят несколько сотен различных типов белков
В последнее время интерес к изучению структуры ядрышка резко возрос. Было показано, что кроме канонических функции (транскрипции рибосомных генов и биогенеза рибосом) ядрышко принимает участие в клеточной дифференциации, реіуляции клеточного цикла и апоптоза [Pederson, 1998; Li et al., 2006]. Различными группами ученых был проведен протеомный анализ ядрышек клеток человека и растений. В 2002 году [Andersen et al., 2002; Sher! et al., 2002] был впервые проведен протеомный анализ ядрышек клеток человека (HeLa) масс-спектрометрическим анализом белков ядрышковых лизатов, разделенных с помощью одно- и двумерного электрофореза в ПААГ. В
результате проведенных исследований в составе ядрышек были идентифицированы 271 [Andersen et al., 2002] и 213 белков [Sherl et al., 2002]. Таким образом, оба этих независимо проведенных протеомных анализа позволили идентифицировать в сумме около 350 различных белков, локализованных в ядрышках клеток человека. Все идентифицированные белки были сгруппированы в классы в соответствии с их биологическими функциями (рис. 1). Помимо рибосомных белков и белков, участвующих в процессах синтеза и протессинга рРНК, в составе ядрышек были идентифицированы также белки-шапероны, различные трансляционные факторы, а также белки, содержащие DEAD-боксы. Протеомный анализ ядрышек клеток растений (Arabidopsis) позволил идентифицировать 217 белков, также принадлежащих к различным классам [Pendle et al., 2004]. Полученные данные свидетельствуют о полифункциональной природе ядрышка. Построение исчерпывающей картины процессов, протекающих в ядрышке, является важной задачей, требующей понимания функций как каждого из компонентов ядрышка, так и характера их взаимодействия.
Неохарактеризованные ости і 30,5%
Другие
Шаперош
DEAD-бокс белки
5%
Белки, участвующие
в синтезе и Другие трай
процессинге РНК ляшюнные
9% факторы
3.5%
Рнбосомалыше белки 14%
Белки, связывающие нуклеоти ды и нуклеиновые И1СЛОТЫ
22%
Рис. 1. Классификация ядрышковых белков [Andersen et al., 2002].
Одно из важных различий между раковыми и нормальными клетками заключается в гиперактивности и нлсоморфизме ядрышек [Liu and Yung, 1998]. Ядрышки раковых клеток проявляют чрезвычайную вариабельность в величине, форме, тонкой структуре и цитохимическом составе. К сожалению, в настоящее время имеется мало информации о ядрышковых белках, их роли в нормальных и опухолевых клетках. Предметом нашего исследования стал нуклеофозмин/белок В23/нуматрин/Ш38 - ключевой нерибосомный белок ядрышка, содержание которого в активио-пролиферирующих и раковых клетках и тканях в 5-20 раз выше, чем в нормальных [Chan et al., 1989; Nozawa et al,, 1996] Известен ряд функциональных особенностей этого белка: во-первых, нуклеофозмин является "челноком", переносящим белки, постоянно курсирующим между ядром и цитоплазмой [Szebeni et al, 1997; Fankhauser et al, 1991]; во-вторых, служит молекулярным шапсроном, предотвращающим белки от аїрегации [Szebeni and Olson, 1999]; в-третьих, ломкий ген нуклеофозмина включен в ряд хромосомных транслокаций, что приводит к образованию смешанных (fusion) белков, изменяя присущую им локализацию в клетке и свойства [Chan et al., 1997; Cordell et al., 1999]. Нуклеофозмин обладает также PHK-связывающей и эндонуклеазной активностями [Dumbar et al, 1989; Savkur and Olson, 1998], Полифункциональность заложена в самой структуре этого белка: он не только экспрессируется в виде двух изоформ, но и существует как в мономерных, так и олигомерных формах. Ключевая роль нуклеофозмина во многих жизненно-важных процессах, протекающих в ядрышке предопределила наш первоочередный интерес к этому белку.
Структурно-функциональное состояние нуклеофозмина в процессе митоза и апоптоза
Ядрышко играет важную роль в регуляции ряда важных процессов, протекающих в клетке, в частности, клеточного цикла и апоптоза. Апоптоз, вместе с клеточным делением, поддерживает тканевый гомеостаз сохранением равновесия между пролиферацией клеток и их смертью и удалением. Многочисленные заболевания связаны напрямую с нарушением этого равновесия. Так, в нейродегенеративных процессах и СПИДе апоптоз протекает чрезмерно активно и удаляются клетки, критичные для здоровья человека [Gougeon and Montagmer, 1993]. В других случаях (таких как рак и ряд аутоиммунных заболеваний) апоптоз ослаблен и удаление ненужных клеток не осуществляется [Wu et al., 1994; Casiano and Tan, 1996]. 1.2,1, Структура и свойства пуюіеофозмипа в митозе В митотических клетках происходит полная физиологическая перестройка большинства клеточных процессов, дезинтеграция ядрышковой структуры, приостановка транскрипционных и трансляционных процессов, изменение статуса фосфорилирования многих белков посредством циклин-зависимой киназы (CDK2/cdc2), как главною компонента универсального митотического индуктора MPF (M-phase-promoting factor). Митотическая перестройка сопровождается перераспределением белков по компартментам клеток, выстраиванием новых структур, играющих центральную роль не только в цитокинетических процессах, но и в перераспределении пулов белков между дочерними клетками. В митозе происходит также изменение локализации и структурного состояния и нуклеофозмина [Zatsepina et al., 19976]. Данные по количественному уровню нуклеофозмина в митозе противоречивы. Так, согласно одним данным [Jiang and Yung, 1999; Yang et al., 1994], уровень мРНК нуклеофозмина возрастает на ранних митотических фазах (в прометафазе и метафазе), тогда как исследования на белковом уровне показали [Okuda et al., 2000], что возрастание количества нуклеофозмина характерно для раннего постмитотического периода. Тем не менее, подавление синтеза нуклеофозмина экспрессией антисенс-олиго-РНК, комплементарной его мРНК, приводит к задержке клеток в предмитотическом периоде. [Feuerstein et al., 1988а; Feuerstein et al., 19886; Jiang and Yung, 1999]. Уровень фосфорилирования нуклеофозмина в митотических клетках значительно возрастает (рис, 4). Многочисленные данные показывают, что в процессе митоза белок фосфорилируется киназой CDK2/cdc2 [Okuda et al, 2000; Feuerstein, 1991].
Активность CDK2/cdc2 в клеточном цикле регулируется двумя циклинами: митоз-специфическим циклином В и циклином Е, активном на границе G1/S, причем уровень фосфорилирования белка В23 также возрастает в эти периоды, достигая максимальной степени в митотической фазе [Zatsepina et al, 19976; Okuwaki et al., 2002]. Как было показано на модели эксирессионного нуклеофозмина т vitro, фосфорилирование нуклеофозмина в митозе происходит по остатку Thr199 [Peter et al, 1990] и, возможно, по аминокислотным остаткам треонина в положениях 219, 234,237 [Jones et al., 1981; Okuwaki et al, 2002; Chan et al., 1990], Недавно был выявлен новый сайт фосфорилирования, расположенный в N-концевом домене нуклеофозмина. Было показано, что в митозе также может происходить фосфорилирование С2-специфической киназой Plk-1 (Polo-like kinase-1) но остатку Ser4, а замена этого аминокислотного остатка в последовательности нуклеофозмина на остаток аланина приводит к митотическим аберрациям с множественной полярностью, обусловленной аномальным содержанием центросом в митотической фазе [Zhang et al., 2004]. В настоящее время известно, что нуклеофозмин участвует в созревании и дупликации центросом. На границе фаз Gj/S клеточноіо цикла фосфорилирование киназой циюшн E/CDK2 регулирует способность нуклеофозмина связываться с центросомами [Tokuyama et al., 2001]: будучи фосфорилированным по Thr199, изоформа В23.1 диссоциирует из комплекса с центросомами, тем самым инициируя процесс их редупликации [Okuda, 2002; Tarapore et al, 2002]. Иигибирование фосфорилирования белка циклин E/CDK2 с помощью моноклональных антител блокирует дупликацию центросом и приводит к митотическим аберрациям [Okuda et al., 2000]. Однако неизвестно, какую именно роль нуклеофозмин иірает в этом важном клеточном событии. И]интерфаэа [2]профаза [3]пР0МвтаФаза Щметафаза Авторы только предполагают, что белок В23 вовлечен в стабилизацию перицентриолярного материала и блокирует его перестройку накануне дупликации. Иммуноцитохимическими методами in situ было показано [Zatsepina et al., 19976], что в митотических клетках нуклеофозмин локализуется в четырех основных зонах: в цитоплазме, рибонуклеопротеидном перихромосомальном слое, полюсах деления и в фиброгранулярных цитоплазматических гранулах NDF (nucleolar derived foci)/PNB (prenuclear bodies) - фиброгранулярных рибонуклеопротеидных преядрышковых телах, причем локализация нуклеофозмина изменяется в течение митотического периода (рис. 5). В раннем митозе (профазе), где начинается дезинтеграция активной ядрышковой структуры, происходит равномерное перераспределение основной части белка В23 в нуклеоплазму, а после реорганизации ядерной оболочки в прометафазе - в цитоплазму, где он локализуется в течение всего безъядерного периода деления клетки [Zatsepina et al., 1997].
Однако, вместе с доминирующим цитоплазматическим пулом, часть митотического нуклеофозмина всегда наблюдается в митотическом аппарате: перихромосомальном слое и полюсах деления, где он взаимодействуя, очевидно, с белками цитоскелета [Zatsepina et al., 1999; Okuda et al., 2000]. Было показано, что уровень фосфорилирования нуклеофозмина в цитоплазме значительно выше, чем в перихромосомальном слое и полюсах деления [Okuwaki et al., 2002] В поздней анафазе in situ наблюдалось одновременное ослабление сигнала белка В23 в полюсах деления и значительное усиление его сигнала в перихромосомальном слое, сопровождающееся образованием цитоплазматических частиц PNB - преядрышковых производных, также содержащих белок В23 [Zatsepina et al, 19976]. В ранней телофазе, с началом восстановления ядерной оболочки, гранулы PNB активно скапливаются в нренуклеарной области цитоплазмы и сливаются с ЯОР (ядрышко-организующие районы) до их полного исчезновения на границе M/G1 периодов, что косвенно подтверждает гипотезу об их участии в инициации сборки ностмитотических ядерных структур в телофазе [Zatsepina et al, 1997а] По мере восстановления ядерной оболочки наблюдалось постепенное исчезновение сигнала белка В23 в цитоплазме до полного исчезновения в цитоплазме в G1 периоде. Этот процесс совпадает с распадом комплекса циклин E/CDK 2, осуществляющего фосфорилирование нуклеофозмина в митозе, 1.2,2. Структура и свойства нуклеофозмина при апоптозе Апоптоз, или программируемая клеточная гибель, является механизмом, который служит для избирательного удаления клеток и играет важную роль в жизненном цикле высших эукариот [Kerr et al., 1972]. Апоптоз является энергетически активным, іенетически контролируемым процессом, который служит для элиминации дефектных или поврежденных клеток, а также выполняет роль биологических "часов" клетки, ограничивающих время ее жизни. Клеточная аноитотическая машина реагирует на разнообразные сшналы со стороны окружения и внутренних сенсорных молекул, контролирующих целостность клетки. В случае если клетка потеряла контакт с окружением или получила нереиарируемые внутренние повреждения, запускается соответствующая программа аионтоза Апоптоз индуцируется также поступлением противоречивых сигналов от систем, управляющих клеточным циклом. При апоптотической шбели происходит уменьшение формы клетки, конденсация и фрагментация хроматина (образуются так называемые апоптотические тельца), уплотнение цитоплазматической мембраны без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Путем программируемой клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом.
Свойства SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa
Практически все свойства олигомеров нуклеофозмина были изучены на гомоолигомерах, образованных экспрессированными изоформами В23.1 или В23.2 [Umekawa et al., 1993; Herrera et al., 1996; Okuwaki et al., 2002], однако состав и свойства олигомеров, функционирующих in vivo (особенно в опухолевых клетках) может быть иным. Так, во-первых, in vivo нуклеофозмин может образовывать, кроме гомоолигомеров, гетероолигомеры различного состава, обладающие разными свойствами; во-вторых, олигомеры нуклеофозмина, образованные его экспрессированными формами, не обладают устойчивостью к SDS (так же, как и эндогенные формы нуклеофозмина в нормальных Нами было показано (рис. 12), что на стабильность SDS-устойчивых форм нуклеофозмина, характерных для опухолевых клеток, не оказывает влияния обработка восстанавливающими аіентами, ДНКазой I, РНКазой А, ЭГТА, ЭДТА, 1 М NaCl. Согласно литературным данным [Umekawa et al., 1993; Herrera et al., 1996] все перечисленные факторы не оказывают действия и на SDS-чувствительные олигомеры нуклеофозмина, что было показано методами электрофоретическою и седиментационного анализов и гель-фильтрации. Было также показано методом седиментационного анализа [Herrera et al., 1996], что для сохранения олигомернои структуры нуклеофозмина важное значение имеет ионный состав среды: так, например, олигомеры, образованные экспрессированными формами белка, сохраняются в буферах, содержащих не менее 100 мМ NaCI/KCl или не менее 0.1 мМ MgCh. Данные о влиянии ионною состава среды на стабильность SDS-устойчивых олигомеров нуклеофозмина отсутствуют.
Мы исследовали влияние изменения ионной силы iid стабильность SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина, инкубируя суспензию клеток HeLa в PBS и PBS, разбавленном в 2-Ю раз (буферах, содержащих только соли одновалентных катионов) (табл. 1). Интерес к состоянию олигомерных форм белка в буферах низкой ионной силы был не случаен, так как с одной стороны, в большинстве применяемых методов инкубирование клеток в буфере низкой ионной силы (эквивалентной ионной силе десятикратно разбавленного PBS) является одной из стадий, необходимой для дальнейшего выделения фракций интактных ядер/ядрышек [Andersen et al., 2002; Sherl et al., 2002], а с другой стороны, было показано [Zatsepina et al., 1997a], что при выдерживании клеток в буферах низкой ионной силы (например, при пятикратном разбавлении PBS) наблюдается транслокация белка В23 в нуклеоплазму. Анализ иммуноблотов лизатов клеток, инкубированных в буферах различной ионной силы (разбавление PBS в 2-Ю раз) показал, что при понижении ионной силы буфера происходит постепенный распад SDS-устойчивых олигомеров нуклеофозмина до мономерных форм (рис. 13) и при десятикратном разбавлении белок был детектирован только в мономерной форме (рис. 13, дор. 5). Однако при добавлении в десятикратно разбавленный PBS ионов магния свыше 3 мМ SDS-устойчивые олигомеры нуклеофозмина сохраняются, причем чем выше концентрация MgCh, тем выше содержание олигомеров белка (рис. 14). Состояние мономерных и олигомерных форм нуклеофозмина в присутствии 5 мМ MgCh (в десятикратно разбавленном PBS) такое же, как и в неразбавленном PBS, не содержащем Mg (рис. 14, дор. 3), а в присутствии 7 мМ MgCh возрастает не только содержание, но и число SDS-устойчивых олигомеров (рис. 14, дор. 4), причем дальнейшее увеличение концентрации MgCh ( 7 мМ) не изменяет соотношение мономерных и олигомерных форм нуклеофозмина. Аналогичные результаты были получены и при инкубации клеток HeLa в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4, с различным содержанием Mg2+. Число и содержание SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина еще больше увеличивается, если аналогичную концентрацию MgCL (7мМ) добавить в неразбавленный PBS (рис. 14, дор. 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что ионный состав среды важен для стабилизации SDS-устойчивых олигомеров нуклеофозмина в лизатах клеток HeLa. Таким образом, нами было показано, что свойства SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина сопоставимы со свойствами олигомерных форм белка, чувствительных к обработке SDS. Тогда в чем же может быть причина появления в опухолевых клетках олигомерных форм нуклеофозмина, устойчивых к детергенту? В работе (Ulanet et а!., 2003) наличие SDS-устойчивых форм нуклеофозмина в клетках гепатокарциномы человека авторы связывают с появлением в этих клетках, возможно, укороченных форм этого белка, обладающих необычайно высокой склонностью к олигомеризации В связи с этим, чрезвычайно важным становится проведение структурного анализа изоформ нуклеофозмина в опухолевых клетках. 2.3. Структурный анализ нуклеофозмина в клетках HeLa Для оценки структуры и свойств различных белков, функционирующих в клетках in vivo, становится необходимым поиск методов их выделения, поскольку свойства экспрессированных иолипентидов часто отличаются от свойств эндогенных белков В частности, это может быть обусловлено многообразными пост-траисляционными модификациями. Особенно сложная ситуация в опухолевых клетках, где в последнее время показано, что ряд ключевых белков не только экспрессируется в большем количестве, но и подвергается структурным изменениям, специфичным для опухолевых клеток [Cordell et al., 1999; Ulanet et al., 2003a]. Характер этих изменений весьма разнообразен.
Появление новых форм белков в малигнезированных клетках может быть связано с изменениями как на і емком уровне (хромосомные транслокации, приводящие к образованию гибридных (fusion) белков, альтернативный сплайсинг), так и на белковом уровне (характерные химические модификации, Ы-/С-концевой нропессикг). Образующиеся в опухолевых клетках белки часто обладают измененной конформацией, что обуславливает их новые свойства и локализацию. Одним из таких ключевых белков, несомненно, является нерибосомпый ядрышковый нуклеофозмин. Так, выявлено, что опухолевые клетки печени человека характеризуются наличием SDS-устойчивых олигомерных форм белка В23, чувствительных к расщеплению гранзимом В В то же время в нормальных клетках печени олигомерные формы нуклеофозмина, хотя и образуются, но не чувствительны к действию гранзима В и могут быть видны только в условиях "патишюго" гель-электрофореза [Ulanet et al,, 2003а]. При ряде лейкозов выявлено также характерное изменение структуры нуклеофозмина, обусловленное хромосомными транслокациями. В этих клетках были детектированы смешанные (fusion) белки, такие как NPM-ALK [Moms et al, 1994], NPM-RAR [Redner et al., 1996], NPM-MLF1 [Yoneda-Kato et al,, 1996], также имеющие высокую склонность к образованию весьма устойчивых к обработке SDS олигомеров [Cordell et al, 1999]. Согласно имеющимся у нас литературным данным проводился анализ форм нуклеофозмина, локализованных только в ядрышках. Методом MALDI-масс-спектрометрии при протеомном анализе ядрышек клеток HeLa была идентифицирована изоформа В23.1 [Andersen et al., 2002; Sherl et al, 2002], Изоформа B23.2 на белковом уровне в клетках человека в настоящее время не выявлена Вывод о наличии двух изоформ делается, в основном, но выявлению методом иммуноблотов дублета полос характерною молекулярного веса, а не прямым структурным анализом. Однако, как было показано в ряде работ, в виде дублета полос может детектироваться и изоформа В23.1 при различном уровне ее фосфорилирования [Zhang et al,, 2004; Okuwaki et al., 2002] Трудность идентификации изоформ может объясняться тем, что анализ нуклеофозмина только в составе ядрышек недостаточен, так как известно, что в опухолевых клетках человека этот белок был детектирован не только в ядрьпиках, но и также в нуклеоплазме и в составе ядерною матрикса [Mattem et al., 1996; 1997]. Кроме того, локализация нуклеофозмина может изменяться в процессе выделения ядер/ядрышек (в частности, при использовании буферов низкой ионной силы) [Zatsepina et al., 1997а] Принимая во внимание возможность существования нескольких структурных форм нуклеофозмина, локализация которых может быть различна, необходимо определить состояние белка в составе не только ядрышек, но и ядер клеток HeLa .
Структурный анализ нуклеофозмина в составе ядер клеток HeLa
Поскольку предметом нашего исследования является нуклеофозмин (М 37-40 кДа), то особое внимание мы уделили белкам зоны 35-40 кДа (рис. 21, дор 8, полосы 4-6). В полосе 6 с помощью метода MALDI-масс-спектрометрического анализа был идентифицирован hnRNP А2/В1, структурная характеристика которого представляет несомненный интерес. К сожалению, метод MALDI-масс-спектрометрического анализа не позволил нам определить, какая из изоформ (А2 или В1), являющихся продуктами альтернативною сплайсинга одного гена и различающихся лишь в N-концевом домене [Kozu et a!., 1995], входит в состав фракции супернатанта. Гетерогенные ядерные рибонуклеопротсины участвуют в связывании, процессинге и транспорте мРНК [Drcyfuss et а!., 1993; Не et al., 2005], но, тем не менее, hnRNP А2/В1 был детектирован также в ядрышках клеток HeLa [Andersen et al, 2002; Sherl et al., 2002]. В опухолевых клетках увеличена экспрессия обеих изоформ [Fielding et al., 1999], а изоформа Bl является ранним маркером рака легких [Sueoka et al,, 2001]. Стоит отметить, что ни одна из изоформ hnRNP А2/В1 на белковом уровне не охарактеризована. Для их идентификации был проведен анализ N- и С-концевых аминокислотных последовательностей белка полосы 6. Методом секвенирования была определена последовательность девяти N-концевых аминокислотных остатков, совпадающая с аминокислотной последовательностью hnRNP Bl: 3KTLETVPLEn, свидетельствующая о наличии N-концевого процессиш а этой изоформы в клетках IleLa (рис. 24). Анализ С-концевой последовательности белка с помощью карбоксипептидазы А позволил идентифицировать аминокислоту тирозин, совпадающую с С-концевым аминокислотным остатком hnRNP Bl (согласно структуре, определенной на основании последовательности кДНК) что свидетельствует об отсутствии С-концевого процессшгга. Таким образом, впервые нами было установлено, что в клетках HeLa hnRNP Bl подвергается N-концевому процессингу и установлен его характер.
Согласно данным MALDI-масс-спектрометрического анализа нуклеофозмин был детектирован в белковых полосах 4 и 5 (табл. 2), причем два из идентифицированных триптических пептидов, детектированных в обеих полосах (рис. 23) принадлежали С-концевому домену, характерному только для изоформы В23.1 [Li et al, 1989; Okuwaki et al., 2001] На основании данных MALDI-MdCC-спектрометрического анализа мы не смогли сделать вывод о присутствии или отсутствии изоформы В23.2, вследствие полной идентичности изоформ нуклеофозмина на участке полипептидной цепи 1-257 (рис. 32) и присутствии лишь двух дополнительных отличающихся аминокислотных остатков в С- концевом домене изоформы В23.2 [Li et al., 1989; Okuwaki et al., 2001]. Как видно из рис. 23, С-концевые аминокислотные последовательности изоформ нуклеофозмина различны и теоретически их идентификация возможна на основании анализа отщепленных карбоксипептидазами аминокислот. Так как, согласно данным MALDI-масс-спектрометрии, белковая полоса 4 содержала только нуклеофозмин (в то время как полоса 5 - смесь нуклеофозмина и GAPDH), то она явилась оптимальным объектом для подбора условий гидролиза С-концевых аминокислотных остатков с помощью карбоксипептидаз. Была проведена серия аналитических экспериментов, с варьированием набора карбоксипептидаз (А, В, Y), рН буфера и времени гидролиза. Оптимальными условиями оказалось проведение одноступенчатого гидролиза (0.2 М N-этилморфолинацетатный буфер, рН 8.5) с использованием ср А, так как эти условия соответствуют минимальному отщеплению дикарбоновых кислот (поскольку С-концевым аминокислотным остатком GAPDH, содержащейся в полосе 5, является остаток Glu). Анализ отщепленных карбоксипептидазой А аминокислот и сравнение их с известными С-концевыми аминокислотными последовательностями изоформ В23.1 и В23.2 позволил нам С помощью метода MALDI-масс-спектрометрии и анализа С-концевых аминокислотных остатков последовательность, принадлежащая изоформе В23 1, была идентифицирована в составе двух белковых полос, имеющих различную электрофоретичекую подвижность Проведение электрофореза в 15% ПААГ в течение продолжительного времени позволило нам также детектировать две полосы в области 37-38 кДа (рис. 25), однако они настолько близки по электрофоретической подвижности, что проведение структурного анализа отдельной белковой полосы пока не представляется возможным Наличие двух форм В23.1 может быть обусловлено различными причинами (пост-трансляционными модификациями, существованием в клетках IleLa дополнительных изоформ нуклеофозмина). Так, например, в клетках человека недавно была идентифицирована кДНК, кодирующая нуклеофозмин (обозначенный авторами, как В23.1, изоформа 2) с делецией на внутреннем участке полипептидной цепи аминокислотных остатков 195-223 (экзон 8) [Strausberg et al., 2002]. Следует отметить, что в клетках HeLa с помощью двумерного электрофореза были идентифицированы три формы нуклеофозмина: одна доминантная - а (37 кДа, pi 5.1) и две минорные - Р (35 кДа, pi 5.1) и у (35 кДа, pi 5.3), причем обе более низкомолекулярные формы были преимущественно локализованы в нуклеоплазме [Chan et al., 1985].
При проведении анализа N-концевой аминокислотной последовательности белков методом секвенирования (до и после деформилирования), в полосе 4 на первых 11 шагах деградации по методу Эдмана не были обнаружены ФТГ-аминокислоты, а в полосе 5 была детектирована только последовательность аминокислотных остатков, соответствующая N-концевой аминокислотной последовательности GAPDH [Tso et al., 1985; Gevaert et al., 2003]. Полученные данные позволили нам предположить, что N-концевой аминокислотный остаток нуклеофозмина блокирован защитной группировкой (вероятно, ацетильной). После деацетилирования иммобилизованных на мембране иммобилона Р белков (рис. 24) как в полосе 4, так и в полосе 5 методом секвенирования была детектирована последовательность аминокислотных остатков, соответствующая последовательности нуклеофозмина 10SPLRPQNYLFG20. Кроме того, в полосе 5 была также детектирована аминокислотная последовательность, соответствующая N-концевой аминокислотной последовательности GAPDH и совпадающая с последовательностью этого белка до деацетилирования. Таким образом, нами были впервые определены N- и С-концевые аминокислотные последовательности нуклеофозмина в клетках HeLa. В работе (Ulanet et а!, 2003) авторы предположили, что в опухолевых клетках нуклеофозмин может иметь укороченную (по сравнению с последовательностью, выведенной из структуры кДНК) N-концевую аминокислотную последовательность, что и обусловливает существование SDS-устойчивых олигомеров белка в этих клетках. Согласно полученным нами данным N-концевая аминокислотная последовательность нуклеофозмина в клетках HeLa, действительно, укорочена на 9 аминокислотных остатков. Конечно, мы не можем утверждать, что все формы нуклеофозмина в клетках HeLa имеют подобную N-концевую аминокислотную последовательность, поскольку была проанализирована лишь часть белка, экстрагируемая из ядра, то время как существуют также формы нуклеофозмина, локализованные в ядрышке и не экстрагируемые в этих условиях. При проведении протеомного анализа ядрышек клеток HeLa с помощью MALDI-масс-спектрометрии Андерсеном и соавт., (2002) был идентифицирован N-коіщевой триптический пептид нуклеофозмина, начинающийся с Met1. Возможно, в клетке могут существовать формы нуклеофозмина, имеющие различные N-концевые аминокислотные последовательности. Полученные нами данные о наличии в клетках HeLa различных типов (чувствительных и устойчивых к обработке SDS) олигомериых форм нуклеофозмина также свидетельствуют в пользу этого предположения. На основании полученных нами результатов можно предположить, что в опухолевых клетках существуют различные структурные формы нуклеофозмина, которые могут образовывать олигомерные формы, обладающие различными свойствами. 2.4. Состояние мономерных и SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина в клетках HeLa при апоптозе, индуцируемом TNF-a Нуклеофозмин является одним из белков ядрышка, вовлеченных в процесс апоптоза.
Изменения нуклеофозмина при апоптозе
Анализ иммупоблотов нуклеофозмииа показал, что в клетках HeLa, обработанных только TNF-u или только эметином даже в течение 6 ч, как и в случае UBF, содержание нуклеофозмииа и ею мономер-олигомерное состояние не изменяется по сравнению с контрольными клетками (рис. 32, дор 1-3). Интересно отметить, что в клетках, обработанных смесью TNF-a и эметина в течение 2 ч (где происходит частичный протеолиз UBF с образованием стабильного 76 кДа фрагмента), также не выявлено заметных различий в состоянии нуклеофозмина по сравнению с контрольными (рис. 32, а, дор. 4). И только в клетках, обработанных смесью TNF-a и эметина в течение 6 ч было детектировано изменение состояния нуклеофозмина, которое наиболее ярко выражено во фракции апоптотических клеток (где процент апоптозных ядер составляет 100% и детектируется только 76 кДа-фрагмент UBF). В этой фракции (рис. 32, б, дор. 5) изменялось соотношение мономерных и SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина: содержание мономерных форм уменьшалось, а содержание SDS-устойчивых олигомерных форм белка увеличивалось и появлялись две дополнительные (по сравнению с лизатами контрольных клеток) белковые полосы в зоне олигомеров с меньшей (-180-200 кДа) молекулярной массой (при нанесении на дорожки одинакового количества суммарного клеточного белка). Уменьшение содержания мономерной формы нуклеофозмина может быть обусловлено, в частности, протеолизом. В ряде работ показано [Ulanet et al., 2003а; Hsu and Yung, 2000; Chou and Yung, 2001; Tawfic et al., 1993; 1995], что в ходе апоптоза белок В23 подвергается протеолитическому расщеплению, приводящего к образованию устойчивого к протеолизу фрагмента - 21-22 кДа. Для выявления возможных протеолитических фрагментов нуклеофозмина при TNF-a/эметин - индуцируемом апоптозе в клетках HeLa, нами был проведен иммунохимический анализ белков фракции флотирующих апоптотических клеток после их разделения в 15% ПААГ, позволяющий детектировать мономерную форму белка (-38-40 кДа) и его низкомолекулярные фрагменты (М 6 кДа). Поскольку известно, что скорость электропереноса зависит от молекулярной массы белков, мы варьировали время блотирования. Анализ иммуноблотов (рис. 33) показал, что увеличение времени блотирования от 20 мин до 3 ч приводит лишь к возрастанию количества мономерной формы нуклеофозмина, более низкомолекулярные фрагменты белка не детектируются, при этом мы наблюдали эффективный электроперенос смеси белковых стандартов.
Однако этот факт, строго говоря, не позволяет полностью исключить протеолиз нуклеофозмина, так как в результате гидролиза могут образовываться и более низкомолекулярные антиген - содержащие пептиды и, кроме тою, структура самой антигенной детерминанты может быть нарушена. Уменьшение содержания мономерной формы нуклеофозмина при апоптозе, вероятно, обусловлено сдвигом мономер-олигомерного равновесия в сторону образования олиюмеров. Поэтому мы решили выяснить, существует ли апоптоз-индуцированное уменьшение тотальною содержания нуклеофозмина с помощью смещения его мономер-олигомерного равновесия в сторону мономерной формы. Из литературных данных [Umekawa et al., 1993; Ilerrera et a!., 1996] и no результатам нашей работы показано, что увеличение длительности термообработки образцов для электрофореза в лизирующем буфере способствует распаду олигомерных форм нуклеофозмина (рис 8). Образцы для электрофореза мы термостатировали не 1 мин, а 5 мин при 80 С. Белки разделяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ (условиях, оптимальных для разделения мономеров нуклеофозмина). Как видно из рис. 34, в этих условиях наблюдается частичный распад олигомерных форм нуклеофозмина как в контрольных, так и в обработанных клетках, при этом интенсивности остаточных олигомерных форм нуклеофозмина и его мономерных форм такие же, как и в контрольных клетках (рис 34, дор. I, 6). В апоптозиых клетках, где происходит протеолиз UBF (рис. 32, 6, дор. 4, 5), распад олигомеров нуклеофозмина сопровождается появлением на иммуноблотах дополнительной полосы в зоне мономеров с большей элепрофоретической подвижностью (рис. 34, дор. 4-6), интенсивность которой невелика, но возрастает пропорционально доле клеток с апоптозньши ядрами. Возможно, это свидетельствует о существовании апоптоз-специфической формы (или форм) нуклеофозмина, поскольку появление этой полосы может быть связано с химическими модификациями полипептидной цепи (ацетилирование, фосфорилирование и тд), индуцированными аиоитотическим каскадом или отщеплением в ходе апоптоза короткого N/C-концевого пептида.
Так, было выявлено, что в ходе апоптоза уменьшалась степень фосфорилирования нуклеофозмина [Tawfic et al., 1995] и было показано, что фосфорилированная и дефосфорилированная формы белка В23.1 проявляются в виде дублета полос на иммуноблотах, имеют различную внутриядрышковую локализацию и свойства [Okuwaki et al., 2002]. Эти данные вместе с полученными нами ранее результатами делают маловероятной версию о возможном протеолизе нуклеофозмина во время индуцированного смесью TNF-a/эметин апоптоза клеток HeLa (хотя нельзя полностью исключить, что протеолиз может охватывать отдельную форму или формы нуклеофозмина). Полученные в данной работе результаты согласуются с результатами работ по изучению апоптоза клеток HeLa, индуцированного камптотецином [Martelli et al., 2000] и клеток Jurkat, обработанных CD-95 [Casmno et aL, 1996; Casiano and Tan, 1996; Torres-Montaner et al., 2000], где было отмечено расщепление UBF и отсутствие нротеолиза нуклеофозмина. Причем в одной из этих работ [Torres-Montaner et al., 2000] было показано, что концентрация нуклеофозмина не изменяется даже при полном протеолизе UBF. К сожалению, структурная характеристика новой апоптоз-спеиифической формы нуклеофозмина в данной работе не была проведена (из-за ее низкого содержания), однако представляет несомненный интерес. Возможно, что именно наличие этой новой формы белка и обуславливает изменение соотношения мономерных и олигомерных форм и появление дополнительных олигомеров нуклеофозмина во фракции апоптотических клеток Таким образом, нами было показано, что UBF и нуклеофозмин проявляют различный характер апоптоз-индуцированных изменений при TNF-индуцированном апоптозе в клетках HeLa. В отличие от UBF, который подвергается протеолитическому расщеплению с образованием стабильного 76 кДа-фрагмента, нуклеофозмин не расщепляется. Однако в апоптотических клетках изменяется его мономер-олигомерное состояние: увеличивается содержание и число SDS-устойчивых олигомерных форм нуклеофозмина, что, возможно, связано с появлением в этих клетках апоптоз-специфической формы/форм белка. Можно пока только предположить, что у ряда белков, представленных подобно нуклеофозмину в виде нескольких изоформ и склонных к образованию семейства гомо- и гетероолиюмеров, структурные изменения могут охватывать не тотальную фракцию белка, а ею отдельные структурные формы В связи с этим, необходимо дальнейшее изучение структуры нуклеофозмина, функционирующего в опухолевых клетках.
