Содержание к диссертации
Введение
1. Введение: Постановка исследования и его цель 4
2. Литературный обзор: Химическое строение и биологические свойства лшшда А грамотрицательных бактерий 6
1. Химическое строение и биосинтез липида А І.Т. Липид А как структурный компонент липополисаха- ридов грамотрицательных бактерий 6
1.2. Выделение липида А и его гетерогенность 7
1.3. Общая характеристика липида А 8
1.4. Структура углеводного скелета 9
1.5. Характеристика фосфатных групп липида А 14
1.6. Определение типа связи липида А с КДО 15
1.7. Гидрофобная часть липида А: жирные кислоты 16
1.8. Структура липида А из различных источников 18
1.9. Биосинтез липида А 22
2. Биологические свойства липида А
2.1. Эндотоксические свойства 24
2.2. Липид А как стимулятор неспецифической резис-. тентности 29
2.3. Иммунологические свойства лшшда А 30
3. Заключение: Связь химической структуры с биологическими свойствами липида А 34
3 Обсуждение результатов 37
1. Выделение и общая характеристика липида А 38
2. Структура углеводного скелета липида А псевдотуберкулёзного микроба 39
3. Жирные кислоты лшшда А псевдотуберкулезного микроба 44
4. Гетерогенность лшшда А 51
5. Определение характера связи остатков жирных кислот с углеводным скелетом липида А 55
6. Определение положения фосфатных групп в липиде А псевдотуберкулезного микроба 58
7. Использование спектроскопии хиС-ЯМР для структурного исследования липида А 60
8. Сравнительная характеристика липида А различных сероваров 77
9. Иммунологические свойства липида А псевдотуберкулез ного микроба и структура его детерминантной группы 78
4. Экспериментальная часть 84
Выводы 99
- Выделение липида А и его гетерогенность
- Гидрофобная часть липида А: жирные кислоты
- Иммунологические свойства лшшда А
- Гетерогенность лшшда А
Выделение липида А и его гетерогенность
Существует два принципиальных подхода к получению липида А. Известно большое количество мутантних штаммов, которые синтезируют дефектные ЛПС, содержащие только липид А и 2-кето-З-дезок-сиоктоновую кислоту (КДО). Такие гликолипиды представляют собой хороший исходный материал для исследования липида А [24-29] Во втором случае липид А может быть выделен из любого ЛПС кислотным гидролизом. Эта обработка разрывает кетозидную связь, с помощью которой липид А соединяется с олигосахаридом кора [30J Показано [31-42], что условия выделения липида А кислотным гидролизом зависят от бактериального источника ЛПС, По-видимому, возможен ещё один способ получения липида А - биодеградация ЛПС. Так, например, ЛПС Escherichia coli, Shigella flexneri u Salmonella minnesota ПОД ДЄЙСТВИЄМ КИШЄЧНОГО COKa улитки Helix pomatia теряют антикомплементарную активность и изменяют подвижность в полиакриламидном геле [43]. Предполагается, что кишечный сок улитки удаляет часть (или весь) липида А. Несколько раньше были получены подобные результаты с плесенью Dic tyosteiium discoideum, под действием которой наблюдалось удаление из ЛПС жирных кислот со сложноэфирной [44] или амидной [45] связью. Многочисленными исследованиями [4, 7, 32, 40, 46-50] показано, что липид А негомогенен и может быть разделен на несколько фракций хроматографией в тонком слое, колоночной хроматографией и другими методами. Установлено, что липид А может отличаться гетерогенностью уже в составе ЛПС [32J # Эта внутренняя микрогетерогенность липида А обнаружилась, когда н-гликолипиды изучались хроматографией в тонком слое [32] При этом было выделено несколько фракций различного состава. Как показало изучение структуры предшественников липида А [53, 54], условия культивирования микроорганизмов могут стать причиной гетерогенности, приводя к образованию замещенных или незамещенных полярными заместителями дифосфорилированных производных Ё -1,6-глюкозамннобиозы, как, например, в липиде А рода salmonella, содержащем от 10 до 20$ 4-аминоарабинозы [51], или В ЛИПИДе А ЕпойопасгоМша vannielii, В КОТОрОМ 30$ МОЛвКуЛ ДИ- сахарида замещено остатками маннопиранозы f 52] Поскольку липид А содержит связи различной устойчивости к действию кислоты, неизбежна деградация некоторых, особенно лабильных участков при гидролизе ЛИС, что приводит к образованию сложной смеси [32] Нельзя исключать также непропорциональное распределение остатков жирных кислот, вызванное присутствием свободных гидроксильных групп в липиде А [52].
В ряде работ отмечено влияние температуры продуцирования микроорганизмов [55-57J и набора жирных кислот в питательной среде [40] на жирнокислотный состав липида А, что также может стать причиной его гетерогенности. 1.3 Общая характеристика липида А Накопленные ранее данные показывают, что образцы липида А, выделенные из самых различных бактерий, идентичны между собой или родственны в отношении их общей структуры и состава [4, 6, 7, 18, 58]; Неочищенный липид А, полученный мягким кислотным гидролизом, представляет собой смесь фракций, разделимых с помощью экстракции [32], осаждения [32] или хроматографии: колоночной - на си-ликагеле [13, 26, 32, 46] , сефадексе LH-20 І26, 36, 37J , се-фадексе G-25 [47J, тонкослойной С37, 48, 59, 60J или жидкостной [37]. Очищенный липид А нерастворим в воде, ацетоне, метаноле, растворим в хлороформе, смеси хлороформ-метанол, пиридине [43. Он не имеет точки плавления, характеризуется отрицательными значениями удельного вращения [46]. ИК-Спектроскопия липида А указывает на присутствие сложноэфирных (1730 см ) и амидных (1640, 1560, 730 см") связей [26, 46]. Исследования различных лабораторий [4, 7, 18, 25J свидетельствуют о наличии в липиде А трех основных составлякщих: глю-козамина (до 20$), фосфора (2%) и жирных кислот (60$). Пептиды и фосфолипиды, также присутствующие в липиде А в небольших количествах, либо образуют с ним комплексы [61, 62], либо связаны ковалентно [63-66J. Полиамины, такие как путреепин, кадаверин, спермидин, и катионы (На+, кг1", Са +, ig 1") также присутствуют в заметных количествах и могут быть удалены из ЛПС высоковольтным электрофорезом, ионообменной хроматографией [49] или электродиализом [67, 68]. Таким образом, анализ липида А указывает на его амфипатич-ность, обусловленную присутствием как гидрофобных (жирные кислоты), так и гидрофильных (глюкозамин, фосфор) составляющих. 1.4. Структура углеводного скелета в -1йюкозамин является важной составляющей липида А, хотя к настоящему времени известны ЛПС, липид А которых не содержит глюкозамин [20, 34, 38, 69, 70]. Из молекулярной массы липида А (около 2 кд) [25, 71] следует, что в его состав входят два остатка, глюкозамина. Строгое доказательство дисахаридной природы углеводного скелета липида А было получено обработкой ЛПС из Re-мутанта s. minnesota гидразином и выделением среди других фрагмен-тов фосфорилированного пентасахарида следующего строения: -1,6-Глюкозаминобиоза, входящая в состав этого пентасахарида, рассматривается как углеводный скелет липида А. Её невосстанав-ливающий конец находится в пиранозной форме, Гидроксильная группа при СЗ этого остатка глюкозамина участвует в образовании связи между липидом А и олигосахаридом кора [30] Существенный вклад в изучение углеводного скелета липида А был сделан с развитием современных физико-химических методов исследования.
В 1976 г. была разработана схема выделения и анализа углеводного скелета липида А, использующая метод хроматонаасс-спектрометрии [19]. Как показывает рис. I, она включает деградацию ЛПС щелочной обработкой, мягкий кислотный гидролиз, восстановление, гидролиз с последующим высоковольтным электрофорезом и N-ацетилированием. Восстановленный дисахарид из остатков N-аце-тил-і)-глюкозамина подвергали метилированию и гидролизу с последующим анализом образующихся метилированных Сахаров хромато-масс-спектрометрией соответствующих ацетатов полиолов [72] В результате было установлено наличие -1,6-гликозидной связи между остатками глюкозамина в изучаемых образцах липида А [19]. -Конфигурацию связи в дисахаридах определяли с помощью ферментативного гидролиза jS-N-адетилглюкозаминидазой [19, 45, 73]. Интерпретация данных хромато-масс-спектрометрии соединений, полученных по описанной выше схеме (Рис. I [19]), осложняется тем, что образуются не только ожидаемые и-метилацетамидо-, но и №-ацетилацетамидопроизводные глюкозамина, расположенного на восстановленном конце дисахарида [72]. Поэтому впоследствии схема деградации была модифицирована [74]. Оказалось, что восстановленные пермегилированные к-ацетил-в-глюкозаминобиозы, отличающи- еся конфигурацией и типом (1,3-, 1,4- и 1,6-) связи между остатками глюкозамина, могут быть успешно разделены с помощью газо-жидкост-ной хроматографии. В масс-спектрах этих соединений присутствуют характеристичные фрагменты, позволяющие однозначно определить порядок гликозидной связи. Закономерности, полученные в [74], использовались ДЛЯ установления Структуры ЛИПИДа A Boruetella pertussis [75J . В последнее время широкое применение в структурных исследованиях биополимеров нашел метод спектроскопии хиС-ЯМР. Его использование для изучения структуры углеводного скелета липида А [76, 77 J имеет определенные преимущества, поскольку не требует трудоёмкой и многостадийной процедуры и дает возможность определить не только тип связи, но и её конфигурацию. Недавно [28, 29] было проведено определение структуры углеводного скелета липида А без предварительной деградации соответ-ствующего ЛПС. Авторы использовали метод спектроскопии хоС-ЯМР для анализа структуры гликолипида из й-мутанта Е. сої І. Спектры снимали в присутствии диметилсульфоксида, этилендиаминтетра-уксусной кислоты и триэтиламина, чтобы уменьшить мицеллообразо-вание, характерное для амфипатических соединений, и повысить их растворимость. В результате оказалось возможным определить не только тип и конфигурацию связи между остатками глюкозамина, но и доказать -конфигурацию восстанавливающего конца дисахарида.
Гидрофобная часть липида А: жирные кислоты
Нормальные и оксикарбоновые кислоты с длинной углеродной цепью являются обязательными компонентами липида А и определяют его гидрофобные свойства [3, 4, 7, 16-18, 20, 21, 29, 31, 37, 38, 40, 45, 52, 71, 73, 78, 80-83] . Среди кислот, присутствующих в липиде А различного происхождения, обнаружено большое их разнообразие [4] Циклопропановые и ненасыщенные жирные кислоты не характерны для липида А. В гидролизатах липида А или ЛПС присутствуют Лф - и к /-ненасыщенные кислоты, но они получаются в результате деградации оксикислот во время гидролиза [90, 91] Недавно появились сообщения [42, 52, 82J о присутствии ненасыщенных жирных кислот в липиде А. В одном из них [ 42J обнаружена 8-октадеценовая, в другом [82] - 7-тетрадеценовая кислоты. В липиде A R. vannieiii [52] присутствует Л -докозено-вая кислота. Как правило, 3-оксикислоты преобладают среди жирных кислот липида А. В большинстве случаев они составляют 50-75$ от общего содержания КИСЛОТ. Однако В ЖС Aerobacter aerogenes [4] 3-оксикислоты составляют всего 6$, а В ЛПС Brucella u Fusobacterium necroferum ОНИ ВООбще ОТСУТСТВУЮТ [4J. Жирные кислоты присоединены в липиде А к углеводному скелету сложноэфирными и амидными связями [4, 7]. Среди кислот со сложноэфирной связью преобладают насыщенные, неразветвленные с четным числом атомов углерода нормальные и 3-оксикислоты [4, 7І. Жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода обнаружены в липиде А рода Veillonella [92, 93] , а В ЛИПИДе А ИЗ ЛПС Myxobac- teria [21], Xanthomonas [94] ив. pertussis [95j ИДентИфВДИ- рованы изоразветвяенные 3-оксикислоты. В состав липида А из рада источников входят 2-оксикарбоновые кислоты различной длины цепи [94-96] . 3-Оксикислоты могут быть 3-0-ацилированы остатками жирных кислот» В гидролизатах липида А обнаружены следующие 3-апил-оксикарбоновые кислоты: 3-тетрадеканоилокситетрадекановая [78, 80, 90, 91. 97, 98], 3-додеканоилоксидодекановая [99], 3-доде- каноилокситетрадекановая [4], 3-гексадеканоилоксидекановая [83]. Следует ОТМетИТЬ, ЧТО ЛИПИД A Rhodopseudomonas viridis [34і НЄ содержит жирных кислот со сложноэфирной связью. Среди жирных кислот, связанных с аминогруппой липида А, обнаружены только 3-оксикислоты различной длины цепи с четным числом атомов углерода [4]. Только один тип 3-оксикарбоновых кислот включается в амиднуго связь.
Если в липиде А существует несколько гомологов 3-оксикислот [13, 85, 99] , в амидной связи участвует кислота с более длинной углеродной цепью. Однако известны образцы липида А, в которых аминогруппы адилированы двумя разными остатками 3-оксикислот [21, 94J. З-Оксигруппа кислоты с амидной связью может быть замещена остатком другой кислоты [82, I00J. В липиде A R. sphaeroides одна из аминогрупп дисахарида апили-руется 3-кетотетрадекановой кислотой [82J. Определение угла вращения 3-оксикислот [16, 78, 90J и газожидкостная хроматография их диастереомеров с ь-фенилэтилами-ном [iOI] показали, что все исследованные 3-оксикислоты имеют н(-)-к6нфиіурацию. С другой стороны, 2-оксикислоты, присутствующие в липиде А из ряда источников [94-96] , имеют з(+)-конфи-гурацию. Поскольку 3-оксикислоты являются обязательной составляющей липида А, не присутствующей в других липидах клеточных стенок грамотрицательных бактерий, они используются для определения эндотоксинов в сыворотках [102], микробной массе [103], почвах [104]. Состав жирных кислот является характерной особенностью индивидуального липида А, независимо от условий культивирования микроорганизма. Тем не менее, отмечено влияние жирных кислот, присутствующих в питательной среде, на природу оксикислоти липида A Selenomonas ruminantium [40]. При ВЫращИВаНИИ бактерий P. mirabilis [55], Е. coli [5б] ИЛИ Salmonella spp. [57] при 15С наблюдалось уменьшение количества насыщенных жирных кислот с одновременным увеличением содержания гексадеценовой кислоты. Учитывая, что общий состав жирных кислот липида А, в определенных пределах, постоянен для членов одного рода или семейства, он может быть использован в хемотаксономии бактерий [105]. 1.8. Структура липида А из различных источников В зависимости от природы полярных заместителей глюкозамино-биозы и характера распределения жирных кислот липид А из различных бактериальных источников может иметь свои структурные особенности. Липид A s minnesota [lOOj содержит семь остатков жирных кислот на молекулу дисахарида. Присутствующие в липиде А 3-тет-радеканоилокситетрадекановая и 3-окситетрадекановая кислоты аци-лируют гидроксильные группы глюкозамина, додекановая и гексадека-новая кислоты присоединены сложноэфирной связью к остаткам 3-ок-ситетрадекановой кислоты, ацилирующей аминогруппы глюкозамина [Ю0] (рис. 2). Липид А с. vioiaceum [із] содержит тот же углеводный скелет. Остатки глюкозамина в нем ацилированы н-З-оксидодекановой, st-2-оксидодекановой, додекановой и гексадекановой кислотами. Два Липид А н. sphaeroides [82] (Рис. 5) во многом отличается от липида А рода salmonella . Он не содержит полярных групп, вместо семи остатков жирных кислот, как в Salmonella, имеет всего пять. Отличается он и набором жирных кислот: содержит такие редкие кислоты, как-3-оксотетрадекановая и 7-тетрадеценовая.
Последняя апилирует гидроксильную группу R-3-окситетрадекановой кислоты с амидной связью. Два остатка 3-оксидекановой кислоты связаны с СЗ-и СЗ-положениями дисахарида. Связь с Щ) осуществляется через С6-невосстанавливающего конца. Липид A R. viridis [34] (Рис. 6) в структурном отношении очень отличается от липида A salmonella. Он не имеет жирных Наличие среди предшественников липида А Л-1-фосфата D-ГЛЮ-козамина, ацилированного двумя остатками 3-окситетрадекановой кислоты (рис, 8а), предполагает, что апилирование аминогруппы происходит на ранней стадии биосинтеза [109]. По-видимому [І09І, следующим шагом в этом процессе является образование так называемых кислых предшественников (Рис. 86 [86] , в [107] , г [108]). Кислый предшественник липида А является ключевым промежуточным соединением в биосинтезе липида А и действует как общий акцептор для всех полярных заместителей, входящих в состав полного липида А: КДО, 4-аминоарабинозы и фосфорилэтаноламина [54]. Появление двух последних заместителей в молекуле липида А может предшествовать переносу ЩО [53] (Рис. 8д). Акцепторные СВОЙСТВа КИСЛОГО Предшественника ЛИПИДа A Salmonella typhimurium для переноса ВДО были продемонстрированы in vitro [ ПО] Впоследствии был выделен промежуточный продукт биосинтеза липида А, представляющий собой кислый предшественник липида А с двумя остатками КДО [III] (Рис. 8е). В заключение следует отметить, что ни на одной из стадий биосинтеза не удалось выделить предшественник липида А, не содержащий 3-оксикислот. По-видимому, их присутствие особенно важно для жизнеспособности бактерий. 2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПИДА А 2.1. Эндотоксические свойства Возможная роль липида А в эндотоксических реакциях, таких как пирогенность, токсичность, некроз опухолей и др., изучалась различными группами исследователей [2, 4, 5-7, II2-II4]. Тэл с сотр. [115] были первыми, кто постулировал токсический фактор, возможно, идентичный липиду А, как компонент эндотоксина, который наделяет белок или полисахарид токсичностью в зависимости от метода, используемого для разрыва эндотоксического комплекса. Препараты, лишенные липида А, подобные деградированному полисахариду или простому белку, нетоксичны, С другой стороны, липид А, выделенный из ЛИС кислотным гидролизом, оказался неподходящим для изучения его роли в эндотоксичности. В различных лабораториях были получены невоспроизводимые результаты, вызванные тем, что липид А, получаемый кислотным гидролизом липополисахарида, подвергается различной степени деградации [32]. Более того, низкая эндотоксичность препаратов липида А может быть обусловлена его относительной нерастворимостью. Поэтому был приготовлен искусственный комплекс ЛПС с казеином [3]. После кислотного гидролиза получался комплекс "липид А-казеин", который проявлял высокую пирогенность. Нельзя исключать, однако, возможность того, что эти препараты все ещё содержат следовые количества ЛПС, хотя составляющие, характерные для последнего, в комплексах обнаружены не были.
Иммунологические свойства лшшда А
В прошлом [4] иммуногенность липида А отвергалась. Впоследствии удалось показать, что при определенных условиях он вызывает образование специфических антител [142], Предполагается, что для проявления иммуногенности липид А должен находиться на поверхности бактериальной клетки в незамаскированной форме. Мягкая кислотная обработка клеток Ее-мутанта удаляет ЩО и делает липид А иммуногенным [142]. Сам по себе липид А является плохим иммуногеном, хотя и вызывает слабый ответ при иммунизации кроликов [ 143J и мышей [ 144] Для усиления иммуногенности липида А используются различные подходы: включение его в липосомы [48", 143], комплексование с альбумином бычьей сыворотки [ 145], нанесение липида А на эритроциты [146], комплексование дёз-О-ацили-рованного липида А с белковым носителем [ 114] Антитела к липиду А высоко специфичны к липидному компоненту бактериальных ЖС [131, 142, 147]. Они были обнаружены во . фракции igG [ІЗІІ или во фракциях igM u IgG [131, 142, 148, 149]. Иммунодетерминантная группа липида А включает в себя остаток глюкозамина, ацилированный по аминогруппе 3-оксикарбоновой кислотой [131, 142, 145]. Такой вывод был сделан на основании того, что дез-0-ацилированный липид А проявляет серологическую активность, равную активности нативного липида А [131, 142] ; О- и N-дезапилированный липид А не взаимодействует со специфической аНТИСЫВОрОТКОЙ [131, 142] ; Предшественник ЛИПИДа A Salmonella, содержащий фосфорилированную глюкозаминобиозу, адили-рованную остатками 3-окситетрадекановой кислоты [86], перекрестно реагирует с сывороткой к липиду A [7J; некоторые синтетические производные, содержащие 3-окситетрадекановую кислоту с амидной связью (гидроксамат 3-окситетрадекановой кислоты [131], 6-фосфат 2-(R, з-3-окситетрадеканоил)амино-2-дезокси-о-глюкозамина [145] ингибируют реакцию пассивного гемолиза системы липид А -антисыворотка к липиду А, По-видимому, присутствие остатка жирной кислоты с амидной связью обязательно для проявления липидом А серологической активности. Интересно, что увеличивающиеся количества остатков жирных кислот со сложноэфирной связью уменьшают способность липида А связывать специфические антитела [48, 150] Так как липид А из различных видов бактерий имеет сходное строение [4], то все его образцы дают перекрестные реакции с гетеро-логичными сыворотками [ИЗ, I50J.
Исключение составляет группа бактерий, липид А которых вместо и-глюкозамина содержит 2,3-ди-аішіо-2,3-дидезокси-ікглюкозу и не реагирует с сывороткой к липиду А из salmonella С151} Таким образом, природа углеводного остатка определяет структуру иммунодетерминантнои группы липида А. Многие виды животных легко отвечают на введение липида А продукцией специфических антител [ИЗ], Мыши, однако, оказались неспособными продуцировать антитела при однократном введении (недавно появилось сообщение [144], согласно которому при однократном введении 100 мкг липида А наблюдался специфический ответ на уровне антител образующих клеток). Предполагается, что мыши в отличие от других животных не сенсибилизированы к липиду А, Это подтверждается тем, что в сыворотке многих животных (но не мышей) и человека часто присутствуют антитела к липиду А, уровень которых повышается при наличии грамотрицательной инфекции [148, 152, 153]. Сыворотка к липиду А предотвращает локальную реакцию Шварцмана [47, 128, 154], вызываемую ЛПС или липидом А. При специальных условиях лихорадка, вызываемая у кроликов действием ЛПС или липида А, подавляется специфической антисывороткой [ИЗ, 154]. С другой стороны, иммунизация липидом А не защищает против летальной бактериемии, вызванной Е. соїІ, ХОТЯ в сыворотке присутствуют антитела к липиду А [155, 156]. Неспособность антител к липиду А оказывать защитное действие предполагает, что липид А не выражен на поверхности бактерий [156] . Присутствие липида А может значительно усиливать иммунный ответ к чужеродным антигенам. Адъювантное действие липида А проявляется как в составе липосом [143], так и в комплексе с белковым носителем [157]. Дезапилирование липида А гидроксиламином или гидразином приводит к значительному снижению адъювантной активности [158]. При более мягкой обработке щелочью, которая оставляет примерно половину жирных кислот, адъювантные свойства липида А сохраняются [158]. Сравнение адъювантной активности липида А и некоторых его аналогов [159] показало необходимость присутствия фосфата при С1-дисахаридного фрагмента. Присутствие второй фосфатной группы не является обязательным [159]. Природа кислоты, ацилирущей аминогруппу глюкозамина, не оказывает существенного влияния на адъювантную активность. Предполагается, что существует прямая связь между адъювант-ным и митогенным действием липида А С160]. Липид А иницирует пролиферацию В-чЛИмфоцитов [ 161, 162]. Щелочная обработка часто приводит к исчезновению митогенной активности [І62І. В более поздних работах было показано, что щелочная обработка липида А не изменяет его митогенности [163]. Эти противоречивые результатн, по-видимому, вызваны влиянием условий. Изучение митогенно-сти некоторых синтетических гликолипидов, представлящих собой эфиры жирных кислот и моносахаридов с различной степенью апили-рования, показало, что отсутствие заместителя при CI или наличие ненасыщенной жирной кислоты оказывают ингибирукщее влияние на эту активность [164], В то же время показана [165] важность наличия заместителя при СЗ-глюкозамина для митогенной активности липида А. Избирательное удаление остатка кислоты со сложноэфирной связью привело к полной потере митогенности. Удаление фосфата оказывает незначительное влияние на митогенность [165].
Предполагаемый механизм В-клеточной пролиферации состоит в том, что липид А взаимодействует с клеточной мембраной или внедряется в неё, в результате чего мембранные рецепторы (или энзимы) узнают сложноэфирную связь при СЗ [165]. До недавнего времени считалось, что митогенная активность липида А строго специфична и направлена только на Вплимфоциты. Однако есть данные [144, 166], что липид А оказывает митогенный эффект и на популяцию Т-клеток и способствует кооперации последних с В-лимфоцитами в биосинтезе антител. В отсутствие антигена под действием липида А наблюдается поликлональная активация и продуцируются неспепифические антитела [42, 167]. В проявлении поликлональной активации необходимо участие макрофагов [ 167], поскольку удаление последних значительно снижает функцию липида А как поликлонального активатора. Следует отметить, что липид А из ряда источников не способен стимулировать неспецифический ответ [144], по крайней мере, к эритроцитам барана. Изучение биологических свойств липида А представляет особенный интерес в плане выяснения взаимосвязи его структуры с функцией. Для оценки этого используются три подхода. 1. Выделение из новых источников липида А с необычной структурой и новыми биологическими свойствами и его изучение. 2. Модификация структуры липида А с последующей проверкой модифицированного липида А в различных биологических тестах. 3. Синтез соединений, моделирующих структуру липида А, и изучение биологических свойств таких производных. Структурное разнообразие, характерное для липида А из различных ЛПС, предполагает существование различий в проявлении биологических свойств [4, 7]. Например, образцы липида А из R. vi-ridis и н. paiustris [l5l] не проявляют серологических перекрестных реакций С антИСЫВОрОТКОЙ К ЛИПИДУ А рода Salmonella. Они не токсичны, не пирогенны, но антикомплементарны. Препараты липида А с. vioiaceum u R. tenue перекрестно реагируют с сывороткой к липиду A Salmonella, но неактивны в реакции с комплементом [7, 13, 22, 151]. Липид А с. vioiaceum характеризуется токсичностью и пирогенностью, липид A R. tenue токсичен, но является слабым пирогеном [7]. Однако уровень современных знаний недостаточен, чтобы объяснить различие в биологической активности изучаемых препаратов липида А на основании их структурных особенностей.
Гетерогенность лшшда А
Изучение количественного состава липида А псевдотуберкулезного микроба (табл. 3) с учетом его дисахаридной природы показало, что на два моля глюкозамина приходится около четырех молей 3-окси- тетрадекановой и 0,4- 0,9 моля додекановой кислот. Следует отметить неэквимолярное количество кислот по отношению к глюкозамину, что связано, по-видимому, с различной степенью деградации во время выделения липида А, о чём говорилось ранее (стр.38). Гетерогенность липида А из различных бактериальных источников - хорошо установленный факт [4, 7, 32, 40, 46-50J . Липид А псевдотуберкулезного микроба по данным тонкослойной хроматографии (Рис. 17) также представляет собой сложную смесь, структурное изучение которой имеет большие трудности, вызванные неоднородность Анализ полученных фракций с помощью тонкослойной хроматографии показал, что они все еще содержат несколько компонентов и имеют качественный и количественный состав, аналогичный составу исходного липида А (табл. 3, 4), Метилирование фосфатных групп с последующей хроматографией на силикагеле оказалось более перспективным и привело к получению шести фракций. Первые две фракции не содержали глюкозамин и не изучались. Аналитические данные остальных четырех фракций представлены в таблице 4, низкого содержания додекановой кислоты в образцах липида А, о чём говорилось выше. В процессе выделения липида А возможно отщепление фосфатных групп. Определение количества фосфора во фракциях липида А (табл. 4), полученных колоночной хроматографией на силикагеле, показывает, что частичное отщепление фосфатных групп, действительно, происходит и усиливает гетерогенность липида А. Таким образом, при структурном исследовании липида А следует учитывать степень гетерогенности того или иного образца, который используется для решения определенной задачи и при получении которого произошла частичная деградация липидной части ЛЇЇС. 5. Определение характера связи остатков жирных кислот с углеводным скелетом липида А Для определения характера связи остатков жирных кислот в молекуле липида А использовали слабые щелочные агенты, гидролизую-щие сложноэфирную связь.
Обработка щелочным раствором гидроксил-амина или метилатом натрия [90] приводит к освобождению жирных кислот с общим выходом 30-37$ от исходного липида А. Анализ фракции жирных кислот, освобождающихся при обработке щелочными агентами, показал присутствие додекановой и Згокситетрадекановой кислот в отношении 1:2 (Рис. I9A, Б, В, табл. 3). Среди жирных кислот, получающихся при обработке метилатом натрия, кроме вышеупомянутых, была найдена 3-метокситетрадекановая кислота, которая ранее в гидролизатах липида А не была обнаружена. Её идентификация проводилась методом хромато-масс-спектрометрии. Как видно из рис. 20, в масс-спектре кислоты присутствуют ионы с m/z= 272 (М+), 257 (M-I5), 241 (M-3I), 155 (М-П7), 117, 75. Ион с m/z = 117 получается разрывом" связи СЗ-С4 и характеризует поло- лот происходит отщепление заместителя с образованием /,&-непредельной кислоты по механизму J -элиминирования. В условиях обработки метилатом натрия возможно нуклеофильное присоединение ме-тилата по двойной связи, что ведет к образованию 3-метоксикисло-ты. Присутствие 3-метокситетрадекановой кислоты в продуктах щелочного гидролиза согласуется с ранее полученной информацией о наличии в липиде А 3-ащлоксикислоты со сложноэфирной связью (стр. 50). Для определения природы заместителя по гидроксильной группе 3-окситетрадекановой кислоты жирные кислоты из метанолизата липида А метилировали диазометаном (Рис. I9B). Сравнение с жирными кислотами (Рис. І9Б), которые не подвергались обработке диазометаном, показало, что метилирование приводит лишь к слабому увеличению пика, соответствующего 3-окситетрадекановой кислоте. В то же время пик, соответствующий додекановои кислоте, вырастает значительно, тем самым указывая, что она является продуктом Д-элиминирования. Учитывая, что исходный метанолизат без обработки диазометаном содержит/приблизительно/пятую часть общего количества додекановои кислоты, можно считать, что в липиде А псевдотуберкулезного микроба она присутствует/преимрїественно; в виде 3-додека-ноилокситетрадекановой кислоты. Для определения характера кислот, ацилирущих аминогруппы глюкозамина, липид А дез-0-ацилировали гидроксиламином или мети-латом натрия и подвергали щелочному гидролизу. Как видно из табл. 3, единственной кислотой, которая получается из дез-О-ацилирован-ного липида А, является 3-окситетрадекановая, причем на два остатка глюкозамина приходится около двух остатков кислоты. Отсутствие в гидролизате otJ -непредельной кислоты свидетельствует о том, что оксикислоти, анилирущие аминогруппы липида А, не имеют заместителя. Сопоставление данных, представленных в табл. 3, показывает, что в липиде А 2 остатка 3-окситетрадекановой кислоты имеют амид-ный тип связи, два других - сложноэфирный, причем один из остатков со сложноэфирной связью имеет по гидроксильной группе при СЗ-атоме остаток додекановой кислоты в качестве заместителя. 6. Определение положения фосфатных групп в липиде А псевдотуберкулезного микроба Как видно из данных элементного анализа (табл. I), липид А псевдотуберкулезного микроба содержит около 2% фосфора. Определение количественного содержания отдельных составляющих липида А показало, что на два остатка глюкозамина приходится около двух остатков фосфорной кислоты. Известно [30J, что фосфат, находящийся при CI-атоме моносахаридов, неустойчив в кислых условиях. Изучение кинетики отщепления фосфора при различных условиях (Рис. 21) показало, что приблизительно половина фосфора (35-44$) отщепляется при мягкой обработке кислотой, что свидетельствует о присутствии фосфатной группы при С1-дисахарида.
Изучение липида А с помощью спектроскопии г-ЯМР подтверждает этот вывод. В спектре липида А (рй 8,6, рис. 22) присутствуют два сигнала равной интенсивности. Величины их химических сдвигов -3,0(s) м.д. и -I,4(s) м.д. и рй-зависимость указывают на то, что они соответствуют монофосфатам [87-89J. Сигналы, соответству- После мягкого кислотного гидролиза в спектре ХР-ЯМР липида А наблвдается один сигнал при -3,98 м.д. Сигнал с величиной химического сдвига -1,4 м.д. соответствует, таким образом, монофосфатной группе при CI-атоме восстанавливающего конца липида А. Определить положение второй монофосфатной группы с помощью спектроскопии ХР-ЯМР не представляется возможным из-за близости величин химического сдвига сигналов ядер фосфора, находящихся при СЗ, 04 и С6-атомах [89]. 7. Использование спектроскопии - -С-ЯМР для структурного исследования липида А Как известно, традиционные методы установления структуры липида А требуют жесткой химической обработки [19], что ведет к потере информации о некоторых его структурных особенностях, например, о положении фосфатных групп, степени ацилирования жирными кислотами, распределении последних на молекуле дисахарида. С развитием техники ядерного магнитного резонанса на ядрах углерода появилась возможность провести изучение липида А без предварительной его деградации. Следует отметить, что использование спек-то троскопии хоС-ЯМР в структурном исследовании липида А связано с определенными трудностями, вызванными его нерастворимостью в воде, склонностью к агрегации, гетерогенностью. Эти свойства обус-ловили сильное уширение сигналов в спектре хоС-ЯМР, полученном для раствора липида А в дейтерохлороформе, сделав его неинформативным. Для снижения амфипатичности липида А его фосфатные группы метилировали диазометаном. Метилированный липид А делили на колонке с силикагелем. Фракция Ш (табл. 4), как наименее деградированная, была выбрана для дальнейших структурных исследований методом то спектроскопии АЧ2-ЯМР. Чтобы уменьшить мицеллообразование, все еще имеющее место в растворе метилированного липида А в дейтеро- хлороформе, спектр регистрировали в присутствии дейтерометанола. Предварительное изучение спектра хоС-ЯМР 6-ди-0-метилфосфа-та 2 ацетамидо-1,3,4-три 0-додеканоил-2-дезокси- Б-глюкоііирано-зы, полученного обработкой диазометаном соответствующего 6-фосфа-та [204], показало, что метилирование фосфатной группы приводит к сдвигу сигнала С6-атома в слабое поле на 2 м.д., одновременно в спектре появляется сигнал с химическим сдвигом 54,5 м.д., соот- ветствущий атому углерода метоксигруппы.
