Содержание к диссертации
Введение
1.Структура инсулина 6
2. Методы получения инсулина человека 7
2.1. Полный химический синтез 7
2.2. Полусинтетический 7
2.3. Биотехнологический 7
2.3.1. Двухцепочечный метод 7
2.3.2. Метод получения инсулина человека через природный предшественник ~ проинсулин 8
2.3.3. Метод получения инсулина человека через секретируемыи предшественник в дрожжах S.cerevesiae. 9
3. Физико-химические свойства инсулина 9
4. Контроль производства генно-инженерного инсулина человека 10
5. Методы контроля качества субстанции инсулина 14
5.1. Требования к чистоте и подлинности инсулина 14
5.2. Гель-фильтрация 16
5.3. Электрофорез в полиакриламидном геле 17
5.4. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 17
5.4.1.Влияние природы ирН буферного раствора 20
5.4.2.Механизм удерживания и способ элюировапия 22
5.4.3. Природа органического модификатора 23
5.4.4. Тип стационарной фазы 24
5.4.5. Влияние температуры колонки 27
5.5. Капиллярный электрофорез 29
5.5.7. Природа и рН буферного раствора 34
5.5.2. Приложенное напряжение 37
5.5.3. Влияние типа и длины капилляра. 39
5.6. Заключение 40
6.Экспериментальная часть 43
6.2. Приготовление буферных растворов 43
6.3. Приборы и оборудование 46
6.4. Пробоподготовка и методики проведение анализов 48
7.Обсуждение результатов 56
7.1. Исследование кинетики ренатурации гибридного белка 58
7.2. Анализ чистоты гибридного белка 63
7.3. Исследование кинетики и механизма реакции трипсинолиза гибридного белка 65
7.3.1. Исследование механизма реакции трипсинолиза гибридного белка 66
7.3.2. Исследование кинетики трипсинолиза гибридного белка. 68
7.4. Подтверждение подлинности первичной структуры гибридного белка 70
7.5. Исследование процесса выделения ди-Arg -Arg -инсулина и Arg 31-инсулина из реакционной массы 73
7.6.Исследование кинетики расщепления ди-Arg -Arg -инсулина карбоксипептидазой В 75
7.7. Анализ чистоты инсулина и оценка эффективности его очистки методом ионообменной хроматографии 79
7.8.Идентификация примесей в ГИИЧ 81
7.8.1.Определение содержания de3-OMudo-AsnA2 -инсулина. 81
7.8.2. Определение содержания ди-Arg -Arg -инсулина, Arg - инсулина и дез-амидо-АтА2і'-инсулина 83
7.8.3.Определение содержания дез-амидо-Asn -инсулина методом ОФВЭЖХ. 85
7.8.4.Определение содержания дез-амидо-инсулинов методом .КЭФ...88
7.8.5.Определение содержания дез-Т1ігЮ0-инсулина 89
7.9.Подтверждение подлинности первичной структуры инсулина 93
7.10. Пептидное картирование производных инсулина методом капиллярного электрофореза 101
Выводы 103
Список литературы 104
- Метод получения инсулина человека через природный предшественник ~ проинсулин
- Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
- Исследование процесса выделения ди-Arg -Arg -инсулина и Arg 31-инсулина из реакционной массы
- Пептидное картирование производных инсулина методом капиллярного электрофореза
Введение к работе
Сахарный диабет по распространенности и тяжести заболевания занимает третье место после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, причем только в Российской Федерации количество больных достигает 2 млн.человек. Основным антидиабетическим средством до сих пор остается инсулин - гормон, состоящий из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями, и включающий в свой состав 51 аминокислотный остаток. На протяжении многих десятилетий основным источником инсулина была поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиньи, и только в последнее время положение пациентов в развитых странах заметно улучшилось из-за повышения качества препаратов и, в основном, благодаря переходу от инсулинов животных на генно-инженерный инсулин человека (ГИИЧ), который сводит к минимуму осложнения и побочные иммунные реакции [1].
Биотехнологический метод получения ГИИЧ в настоящее время является наиболее перспективным, главным образом, из-за отсутствия ограничений по источнику исходного сырья и относительно низкой стоимости конечного продукта, поэтому разработка отечественной технологии получения ГИИЧ имеет большое значение, так как позволит покрыть дефицит инсулина и снизить затраты валютных средств на закупку препарата за рубежом.
Кроме того, независимо от источника сырья для биотехнологического производства: экстракты или гидролизаты природных тканей и органов, ферментативная биомасса, совершенно необходимы: во-первых, структурная характеристика биологически активных компонентов, во-вторых, поиск и количественная оценка балластных и (или) вредных примесей, в -третьих,
оценка качества и стабильности препаратов в условиях хранения.
В связи с этим является актуальной разработка аналитического обеспечения биотехнологических процессов, позволяющего достоверно оценить чистоту и природу пептида или белка на каждой производственной стадии и тем самым сократить время и затраты на разработку технологического процесса.
Целью диссертационной работы являлась разработка эффективного постадииного контроля производства генно-инженерного инсулина человека (ГИИЧ) с помощью комплекса инструментальных микрометодов разделения (микро-колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (микро-ОФВЭЖХ), капиллярного электрофореза (КЭФ)) и методов качественной идентификации (масс-спектрометрии (МС)).
Метод получения инсулина человека через природный предшественник ~ проинсулин
Биотехнологический метод получения ИЧ основан на культивировании рекомбинантных штаммов E.coli или культуры дрожжей Sacchoromyces cerevisiae. В зависимости от типа получаемых белков-предшественников способы биотехнологического получения ИЧ можно разделить на несколько методов: 2.3.1. Двухцепочвчный метод.
Первым методом получения ГИИЧ, который был реализован в лабораторном масштабе [5], а затем успешно масштабирован для промышленного производства [6], был двухцепочечный метод. В методе, разработанном компанией ЕШ Lilly (США), А и В-цепи инсулина, соединенные через N-концевой метионин с фрагментом бактериальной (3-галактозидазы, синтезировались в отдельных ферментационных процессах с использованием двух рекомбинантных штаммов Е.соИ. Основной стадией, определяющей выход активного гормона, являлся процесс рекомбинации А и В- цепей.
С появлением метода получения ГИИЧ через проинсулин, двухцепочечный метод, вероятно, больше не используется для промышленного получения ИЧ из-за сложности реакции рекомбинации цепей и необходимости работать с двумя штаммами и, соответственно, с двумя технологическими линиями.
Этот метод получения ИЧ является наиболее экономически эффективным в настоящее время [7]. В рекомбинантных штаммах Е.соИ проинсулин экспрессируется в составе гибридного белка (ГБ), т.е. молекулы проинсулина, соединенной через остаток аргинина [8] или метионина [9] с лидерным фрагментом, и накапливается в телах включения внутри клетки. Пространственная структура проинсулина обеспечивает предпочтительное замыкание дисульфидных связей в положениях, соответствующих нативной структуре инсулина, поэтому замыкание дисульфидных связей проводят, как правило, после отщепления лидерного фрагмента [9].
В настоящее время созданы бактериальные штаммы-суперпродуценты гибридных белков [8,10], пространственная структура которых обеспечивает высокий выход реакции образования «правильно» замкнутых дисульфидных связей непосредственно в молекуле ГБ, что позволяет исключить стадию получения проинсулина и, таким образом, снизить технологические потери.
В результате триптического расщепления ренатурированного предшественника с последующей [11] или одновременной обработкой карбоксипептидазой В [12] образуется инсулин, полностью идентичный природному гормону.
В 1983 г. было показано, что экономически выгоднее выделять рекомбинантный белок из культуральной среды, чем из тел включения [13]. Метод получения ГИИЧ, использующий этот подход, включает в себя стадию культивирования колонии рекомбинантных дрожжей S.cerevesiae.
Укороченный предшественник инсулина экспрессируется в дрожжах с правильно замкнутыми дисульфидными связями [14,15], что существенно упрощает технологическую схему получения инсулина, однако использование бактериальных штаммов-суперпродуцентов остается экономически более предпочтительным благодаря более высокому уровню экспрессии инсулина в составе ГБ [7].
Инсулин человека имеет молекулярную массу 5807 Да [16] и занимает промежуточное положение между белками и пептидами. Изоэлектрическая точка инсулина равна 5.3-5.4 [17]. Молекула инсулина подвержена дезамидированию при низких значения рН (разбавленные растворы НС1 при 37С) [18] так как имеется 6 потенциальных сайтов для дезамидирования (Gin , GlnA15, AsnA18, Asn 1, AsnB3, GlnB4) а при pH 10 полностью теряет активность из-за разрушения дисульфидных мостиков [19]. Инсулин подвержен действию протеолитических ферментов присутствующих в пакреатической железе, таких как трипсин, химотрипсин, карбоксипептидазы. [20].
Растворимость инсулина зависит от ряда факторов - таких, как природа растворителя, рН, температура, ионная сила, присутствие ионов дивалентных металлов (Zn ). При 4 рН 7 инсулин легко растворяется в отсутствии ионов цинка. При добавлении к раствору инсулина ионов цинка зона растворимости резко сужается, т.к. инсулин легко образует агрегаты (ди-, тетра- и гексамеры) [21]. При относительно низкой концентрации (0.2 г/л) инсулин почти количественно осаждается 2 М NaCl даже при рН=2-3, однако сохраняет растворимость в 70% водном этаноле [7]. Последнее свойство можно объяснить, вероятно, относительно небольшой молекулярной массой инсулина и относительно высоким содержанием гидрофобных аминокислот.
Эти свойства инсулина необходимо учитывать при разработке методов выделения, очистки и анализа инсулина.
Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография
Метод ОФВЭЖХ позволяют с высокой селективностью, высокой чувствительностью (0.1%) и воспроизводимостью определять основные регламентированные примеси в образцах инсулинов при коротком времени анализа (20-40 мин) и сравнительно низких материальных затратах [ 45].
Рассмотрим основные параметры, влияющие на эффективность разделения пептидов и белков (в частности, инсулина и его производных) методом ОФВЭЖХ. 5.4.1.Влияние природы и рН буферного раствора. В ряде работ [9, 56] показано, что наилучшее разделение инсулина и его структурно близких аналогов (дезамидо-инсулина, карбамоил- и формил-инсулинов, моно- и диаргинил-инсулинов, инсулинов разного видового происхождения) достигается при рН=2-3. В качестве буферных растоворов для анализа инсулина исползуется широкий набор неорганических солей (фосфат, хлорид, тартрат, сульфат, перхлорат, трифторацетат). В качестве ион-парных реагентов используются : фосфат и трифтоацетат триэтиламмония, тетраметил- и тетраэтиламмониевые катионы, цетримид, бутан- и гептансульфонат. В работе [57] исследовано влияние некоторых неорганических анионов (фосфат, сульфат, нитрат, перхлорат, трифторацетат, хлорид) и катионов (К+, Na+ , NH44", Zn2+, Li+, г Г-(СНз)з+) на коэффициент удерживания (к ) и селективность разделения инсулина (Rs) и дезамидоинсулина. Как было установлено, к и Rs зависят в основном от природы аниона и возрастают в ряду: фосфат, хлорид, сульфат, нитрат, перхлорат, трифторацетат. Было отмечено, что значения указанных параметров зависят от концентрации фосфата (Сфосф) и достигают максимума при СфОСф=0.2 М/л, что авторы объясняют смешанным механизмом разделения (образованием ионных пар). Было показано, что значения к возрастают в ряду: N-(CH3)3+, К+, NH4+, Na+ , Li+, однако, в случае ионов Li Rs оказывается меньше, чем в случае катионов Na+, что связано с уширением зоны разделяемого вещества в присутствии Li+. Эффект увеличения к с уменьшением радиуса катиона авторы объясняют тем, что в приведенном ряду катионов уменьшается степень сольватации катионов, что увеличивает способность катиона экранировать отрицательно заряженные группы белка. Увеличение ионной силы подвижной фазы, как правило, приводит к увеличению к , что может быть вызвано рядом факторов: 1) увеличение концентрации ионов уменьшает степень ионизации заряженных групп молекулы белка, тем самым повышая гидрофобность молекулы; 2) высокая концентрация катионов способствует экранированию свободных силанольньгх групп на поверхности стационарной фазы, что ослабляет неспецифические взаимодействия протонированных аминогрупп белка с матрицей; 3) высокая ионная сила раствора оказывает влияние на пространственную структуру инсулина, в результате чего изменяется поверхность, доступная для взаимодействия с сорбентом. Особо отмечено влияние концентрации неорганических солей в подвижной фазе на форму пиков и селективность разделения инсулина и дезамидоинсулина [58, 59]. При изократическом элюировании на колонке LiChrosorb СІ8 в 0.1 М фосфате натрия (рН=2.3) удовлетворительный результат был получен только при добавлении в буфер сульфата натрия до концентрации 0.1 М. Для очистки инсулина препаративной ОФВЭЖХ в работе [9] рекомендуется использовать элюент с рН 3.0 - 4.0, несмотря на склонность инсулина к дезамидированию по Asn 1 в кислых условиях [7, 18, 60]. В указанной работе проблема дезамидирования решается осаждением инсулина из элюата кристаллизацией с цинком. 6.2.2.Механизм удерживания и способ элюирования. Элюирование пептидов (и инсулинов в том числе) с обращенных фаз, как правило, проводится в градиентном режиме с добавлением органического модификатора [44]. Выбор способа элюирования зависит, прежде всего, от желаемого принципа разделения. В настоящий момент принято, что механизм разделения в ОФВЭЖХ основан на двух основных принципах удерживания: 1) адсорбция разделяемых молекул на поверхности стационарной фазы ; 2) распределение молекул сорбата между подвижной и стационарной фазой [61,62]. В первом случае молекулы пептида или белка конкурируют с молекулами подвижной фазы за сайты связывания на поверхности сорбента. При градиентном элюировании, связанный пептид или белок остается на поверхности сорбента до тех пор, пока подвижная фаза с некоторой концентрацией органического модификатора (характерной для каждого пептида) не начнет вытеснять молекулы сорбата из стационарной фазы. Далее зона пептида или белка перемещается по колонке со скоростью, равной скорости потока т.к. вещество полностью переходит в подвижную фазу и более не взаимодействует со стационарной фазой. Соответственно время удерживания пептида или белка является функцией гидрофобности молекулы, т.е зависит от силы гидрофобного взаимодействия со стационарной фазой.
Второй механизм разделения основан на различие коэффициентов распределения разделяемых веществ между стационарной и подвижной фазами и эксплуатируется в «чистом виде» при изократическом элюировании. Механизм основан на том, что молекулы сорбата находятся в равновесии (распределены) между двумя фазами с разной гидофобностью (подвижной и стационарной). При этом за счет движения элюентов через колонку зоны веществ движутся с постоянной скоростью (меньшей чем скорость потока), которая обратно пропорциональна гидрофобности молекулы сорбата. При градиентном элюировании увеличение содержания органического модификатора (и, соответственно, повышение гидрофобности подвижной фазы) вызывает преимущественный переход молекул сорбата в подвижную фазу, а при достижении некоторой концентрации происходит переход всех молекул вещества в элюент.
Исследование процесса выделения ди-Arg -Arg -инсулина и Arg 31-инсулина из реакционной массы
Дез-амидо-Asn -инсулин является продуктом деградации инсулина при нейтральном значении рН [7, 49] и образуется при длительном хранении даж лиофильно высушенного инсулина [7]. Разделение дез-амидо-Asn -инсулина и инсулина, обычно, проводят при щелочном значении рН [7, 49]. Это связано с тем, что при кислых значениях рН аминокислотный остаток AsnB3 находится внутри инсулиновой глобулы, и его дезамидирование не оказывает влияние на гидрофобность молекулы [69]. При нейтральном и щелочном значении рН конформация инсулина изменяется и Asn оказывается экспонированным на поверхности глобулы [95].
При дезамидировании инсулина по AsnB образуются два производных : Asp -инсулин (дез-амидо-Asn -инсулин) и P-Asp -инсулин, которые элюируются двумя пиками при разделении методом ОФВЭЖХ в щелочных условиях (рН=9) [49]. С учетом того, что при рН 7 происходит растворение силикагельной матрицы сорбента и снижение срока службы колонки [44], была разработана методика определения содержания дез-амидо-Азпвз-инсулина при нейтральном значении рН. Хроматограммы USP-стандарта, ГИИЧ (Elly Lilly) после 10 лет хранения в кристаллической форме и образца ГИИЧ (ИБХ РАН) перед стадией финальной очистки представлены на рис.20.
Пики 1 и 2 (рис.20), вероятно, соответствуют указанным формам дез-амидо-А8пвз-инсулина и элюируются перед пиком инсулина, как и описано в литературе [49]. При использовании в качестве элюента фосфата натрия рН=7 и колонки Jupiter С4-300 (вместо Vydac С18-300 аналогичной геометрии [49]), позволило нам разделить производные дез-амидо-Азпвз-инсулина до базовой линии и оценить не только общее содержание дез-амидо-Asn -инсулина как описано в литературе [49], но и количество каждой формы отдельно. Кроме того, в указанных условиях анализа можно оценить содержание дез-амидо-Asn 1-инсулина (рис.20, пик 4), хотя эффективность разделения (Rs = 1.52) в этом случае ниже, чем в кислых условиях и не удовлетворяет требованиям фармакопеи (Rs=1.8).
Методом МС показано, что примесь, соответствующая пику 3 (рис.20), имеет молекулярную массу 5 808.9 Да и, вероятно, соответствует еще не идентифицированной дез-амидо-форме инсулина.
Исходя из того, что оба образца ГИИЧ (рис.20) в отличие от USP-стандарта имеют высокое содержание дез-амидо-форм (рис. 20-Б, В) можно предположить, что указанные примеси, вероятно, образуются не только при хранении инсулина (рис.20-Б), но и в ходе производства (рис.20-В).
Предложенная методика определения содержания дезамидо-форм в инсулине является весьма эффективной, т.к. возможно определение содержания дез-амидо-Авн 1-инсулина (рис.20 пик 4), дез-амидо-Азпвз-инсулина (рис.20 пики 1и 2) и неидентифицированной дез-амидо-формы (рис.20 пик 3) в одном анализе (что невозможно в кислых условиях [49]). 7.8.4.0предвление содержания двз-амидо-инсулинов методом КЭФ.
В литературе описано несколько методик анализа содержания дез-амидо-Asn 1 -инсулина (табл.3, стр 29). При этом авторы работы [73] отмечают, что разработанная методика, вероятно, не позволяет анализировать содержание других дез-амидо-форм инсулина. Учитывая факт присутствия дез-амидо-форм инсулина в образце ГИИЧ (Elly Lilly) (рис.20- Б), мы исследовали возможность анализировать содержание других дез-амидо-форм инсулина (не только дез-амидо-Азпвз-инсулина) в образце ГИИЧ методом КЭФ (рис.21). Как оказалось, селективность разделения инсулина и дез-амидо-инсулинов в буферных растворах неорганических солей (рН = 8-9) недостаточна для точного количественного анализа. В связи с этим, мы исследовали возможность влияния на селективность разделения с помощью различных добавок, которые обычно используются в КЭФ [73- 75, 88].
Наилучший результат был достигнут при использовании метанола, в концентрации от 15 до 30 % (по объему) в 0.1 М фосфатном буфере.
В отличие от описанной ранее методики [73] методом КЭФ удается разделить несколько дез-амидо-производных (в том числе дез-амидо-Asn -инсулин (рис.21 пик 1 и дез-амидо-Asn -инсулин (рис.21 пик 2)) в одном анализе. Как видно из рис.21 метод КЭФ обладает большей селективностью разделения дез-амидо-форм инсулина, чем ОФВЭЖХ (рис.20) и позволяет детектировать большее число дез-амидо-производных, чем методом ОФВЭЖХ. 7.8.5.0пределение содержания дез-Ткгто-инсулина. Дез-Тпгвз0-инсулин и инсулин человека имеют близкие физико-химические свойства [20]. До настоящего момента в литературе не сообщалось о разделении указанных веществ ни методом КЭФ ни ОФВЭЖХ. Напротив, отмечалось, что дезhr - инсулин является одной из наиболее трудноудаляемых примесей из субстанции ГИИЧ [27] и очистка от него требует высоких материальных затрат и связана с большими потерями целевого продукта [22].
Пептидное картирование производных инсулина методом капиллярного электрофореза
Видовая идентификация инсулина может быть проведена также с помощью метода МС. Результаты МС-анализа разных инсулинов и их дезамидоформ приведены в табл.7. Как видно из полученных данных, значения m/z для молекулярных ионов инсулинов разных животных и человека заметно различаются (табл.7), что позволяет с большой степенью вероятности отнести тот или иной инсулин к определенному виду. Вместе с тем молекулярные массы инсулина и его моно-дезамидоформы отличаются на 1 Да, что затрудняет идентификацию моно-дезамидоформы в образце инсулина методом МС.
Молекулярные ионы пептидов (1а) и (16) (табл.8) имеют одинаковые значения m/z (1Отн)=1087 (100%) (инсулины свиньи, КРС), в то время как для фрагмента (1в) m/z (10тн) равно 1116 (100%) (инсулин человека), что соответствует строению С-концевого нонапептида В-цепи инсулинов и отражает замену Ala (свинья, КРС) на Thr (человек).
Молекулярные ионы пептидов (2а), (26), (2в) (табл.8) имеют одинаковые значения m/z (1отн) =1378, (М+Н)+, (60%) и m/z (1отн) =1400, (M+Na)+, (100%), что подтверждает тождество аминокислотного состава фрагментов. Для пептидов (За), (Зв) (рис. 27), идентичных по аминокислотной последовательности, значения m/z (1отн) одинаковы и составляют 2970 (100%) (табл.8), что подтверждает совпадение аминокислотного состава фрагментов. В случае фрагмента (36) наблюдается иное значение m/z (1ОТН)=2906 (100%) (замены по сравнению с инсулином человека: ThrA8 на А1аА8 и ПеА1 на ValA1). Молекулярные ионы пептидов (Int-a), (Int-в) (рис.27) имеют m/z (10тн)=3367 (100%) (свинья, человек), в то время как для (Int-б) m/z (10Тн) равно 3304 (100%)) (КРС). На основании этих данных мы установили, что указанные пептиды представляют собой фрагменты 3 (рис. 25) соответствующих инсулинов, включающие в свой состав N-концевую часть А-цепи (фрагмент 4, рис.25).
Хорошее соответствие экспериментальных значений m/z для молекулярных ионов каждого пептида с расчетными величинами их молекулярной массы (табл.8) позволяет сделать вывод об отсутствии каких-либо аминокислотных модификаций или замен в составе отдельного пептидного фрагмента и, как следствие, в структуре целой молекулы инсулина.
Таким образом, МС-анализ фрагментов инсулинов разного видового происхождения позволяет независимо от результатов ОФВЭЖХ определить как природу инсулина, так и предположительный характер замены аминокислот в структуре каждого пептидного фрагмента.
Как установлено, метод КЭФ оказывается неинформативен при пептидном картировании инсулинов разного видового происхождения. Из-за того, что первичные структуры инсулинов различаются заменами только нейтральных аминокислот, пептидные карты всех инсулинов оказываются идентичными. Тем не менее, пептидное картирование некоторых производных инсулина методом КЭФ оказывется достаточно эффективным (рис.28). На рис.28 приведены пептидные карты ГИИЧ, ди-Arg -Arg -инсулина и дезhr -инсулина.
Пептиды, соответствующие С-концевым фрагментам инсулинов (фрагменты 1, рис. 25) имеют разные времена миграции, причем отсутствие С-концевого Thr вызывает уменьшение времени миграции фрагмента 16 по сравнению с 1а (рис.28), в то время как, замена С-концевого ThrB3 в ГИИЧ на Ala (в инсулинах свиньи быка) не влияет не электрофоретическую подвижность 1. Совместное использование двух методов, основанных на разных механизмах разделения (микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез), позволяет контролировать чистоту и степень конверсии целевых полупродуктов на всех этапах получения генно-инженерного инсулина человека, что дает возможность оценить эффективность проведения каждой отдельной стадии и всего процесса в целом. 2. Изучена кинетика и оптимизированы условия реакций ренатурации и трипсинолиза гибридного белка, позволяющие добиться максимального выхода целевых продуктов. 3. Предложены методики анализа и идентификации примесей (ди-Arg8 роо от і R4fl Arg -инсулина, Arg -инсулина и их дез-амидо-форм, дезhr -инсулина, дез-амидо- Asn 21- инсулина, дез-амидо-Азпвз- инсулина) в субстанции инсулина.
