Введение к работе
-3-
Актуальность проблемы. Порины наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий существуют в интактной мембране в виде гомотримеров, образуют водонаполненные поры, или каналы, через которые осуществляется транспорт низкомолекулярных веществ. Особенности структуры поринов и их поверхностная локализация обуславливают наличие у них многочисленных функций, отличных от транспортной. С одной стороны, порины представляют собой молекулы-мишени для иммунной системы организма-хозяина, с другой - выступают как факторы вирулентности и патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме.
Получение рекомбинантных белков в клетках Е. coli в виде телец включения (ТВ), которые представляют собой ассоциаты нерастворимых интермедиатов белка - широко распространенный подход, используемый для получения индивидуальных белков в препаративных количествах. Недостатком данного метода является то, что белки в составе подобных ассоциатов не обладают функциональной активностью, поэтому для использования рекомбинантных белков в практических целях требуется восстановление их пространственной структуры.
Изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно определить функциональную значимость тех или иных участков белковой молекулы. Известно, что поверхностно локализованные структурные элементы молекулы порина, так называемые наружные петли, входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.
Получение рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Изучение взаимосвязи между структурой, функциональными и антигенными свойствами мутантных белков позволит, во-первых, расширить фундаментальные представления о свойствах поринов и, во-вторых, открыть новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иерсиниями.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами (участками наружных петель) пространственной и антигенной структуры OmpF порина из Y. pseudotuberculosis и его функциональными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера) белка.
-4-Изучение порообразующих и иммунобиологических свойств рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза.
2. Расчет антигенных В- и Т-клеточных эпитопов, входящих в состав
аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека
иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enter ocolitica), и синтез
соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических
пептидов как иммуногенов и диагностических антигенов.
3. Сайт-направленный мутагенез белок-кодирующего участка ompF
гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе
делеции петельных участков аминокислотной последовательности OmpF
порина Y. pseudotuberculosis. Экспрессия, вьщеление и подбор условий
рефолдинга мутантных белков. Характеристика пространственной
структуры полученных интермедиатов рефолдинга (мономера и тримера)
мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических
свойств.
Научная новизна и практическая ценность работы. Проведено структурно-функциональное исследование рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Показана возможность его использования в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулеза.
С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные В- и Т-клеточные эпитопы, входящие в состав аминокислотной последовательности поринов патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. pestis, Y. enterocolitica) и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Впервые изучены их иммуногенные свойства и возможность использования как потенциальных антигенов для диагностики иерсиниозов.
Проведён сайт-направленный мутагенез ompF гена и созданы экспрессионные конструкции для получения OmpF поринов Y. pseudotuberculosis, несущих делеции участков наружных петель LI, L6 и L8. Впервые получены мутантные OmpF порины с указанными мутациями, а также охарактеризованы их физико-химические, порообразующие и иммунохимические свойства.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены автором на следующих конференциях и симпозиумах: III Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Пущино, 2007; 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, 2008; XIII Всероссийской школе-конференции молодых ученых по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 2010.
Публикация результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 4 статьи в отечественных журналах и 8 тезисов
-5-докладов в сборниках трудов Всероссийских и Международных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов работы, описания материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 140 ссылок. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 5 таблиц.
