Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор. Белки способные связывать иммуноглобулины неиммунным способом 8
2.1. Иммуноглобулины. Структура и классификация 9
2.2. Иммуноглобулинсвязывающие белки грамположительных бактерий 16
2.2.1. Экспрессия иммуноглобулинсвязывающих белков, их структурная и функциональная гетерогенность 16
2.2.1.1. Иммуноглобулинсвязывающие белки стафилококков 19
2.2.1.2. Иммуноглобулинсвязывающие белки группы А стрептококков 22
2.2.1.3. Иммуноглобулинсвязывающие белки стрептококков группы С и G..24
2.2.1.4. Иммуноглобулинсвязывающие белки Peptostreptococcus magnus 26
2.2.2. Структура иммуноглобулинсвязывающих белков грамположительных бактерий 27
2.2.2.1. Протеин A Staphylococcus aureus 29
2.2.2.2. Протеин G групп С и G стрептококков 31
2.2.2.3. Протеин L Peptostreptococcus magnus 33
2.2.2.4. М-протеины стрептококков группы А 34
2.2.3. Пространственные структуры комплексов протеина А стафилококков и протеина G стрептококков с IgG человека 37
2.3. Иммуноглобулинсвязывающие белки грамотрицательных бактерий 39
3. Результаты и обсуждения 42
3.1. Общая характеристика иммуноглобулинсвязывающей активности Yersina pseudotuberculosis 42
3.2. Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Y. pseudotuberculosis 44
3.3. Выделение ИСБ Y. pseudotuberculosis 49
3.4. Изучение структуры и свойств ИСБ-14 57
3.4.1. Химические и физико-химические характеристики ИСБ-14 57
3.4.2. Взаимодействие ИСБ-14 с IgG разных видов животных 61
3.5. Изучение структуры и свойств ИСБ-16 64
3.5.1. Характеристика и идентификация ИСБ-16 64
3.5.2. Взаимодействие ИСБ-16 кДа с IgG кролика и человека 67
3.6. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-16 и его комплексов с молекулой IgG человека 69
3.6.1. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-16 70
3.6.2. Теоретическое предсказание структуры комплекса ИСБ-16 с Fc-фрагментом IgGl человека 72
3.7. Характеристика и идентификация ИСБ-7 76
3.8. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-7 и его комплексов с IgG человека 79
3.8.1. Компьютерное моделирование пространственной структуры ИСБ-7 79
3.8.2. Теоретическое моделирование структуры комплекса ИСБ-7 с тяжелыми цепями Fc- и Fab-фрагментов IgG человека 81
4. Экспериментальная часть 85
4.1. Материалы 85
4.2. Методы 86
5. Выводы 98
6. Список литературы 100
- Экспрессия иммуноглобулинсвязывающих белков, их структурная и функциональная гетерогенность
- Пространственные структуры комплексов протеина А стафилококков и протеина G стрептококков с IgG человека
- Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Y. pseudotuberculosis
- Теоретическое предсказание структуры комплекса ИСБ-16 с Fc-фрагментом IgGl человека
Введение к работе
Изучение молекулярных механизмов взаимодействия патоген-хозяин - одна из важнейших задач биологии, иммунологии и медицины, лежащая в основе разработки эффективных средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. На разных стадиях развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на защитные системы организма хозяина использует макромолекулы, наделенные определенным видом активности. Сопоставление биологической активности отдельных видов макромолекул, продуцируемых патогенными бактериями, с тем эффектом, который они вызывают в организме хозяина, позволяет характеризовать функцию этих биополимеров как факторов патогенности. Одним из важных факторов патогенности бактерий, способных вызывать различные заболевания животных и человека, являются иммуноглобулинсвязывающие белки (ИСБ). Считается, что неиммунное связывание иммуноглобулинов (Ig) с клетками через ИСБ защищает бактерии от действия комплемента, уменьшает их опсонизацию и фагоцитоз, что, в итоге, позволяет микроорганизмам избежать воздействия иммунной системы хозяина. Кроме того, многие из известных ИСБ являются полифункциональными, они могут связываться с различными компонентами сыворотки крови животных и человека, а также непосредственно взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками макроорганизма.
На сегодняшний день некоторые из известных бактериальных ИСБ находят применение в медицине. Их способность с высокой аффинностью связывать широкий спектр классов и подклассов Ig разных видов животных и человека позволяет успешно использовать их в качестве вторых антител в иммунодиагностических тест-системах для обнаружения специфических иммунных комплексов. Благодаря вышеупомянутым свойствам ИСБ, иммобилизованные на твердых носителях, применяются в качестве сорбентов при лечении пациентов, которым показано выведение из организма аутоантител, иммунных комплексов или иммуноглобулинов. ИСБ также находят
7 широкое применение в иммунохимии и иммунологии как один из специфических инструментов исследования.
С 50-х годов прошлого столетия накоплен большой экспериментальный материал, касающийся строения и свойств ИСБ грамположительпых бактерий, а также механизмов их взаимодействия с Ig разных видов животных и человека. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены структура и функциональные свойства ИСБ стафилококков, стрептококков группы А, С, G и пептококков. Однако остается неизученным вопрос взаимосвязи между структурой ИСБ и их Ig-связывающей активностью.
В грамотрицательных бактериях также идентифицированы белки, способные связывать иммуноглобулины неиммунным образом, но известно о них значительно меньше. Во многих случаях они очень плохо охарактеризованы. Для этих белков, в отличие от ИСБ грамположительпых бактерий, отсутствуют данные о молекулярной структуре и строении их комплексов с Ig.
Объектом нашего исследования являются ИСБ грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis (семейство Enter obacteriaceae). Y. pseudotuberculosis относятся к факультативным психрофилам и характеризуются большим разнообразием условий обитания. Эти бактерии могут вести как сапрофитический, так и паразитический образ жизни. После орального заражения Y. pseudotuberculosis вызывают кишечные формы псевдотуберкулеза, в тяжелых случаях протекающего с генерализацией процесса, а также системные заболевания с повреждением внутренних органов, с постинфекционными артритами. Иерсиниозы имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека и регистрируются повсеместно. Следует особо подчеркнуть, что большая часть болеющих псевдотуберкулезом - дети в возрасте до 14 лет. Они составляют более 65% от общего числа заболевших. В то же время патогенез, эпидемиология и диагностика заболевания изучены и разработаны недостаточно.
Из всего вышесказанного следует, что изучение ИСБ грамотрицательных бактерий, в частности ИСБ Y. pseudotuberculosis, остается актуальной задачей, которая имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.
8 2. Литературный обзор. Белки способные связывать иммуноглобулины
неиммунным способом
Иммуноглобулинсвязывающие белки (ИСБ) бактерий образуют большую группу белков, различающихся по локализации в микроорганизмах, по молекулярной структуре и связывающим свойствам. Они обнаружены на поверхности бактериальных клеток, в капсуле и культуральной среде [1-3]. Молекулярные массы ИСБ варьируют в широких пределах, от 20 до 350 кДа. Среди них встречаются как мономерные, так и олигомерные белки [3-14]. Кроме того, ИСБ различаются по аффинности связывания с иммуноглобулинами разных классов и подклассов животных и человека, а также могут иметь разные места связывания на молекуле иммуноглобулина [5-8]. В одной бактерии, как инструмент воздействия на иммунную систему организма хозяина, могут находиться одновременно несколько структурно и/или функционально различных ИСБ [9-11].
Повышение вирулентности
Индукция анти-IgG
антител
Подавление системы комплемента
Усиление
антифагоцитарной
активности
Индукция
провоспалительных
цитокинов
Рис. 1. Биологическая активность ИСБ.
Несмотря на значительные различия в строении и свойствах, ИСБ из разных микроорганизмов объединяет способность связываться с Fc-фрагментами иммуноглобулинов. Способность ИСБ взаимодействовать с иммуноглобулинами
9 неиммуным образом является важным биологическим феноменом. Они рассматриваются как важные факторы патогенности бактерий. Считается, что неиммунное связывание иммуноглобулинов с клетками через ИСБ защищает бактерии от действия комплемента [1,2], индуцирует синтез антииммуноглобулинов [15], уменьшает их опсонизацию и фагоцитоз, что, в конечном итоге, позволяет микроорганизмам избежать воздействия иммунной системы хозяина (рис. 1) [1,2,4].
Взаимодействия ИСБ с иммуноглобулинами и другими белками сыворотки крови человека и животных представляет интерес не только с точки зрения исследования механизмов патогенности бактерий, но также с целью изучения межмолекулярных лиганд-рецепторных взаимодействий и применения ИСБ в медицине с целью разработки защитных вакцин и способов диагностики различных заболеваний.
Экспрессия иммуноглобулинсвязывающих белков, их структурная и функциональная гетерогенность
Тяжелые цепи имеют особый участок открытой полипептидной цепи, расположенной между Сн1 и СНП доменами, обозначаемый как «шарнирная область» (рис. 4). Эта область, состоящая из 15-60 аминокислотных остатков, содержит остатки цистеина, образующие дисульфидные связи между Н-Н и Іі-L цепями. Она характеризуется наибольшей подвижностью и доступностью для действия ферментов.
Компактность структуры доменов придает им высокую устойчивость к протеолитическому расщеплению. По этой причине большинство ферментов (папаин, пепсин) расщепляют иммуноглобулины на участке «шарнирной области». Как показано на рисунке 5, при ферментативном расщеплении молекулы IgG папаином образуются два антигенсвязывающих Fab-фрагмента (Fragment antigen binding), каждый с одним антигенсвязывающим центром, и один кристаллизуемый Fc-фрагмент (Fragment crystallizable). Обработка молекулы IgG пепсином приводит к образованию единственного двухвалентного антигенсвязывающего фрагмента (F(ab )2), при этом Fc область полностью деградируется ферментом.
Таким образом, протеолитическое расщепление может разделить IgG на фрагменты с функционально различными свойствами. Фрагменты F(ab) и F(ab )2 способны связывать антигены (они содержат антигенсвязывающие участки), но только F(ab )2 может показывать агглютинацию или преципитацию. Это связано с тем, что эти функции требуют бивалентного связывания для образования перекрестных связей. Каждый F(ab) фрагмент имеет один антигенсвязывающии участок, который требует присутствия двух вариабельных областей, одной тяжелой и одной легкой цепи (VH И VL). Кроме того, без Fc части связывание комплемента не происходит. Фрагмент Fc не связывается с антигеном, и в тоже время он требуется для связывания комплемента, но он не может связывать комплемент самостоятельно. В зависимости от строения константных областей тяжелых цепей иммуноглобулины разделяют на пять основных классов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Каждому из пяти классов иммуноглобулинов соответствует свой класс тяжелой цепи, обозначаемый буквами греческого алфавита у, ос, ц., 8 и є. Их молекулярная масса варьирует от 50000 до 75000 Да (таб. 1). Константные области ц- и е-цепи содержат по четыре домена, в составе других тяжелых цепей таких доменов три. Кроме того, на основе небольших различий в Сн-областях некоторые классы тяжелых цепей разделяются на подклассы и, соответственно, подклассы иммуноглобулинов. У человека, например, известно четыре подкласса IgG, а именно IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, и два подкласса IgA и IgM (таб. 1). Наличие и число различных классов и подклассов Ig у разных видов животных различно. Константные области легких цепей (CL) представлены двумя типами - каппа (к) и лямбда (X) (таб. 1). Каждая из них может соединиться с любым изотипом тяжелых цепей. Так как легкие цепи в каждой молекуле антитела идентичны, иммуноглобулины содержат либо к, либо X, но никогда - оба типа цепей. Иммуноглобулины IgG, IgD и IgE имеют общую структуру и отличаются по молекулярным массам вследствие различий в размере тяжелых цепей и их углеводного содержания. Эту основную структуру можно представить общей эмпирической формулой, H2L2. Таким образом, молекула IgGl, например, может быть представлена как уІ2К2, или yl2X2 в зависимости от того, содержит ли она каппа- или лямбда- цепи. Иммуноглобулины IgM и некоторые IgA состоят из нескольких H2L2 субъединиц. IgM состоит из пяти таких субъединиц, каждая из которых включает две ц-цепи и две легкие цепи (каппа или лямбда). Поэтому IgM содержит десять антигенсвязывающих участков, и является наибольшим из иммуноглобулинов (макроглобулин). IgA может существовать как мономер, димер или тример основной H2L2 субъединицы, и поэтому несет два, четыре или шесть аптигепсвязывающих участков. Иммуноглобулины IgM и полимерный IgA имеют дополнительный полипептид - J-цепь. Считается, что J-цепь участвует в процессе полимеризации H2L2 субъединиц этих молекул. Отличия в строении тяжелых цепей различных изотипов (классов и подклассов) Ig приводят к заметным различиям в их биологических свойствах (таб. 2). IgM самый эффективный Ig в связывании комплемента. Обладая поливалентностью, макроглобулин связывает антигены с множественными эпитопами, легко вызывает агглютинацию и лизис клеток. Молекула синтезируется на ранних стадиях иммунного ответа, служит мембранными рецепторами В-лимфоцитов. IgG самый преобладающий Ig сыворотки. Представители различных подклассов могут фиксировать комплемент (через классический или альтернативный путь). Эти Ig могут перемещаться через плаценту, защищая плод от инфекций в течение первых недель жизни. У новорожденных защищенность усиливается благодаря поступлению в кровоток содержащегося в молозиве IgG через слизистую кишечника. При вторичном иммунном ответе синтезируются в основном IgG. Опсонизирующая активность IgG проявляется через Fc рецепторы, присутствующие на макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах. IgA является вторым по количественному содержанию Ig сыворотки. Это секреторный иммуноглобулин, преимущественно содержащийся в выделениях слизистых оболочек - в слюне, слезной жидкости, носовых выделениях, поте, молозиве и секретах легких, мочеполовых путей и желудочно-кишечного тракта. Он обеспечивает защиту поверхностей, сообщающихся с внешней средой, от микроорганизмов. В сыворотке IgA является главным образом H2L2 мономером. IgA в секрециях является полимерным (главным образом димер, то есть [H2L2]2, иногда тример), и несет дополнительный полипептид секреторной части. IgD представляет собой антигеысвязывающий рецептор на В-лимфоцитах (вместе с IgM), редко встречается в сыворотке. Его другая биологическая функция не известна. IgE имеет чрезвычайно низкий уровень концентрации в сыворотке крови. Основная физиологическая функция - защита внешних слизистых оболочек организма путем локальной активации факторов плазмы и эффекторных клеток благодаря индукции острой воспалительной реакции. В то время как антитела очень стабильны, IgE является исключением и характеризуется термолабилыюстыо.
Пространственные структуры комплексов протеина А стафилококков и протеина G стрептококков с IgG человека
SpG связывается с открытым участком полипептидной цепи, соединяющий второй и третий домены (Сн2 и СцЗ) тяжелой цепи Fc-фрагмента IgG [123]. Эта область Fc-фрагмента также является сайтом для связывания SpA [143]. При образовании комплекса SpA:Fc-(])parMeiiT в связывание с IgG вовлекаются остатки второй и главным образом первой (N-концевой) а-спиралей домена SpA, третья спираль раскручивается и принимает вытянутую конформацию (рис. 14Ь) [103, 106]. Остатки SpG, которые участвуют в связывании Fc-фрагмента IgG, расположены в С-концевой части а-спирали, N-концевой части третьего /3-стренда и области петли, соединяющей эти два структурных элемента (рис. 14а). Ранее высказывалось предположение, что а-спирали SpA и SpG в комплексе с Fc-фрагментом занимают одинаковое положение и с этим связана конкуренция этих белков за места связывания на участке Fc-фрагмента молекулы IgG. Однако, суперпозиция двух комплексов обнаруживает, что а-спираль SpG находится под углом приблизительно 45 к плоскости, в которой лежат две наиболее длинные се-спирали SpA (рис. 14с). Кроме того, две а-спирали SpA локализованы на стороне (ближе к поверхности, судя по рис. 14с) Си2 домена Fc-фрагмента, тогда как а-спираль SpG вклинивается в расщелину, расположенную между Сц2-Сн3 доменами. Таким образом, локализация а-спиралей SpA и SpG в комплексах с Fc-фрагментом не совпадает.
Природа взаимодействий в этих двух комплексах является различной. В связывание между Fc-фрагментом и SpG вовлекаются, в основном, заряженные и полярные остатки с образованием сложной сети водородных и ионных связей, тогда как комплекс Fc-фрагмента и SpA стабилизирован главным образом гидрофобными взаимодействиями и несколькими полярными контактами. Это подтверждается биохимическими данными, которые показывают различную рН-зависимость связывания IgG для SpA и SpG [144]. Несмотря на различия в связывании, несколько остатков Fc-фрагмента включены во взаимодействие как с SpA, так и с SpG. Это стало возможным, потому что в комплексе с Fc-фрагментом третий Р-стренд в SpG расположен приблизительно в той же самой области, что и первая Fc-связывающая а-спираль SpA. Выше названный факт объясняет конкуренцию этих белков при связывании с IgG. Однако у SpG и SpA есть ряд уникальных взаимодействий с Fc-фрагментом IgG, которые объясняют их различия в связывающей активности. SpG связывает больше подклассов IgG и с более высокой аффиностью, чем SpA [8, 68] (Таб. 3). Рентгеноструктурным анализом была установлена структура комплекса Ig-связывающего домена SpG с Fab-фрагментом IgG [85, 87, 122]. При образовании комплекса се-спираль SpG не взаимодействует с Fab-фрагментом. В связывании участвует два /3-стренда, которые образуют антипараллельный /3-лист с последним /3-стрендом Сн1 домена Fab-фрагмента. Интересно, что подобный тип связывания с образованием межмолекулярного /?-листа наблюдается между молекулами SpG.
Белки, способные связывать иммуноглобулины неиммунным образом, также обнаружены у различных видов грамотрицательных бактерий, но сведений о них мало и они отрывочны. Зачастую изучение ИСБ проводили только на уровне целых клеток, лизатах бактерий и/или суммарных экстрактах белков внешних мембран. Только из нескольких видов бактерий были получены белки в индивидуальном состоянии и изучены их некоторые физико-химические и биологические свойства. Тем не менее, на основе имеющихся в литературе данных можно составить общую картину экспрессии, локализации и функциональной активности ИСБ грамотрицательных бактерий.
Установлено, что в большинстве случаев ИСБ грамотрицательных бактерий обнаруживаются на поверхности бактериальных клеток [7, 14, 145, 146], но они, подобно ИСБ грам положительных бактерий, встречаются также в капсулыюм материале и культуральной среде [2, 10]. Так, например, при исследовании 72 штаммов Е. coli, с использованием флуоресцентномеченных IgG, у 6 штаммов была обнаружена Ig-связывающая активность [14]. Авторы показали, что эта активность обусловлена поверхностными белками, которые взаимодействовали с IgG животных и человека через Fc-фрагмент. Эти белки сохраняли Ig-связывающую активность даже после прогревания при 100С, но теряли её после обработки трипсином. Было также обнаружено, что максимальная экспрессия ИСБ наблюдалась на стационарной фазе роста бактерий при температуре 37С. В случае Haemophilus somnus, белки, взаимодействующие с Fc областью IgG быка, были выделены из культуральнои среды [10].
Нужно отметить, что в бактерии может присутствовать несколько ИСБ, в том числе и значительно различающихся по величине молекулярной массы. В Е. сої і, методом Вестерн-блота лизатов целых клеток, авторы идентифицировали ИСБ в виде множественных полос в области молекулярных масс 130-195 кДа [14]. В Fiisobacterhan mtcleatum, бактерии, вызывающей парадонтоз у человека, Ig-связывающая активность была ассоциирована с полипептидами, имеющими молекулярные массы 40 и 42 кДа. Эти белки имеют гомологию N-концевой аминокислотной последовательности с таковой бактериального порина Fom А [147]. В вышеупомянутой бактерии Н. sommis также присутствует несколько белков, связывающих Ig неиммунным образом (41, 120, 270, и 350 кДа). Четыре ИСБ Н. sommis показали антигенное родство. Авторы предположили, что в этой бактерии высокомолекулярные ИСБ являются, возможно, олигомерными формами полипептида с молекулярной массой 41 кДа.
ИСБ грамотрицатсльных бактерий, также как ИСБ грамположительных бактерий, различаются по способности взаимодействовать с разными видами и подклассами Ig животных и человека. Так, например, четыре ИСБ Н. sommis показали некоторые различия в своей связывающей активности. Один из них, с наименьшей молекулярной массой, слабо взаимодействовал с подклассами IgG быка, а также IgA и IgM, в то время как три высокомолекулярных белка с высокой аффинностью связывали IgG2, IgA и IgM быка. Кроме того, ИСБ с молекулярной массой 270 кДа не только взаимодействовал с имлгуноглобулинами быка, но также сильно связывал IgG лошади, кролика, свиньи, кота, собаки и овцы.
Влияние условий культивирования и плазмид вирулентности на экспрессию иммуноглобулинсвязывающих белков Y. pseudotuberculosis
Как видно из рисунка 21, самой высокой активностью обладали бактерии, растущие при низкой температуре (4С). При увеличении температуры культивирования бактерий от 4С до 20С, происходит снижение способности клеток связывать IgG. Особенно резко активность клеток падала при их культивировании при температуре 37С.
Температура роста бактерий также влияет на содержание ИСБ в лизатах клеток. Действительно, по данным вестерн блота ИСБ присутствуют в клетках, культивированных при 4С, и не обнаруживаются в бактериях, растущих при 37С (рис. 22, дорожки 2 и 3, 5 и 6). Экспрессия ИСБ при 4С, возможно, вносит вклад в увеличение вирулентности псевдотуберкулезного микроба при низкой температуре [161]. Как было показано выше (рис. 20), на Ig-связывающую активность клеток псевдотуберкулезного микроба также оказывает влияние значение рН среды, в которой культивируются бактерии. Зависимость от рН также прослеживается в количестве ИСБ, экспрессирумых этими клетками. При этом содержание ИСБ в клетках, культивированных при рН 6,0, увеличивается в сравнении с бактериями, выращенными при рН 7,2 (рис. 22, дорожки 1 и 2, 4 и 5). Согласно полученным данным наблюдается корреляция между Ig-связывающей активностью бактериальных клеток и содержанием в них ИСБ.
Как известно, многие факторы патогенности иерсиний кодируются плазмидой вирулентности pYV48, а также плазмидой pVM82. Сравнительный анализ бактерий двух изогенных штаммов Y. pseudotuberculosis, бесплазмидного и с двумя плазмидами (pYV48, pVM82), выращенных при одинаковых условиях, показал, что их Ig-связывающая активность отличается незначительно. Даже при 37С, температуре необходимой для экспрессии генов плазмид вирулентности, оба штамма демонстрируют одинаковую Ig-связывающую активность (рис. 21). Влияние температуры и рН среды на активность бактерий и содержание ИСБ в клетках одинаково для обоих изогенных штаммов (рис. 22 а, б). Следовательно, уровень экспрессии ИСБ в бактериях псевдотуберкулеза не зависит от присутствия в клетках плазмид вирулентности. По-видимому, биосинтез этих белков Y. pseudotuberculosis детерминируется хромосомными генами, как и большинства известных ИСБ бактерий. Таким образом, в результате сравнительного анализа Ig-связывающей активности клеток Y. pseudotuberculosis, культивированных на средах разного состава, при разных температурах и значениях рН, показано, что экспрессия ИСБ зависит от условий роста бактерий. Наиболее сильное влияние на синтез ИСБ оказывает температурный фактор.
Некоторые характеристики ИСБ Y. pseudotuberculosis, такие, как низкая молекулярная масса, кодирование ИСБ хромосомными генами и увеличение их экспрессии при рН 6,0, совпадают с таковыми PsaA Y. pestis, обладающего Ig-связывающими свойствами. Однако между этими белками существуют значительные различия. ИСБ Y. pseudotuberculosis могут экспрессироваться при рН 7,2 и пониженной температуре (4С) в отличие от PsaA Y. pestis, который в этих условиях в клетках не синтезируется. Таким образом, основная Ig-связывающая активность бактерий Y. pseudotuberculosis не связана с присутствием в клетках белка, подобного иммуноглобулинсвязывающему белку PsaA Y. pestis.
Как было показано выше (рис. 17, а, б, дорожка 1), в лизатах клеток Г. pseudotuberculosis присутствуют ИСБ с молекулярными массами, лежащими в области 7-20 кДа. Для их выделения была разработана схема, включающая несколько стадий (схема). На первой стадии выделения ИСБ микробную массу Y. pseudotuberculosis, обработанную ацетоном (ацетоновый порошок), энергично перемешивали в фосфатно-солевом буферном растворе, рН-7,2 со стеклянными бусами. Супернатант (схема, Экстракт-1), полученный после центрифугирования суспензии клеток, по данным дот анализа содержал активные белки и в дальнейшем был использован для выделения ИСБ-7. Остаток клеток (схема, Ос-1), согласно дот анализу, также содержал активные белки и был использован для получения клеточных оболочек (КО).
Ранее было показано, что КО Y. pseudotuberculosis содержат в основном те же активные белки, которые обнаруживаются в лизате целых клеток (рис. 17, а, б, дорожка 2) [157]. Нами было использовано два различных способа получения КО. Первый способ основан на методе Нюрминен [158]. По этому методу для разрушения бактериальной оболочки используется бактериолитический фермент - лизоцим (N-ацетилмурамидаза), расщепляющий гликозидные связи пептидогликапа (схема, КО-1). Второй способ включает дезинтеграцию клеток с помощью методов «замораживания и оттаивания» с последующей обработкой ультразвуком (схема, КО-2) [162]. По данным ДСН-ПААГ-электрофореза и вестерн блота клеточные оболочки (схема, КО-1 и КО-2), полученные при обоих способах дезинтеграции клеток, содержали набор ИСБ с молекулярными массами в области от 7 до 20 кДа (рис. 17, я, б, дорожка 2; рис. 26, а, б, дорожка 1, соответственно). Необходимо отметить, что дальнейшую экстракцию ИСБ проводили в достаточно мягких условиях, чтобы исключить денатурацию белков. С этой целью КО-1 и КО-2 обрабатывали 50 мМ Tris-HCl буферным раствором, рН 8,0 (Экстракт-2, 3). Щелочной буферный раствор в обоих случаях извлекает большой набор белков, не обладающих Ig-связывающей активностью (рис. 23, а, б, дорожка 1).
Теоретическое предсказание структуры комплекса ИСБ-16 с Fc-фрагментом IgGl человека
Способность ИСБ-16 взаимодействовать с IgG кролика была исследована с помощью ИФА. С этой целью ИСБ-16 иммобилизовывали на полистирольном планшете и Ig-связывающую активность белка выявляли с помощью конъюгата IgG-ПХ.
Связывание IgG с ИСБ-16 зависит от концентрации внесенного иммуноглобулина, а насыщаемость кривой связывания свидетельствует о специфичности реакции между ИСБ-16 и IgG кролика (рис. 39, я, кривая 1). SpA, использованный нами в качестве модельного ИСБ, при связывании с IgG кролика давал подобные кривые насыщения (рис. 39, а, кривая 2). Нужно отметить, что оптимальные для определения в ИФА концентрации иммобилизованных Skp и SpA, которые были определены в предварительных экспериментах, существенно отличались и составили 3,5 мкМ и 4,3 нМ, соответственно. Как известно, оптимальная концентрация белка в ИФА (при прочих равных условиях реакции) зависит от величины константы связывания. Следовательно, можно предположить, что Ка реакции комплексообразоваїїия ИСБ-16 с IgG кролика ниже Ка SpA с IgG, величина которой составляет 10-100 мкМ 1 [187].
А490нм. Для определения локализации мест связывания ИСБ-16 на молекуле IgG использовали конкурентный ИФА. Было показано, что взаимодействие между ИСБ-16 и IgG человека ингибируется при добавлении в реакционную смесь Fc-фрагментов IgG человека (рис. 39, б). Полученные данные позволяют считать, что Fc-участок иммуноглобулина связывается с ИСБ-16 из Y. pseudotuberculosis. Нужно отметить, что максимальное ингибирование реакции связывания достигает 72 %. Возможно, другие участки IgG также могут взаимодействовать с ИСБ-16, как раннее показано для ИСБ из других микроорганизмов [188]. Исходя из данных по ингибированию, была рассчитана Ка, величина, которой составила 3,05 мкМ"1. По литературным данным аффинность взаимодействия бактериальных ИСБ с иммуноглобулинами значительно различается. Так, ИСБ Streptococcus equi связывается с IgG лошади с Ка — 6,96 мкМ" [189]. Фрагмент В SpA связывается с Fc участком IgG кролика с Ка = 3 мкМ" , а нативный SpA с Ка на один-два порядка выше [159].
Таким образом, было наглядно показано, что ИСБ-16 обладает способностью связываться с IgG кролика и человека. Методом конкурентного ИФА было определено, что преимущественно ИСБ-16 связывается с IgG человека через Fc-фрагмент. Величина константы связывания реакции взаимодействия ИСБ-16 с IgG человека составила 3,05 мкМ" [162].
При всем разнообразии белков их функциональная и биологическая активность всегда основывается на высоко специфическом взаимодействии белка с соответствующим лигандом. Для этого взаимодействия необходима достаточно жесткая пространственная структура. Поэтому биологическая функция белка тесно связана с его определенной трехмерной структурой. Даже небольшие изменения этой структуры часто ведет к потере или резкому изменению активности белка.
На основании того, что аминокислотная последовательность определяет пространственную структуру белка, на сегодняшний день разработан ряд теоретических методов предсказания этой структуры по последовательности аминокислотных остатков в белковой цепи. Одним из методов предсказания пространственных структур «новых» последовательностей является метод сравнительного компьютерного моделирования. Этот метод основывается на структурном подобии белков, имеющих высокую гомологию аминокислотной последовательности. С целью построения пространственной структуры исследуемого белка, в базах данных с помощью специальных программ подбирается прототип белок с установленной пространственной структурой, имеющий наибольшую гомологию с последовательностью исследуемого белка. С помощью компьютерных специализированных программ, используя данные по структуре белка-прототипа, строится теоретическая модель исследуемого белка. Критерием точности построения теоретической модели является величина среднеквадратичного отклонения Са-атомов модели от Са-атомов прототипа. Модели высокой точности можно использовать для дальнейшего теоретического изучения лиганд-рецепторных взаимодействий.
Для выяснения возможного строения комплекса Skp и IgGl человека с помощью методов компьютерного моделирования была сконструирована его теоретическая модель. Поскольку к настоящему времени пространственная структура Skp не установлена, моделирование комплекса было начато с предсказания трехмерной структуры исследуемого белка. Сравнительный анализ первичной структуры Skp Y. pseudotuberculosis (код UniProt A7FFH8) показал, что степень идентичности этой аминокислотной последовательности и последовательностей белков Skp с установленной пространственной структурой составляет более 50%.
В качестве прототипа для построения модели пространственной структуры Skp Y. pseudotuberculosis была выбрана кристаллическая структура белка Skp Е. coli [190] (код PDB Ш2М_С), степень идентичности с аминокислотной последовательностью которого составляет 65% (рис. 40, а). Теоретическая модель пространственной структуры Skp Y. pseudotuberculosis получена методом сравнительного моделирования с помощью сервера Swiss-Model (рис. 40, б). Суперпозиция Са-атомов модели и прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения всех Соатомов составляет 0,24 А. Величина потенциальной энергии молекулы мономера Skp Y. pseudotuberculosis в вакууме составила -10443,9 кДж/моль. Это свидетельствует о том, что построена высокоточная модель мономера Skp Y. pseudotuberculosis.
