Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Модификация белков
горесцентными метками имеет разнообразное научное и
іктическое применение. Введение Флуоресцентных репортерных
гпп в молекулы белков позволяет получать уникальную информацию
Еонформационной динамике белка, межбелковом и белок-липидном
іимодействии, характеризовать надмолекулярную организацию и ее
іь в реализации Функционально важных процессов биологических
>уктур. Использование флуоресцентной модификации антител и
гигенов привело к появлению Флуоресцентной гистохимии и
гохимии, Флуоресцентного иммуноанализа, флуоресцентных
готоксических иммуноконыогатов. Дальнейшее развитие химии
'оресцентныя меток и модификации белка позволит расширить
гперименталъну» базу как исследования функционирования белковых
іекул, так и применения флуоресцентных коньюгатов белков,
іенаправленная Флуоресцентная модификация антител важна для
існения выраженности и роди конформационной динамики и
-ментной подвижности антител яри взаимодействии с антигеном и
їлизации эффекторных функций. Яа использовании коныогирования
іков с Флуоресцентными метками основано создание новых схем
югенного флуоресцентного анализа и биосенсоров. Использование
оресцентных конъюгатов имеет большое значение для разработки
мх лекарственных агентов для фотодинамической терапии рака,
чения молекулярных механизмов фототоксического действия
орофоров, построения Фотоактивируемых молекулярных
іструкций.
Связь работы с крупными научными программами, темами. гсертационная работа выполнялась в рамках плановых научных гледований лаборатории механизмов и кинетики ферментативных щессов института бноорганической химии ЙНБ, включенных в іесоюзную программу 0.74.05 "Разработать новые направления :ледований генетического аппарата, биополимеров и структур тки и внедрить достижения молекулярной биологии в народное іяйство", в рамках республиканской научно-технической программы іформатика".
Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась
разработке новых подходов получения флуоресцентно меченых
ков, выяснения принципов их функционирования и создании схем
екцни белок-белкового и белок-лигандного взаимодействия,
вились следующие задачи исследования: 1) получить
высокочувствительную к изменению поларности микроокружени флуоресцентную метку с максимумом флуоресценции в красной облает спектра и изучить возможность детекции с ее помощью межбелковог взаимодейевия и взаимодействия антиген-антитело; 2} разработат подходы к получению селективно модифицированных антигено и антител; 3) изучить физико-химические свойства коньюгато флуоресцентных фотосенсибилизаторов с белками.
Научная новизна полученных результатов. Впервые на основ
нильского красного синтезирована флуоресцентная метка
уникальной чувствительностью параметров люминисценции
микроокружению . Показана возможность ее использования дл
селективной модификации белков и применения полученных коньюгато
для детекции белок-белкового взаимодействия. Получен
флуоресцентно меченые моноклональные антитела, чувствительные
взаимодействию с немодифицированным антигеном. Разработана схем
однокомпонентной детектирующей системы инсулина на основ
селективно модифицированных анти-инсулиновых антител. На основ
метода обратно-фазовой ВЭЖХ разработан новый подход для получени
набора селективно модифицированных распространенным
Флуоресцентными метками белков. Дано дальнейшее развити
представлению о поверхность-опосредованном взаимодействи
модифицированных белков с обратно-Фазовым сорбентом. Влервы изучены Фотофизические параметры ковалентных коньюгатов хлорин еб с альбумином и иммуноглобулином человека. Установлена обратна зависимость квантового выхода синглетного и триплетного состояни Фотосенсибилизатора в коиыогате от молярного соотношения порфири : белок без изменения времени жизни возбужденного состояния Исследован механизм фотохимических реакций комплексов альбумина хлорином еб и триптофаном в близких к in vivo условиях. Влервы показана возможность вовлечения лигандов сывороточного альбумин человека в фотосенсибилизированные окислительные реакции.
Практическая значимость полученных результатов. Нова
флуоресцентная метка, NHS-DBP, может быть применена для синтез коньюгатов физиологически активных веществ и изучения и специфического взаимодействия с биомолекулами. Схемы детекци взаимодействия антиген-антитело имеют прямое отношение технологиям Флуоресцентного иммуноанализа и биосенсоров Фотофизические характеристики коньюгатов хлорина еб с белкам являются основой для оптимизации модификации Флуоресцентным
Фотосенсибилизаторами противоопухолевых моноклональных антител для использования в фотодинамической терапии рака. Результаты по окислению лигандов альбумина при фотосенсибилизации хлорином еб могут быть использованы для развития концепции применения фотактивируемых лекарств для лечения злокачественных образований.
Экономическая значимость результатов. Разработанные схемы гомогенного иммуноанализа могут быть использованы для создания коммерческих иммунодиагностикумов. Подходы получения наборов селективно модифицированных белков могут быть использованы для наработки коммерчески значимых флуоресцентных коныогатов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Синтез и применение N-гидроксисукцинимидного эфира
диэтидаминобензфеноксазиноноксиуксусной кислоты в качестве новой
флуоресцентной метки, высоко чувствительной к полярности среды, с
максимумом флуоресценции В красной области спектра.
2. Разработка схемы детекции взаимодействия антиген-антитело,
основанной на частичном экранировании флуоресцентной метки в
области мехбелкового контакта.
3. Разработка на основе представлений о поверхность-
опосредованном взаимодействии флуоресцентно модифицированных
Зелков с обратно-Фазовым сорбентом подхода для получения набора
селективно меченых флуорофорами белков методом обратно-Фазовой
ЇЗЖХ.
J. Исследование фотофизических характеристик белковых коньюгатов
флуоресцентного Фотосенсибилизатора хлорина еб в зависимости от
їлотности посадки молекул Флуорофора и природы белка.
Ь. Изучение роди лигандов сывороточного альбумина человека в
процессах окисления, фотосенсибиаизированных хлорином еб.
Личный вклад соискателя. Результаты по активации флуорофоров,
«одиФикации антигенов и антител Флуоресцентными метками,
Разделению изомеров флуоресцентно меченых белков, изучению
гвойств флуоресцентеных коньюгатов и механизмов фотоокислительных
іроцессов получены лично автором. Синтез
іизтиламинобензфеноксазиноноксиуксусной кислоты осуществлен
ИФ АН БССР, кривые кинетики затухания
Г. Я. .Алексеевым
флуоресценции получены к.Ф.-м.н. С.И.Бачило, ИИйф ДЯБ, В >бсу*дении результатов, связанных с Фотодинамической терапией >ака принимал участие к.Ф.-м.н. Г.А.Кочубеев. В постановке темы
диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие д.х.н. П.й.Киселев.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на IV международном симпозиуме по количественной люминисцентной спектрометрии в биомедицинских науках (Гент, Бельгия, 1991), II съезде Белорусского общества фотобиологов v биофизиков (Минск, 1996), 12-ом международном конгрессе пс Фотобиологии (Вена, Австрия, 1996), 15-ом Европейском совещани* по метаболизму лекарств (йена, ФРГ, 1996).
Опубликованность результатов. Основные результаті
диссертационной работы изложены в 2-х статьях, 7-ми тезиса) докладов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит и:
введения, общей характеристики работы, обзора литературы,
экспериментальной части, материалов и методов, списка
Похожие диссертации на Получение и физико-химическая характеристика модифицированных флуоресцентными метками альбумина, инсулина и моноклональных антител к инсулину
