Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Роль химических элементов в деятельности сердечно-сосудистой системы. Биологическая роль микроэлементов, входящих в состав ферментов 10
1.2. Количественные методы определения элементного состава биологических объектов: тканей сердца и сосудов 17
1.3. Способы пробоподготовки биологических материалов 23
1.4. Основные аналитические трудности (и подходы) при исследовании биообъектов рентгеновскими методами анализа 30
1.4.1. Влияние матрицы 30
1.4.2. Неоднородность стандартных образцов и масса используемого материала 41
1.5. Биологические образцы. Методы рентгено-флуоресцентного анализа в тонком, промежуточном и насыщенном слоях 42
1.6. Задачи и направления исследований 51
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 55
2.1. Аппаратура 55
2.2. Пробоподготовка стандартных образцов для РФА-СИ анализа 58
2.3. Пробоподготовка образцов биотканей 59
2.4. Измерение образцов биотканей 60
2.5. Пределы обнаружения 63
ГЛАВА 3. Разработка методических подходов для рфа-сианализа мышечных тканей 67
3.1. Характеризация рассеивающих свойств матриц образцов и стандартов 68
3.2. Определение коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности химических элементов для международных биологических стандартных образцов в РФА-СИ анализе 70
3.3. Определение концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в международных стандартных образцах 72
3.4. РФЛ-СИ анализ образцов биотканей в слое «промежуточной» толщины. Поверхностная плотность излучателя 80
3.5. Оценка влияния неоднородности распределения химических элементов в стандартных образцах при анализе образцов малой массы 85
3.6. Оценка однородности распределения химических элементов в образцах ткани миокарда и сосудов человека. Воспроизводимость РФА-СИ анализа 89
3.7. Проверка правильности результатов РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов человека 93
ГЛАВА 4. Результаты определения содержания химических элементов в образцах миокарда и сосудов человека методом рфа-СИ 96
4.1. Исследование распределения микроэлементов в разных участках миокарда у здоровых людей и при ишемической болезни сердца 96
4.2. Исследование элементного состава миокарда различных отделов сердца плодов и детей в норме и при врожденных пороках сердца 101
4.3. Изучение роли химических элементов в формировании и развитии аневризмы аорты 108
Основные результаты и выводы 111
Список литературы 113
- Количественные методы определения элементного состава биологических объектов: тканей сердца и сосудов
- Пробоподготовка стандартных образцов для РФА-СИ анализа
- Определение коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности химических элементов для международных биологических стандартных образцов в РФА-СИ анализе
- Оценка однородности распределения химических элементов в образцах ткани миокарда и сосудов человека. Воспроизводимость РФА-СИ анализа
Введение к работе
Актуальность темы. Для определения дефицита или избытка химических элементов в организме человека широко используется информация об уровнях их содержания в сыворотке и плазме крови. Однако, о распределении химических элементов между плазмой крови и органами, являющимися очагами патологических процессов известно очень мало. В работе сердца именно миокард (сердечная мышца) песет основную функциональную нагрузку. Микроэлементы играют ключевую роль в метаболизме миокарда, аккумулирование определенных микроэлементов или их дефицит может привести к развитию сердечнососудистых заболеваний. Установление локальных концентраций химических элементов в пораженных и здоровых тканях миокарда и сосудов имеет важное значение для изучения механизмов патологических процессов и является актуальной задачей. Литературные данные о содержании микроэлементов в миокарде и стенках аорты немногочисленны и противоречивы. Наиболее полную информацию о содержании макро- и микроэлементов можно получить на материале аутопсии, однако, наиболее актуальным представляется прямой анализ биопсийного материала (масса образцов < 1 мг, сухой вес) для получения прижизненной информации об элементном составе тканей. Разнообразие типов биотканей, видов патологий, функций отделов сердца диктует необходимость разработки методик анализа для каждого исследуемого объекта (типа ткани). Вышеперечисленные факторы приводят к тому, что содержание одних и тех же элементов в различных исследуемых образцах варьирует зачастую на несколько порядков величины. Метод рентгено-флуоресцеитиого анализа (РФА) с использованием синхротронного излучения (СИ) позволяет проводить прямой неразрушающий многоэлементный анализ образцов биотканей. Особенности СИ открывают следующие возможности для РФА: анализ образцов малого объёма и малой массы; снижение пределов обнаружения; проведение анализа с вариацией энергии возбуждающих квантов; большой запас интенсивности при использовании СИ позволяет резко уменьшить толщину образца.
При использовании методов внутреннего и внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в биотканях в основном используются методы мокрого или сухого озоления. Применяются синтетические стандартные образцы, полуэмпирические математические модели - ввиду отсутствия подходящих стандартных образцов. Основным требованием при использовании внешнего стандарта является близость химического состава матриц исследуемого и стандартного образца, а также уровней содержания элементов в них. Однако, в случае, когда содержание одних и тех же
элементов в исследуемых образцах варьирует значительно, возникает вопрос о выборе подходящего биологического стандартного образца. Таким образом, оценка возможности применения стандартных образцов с различной биологической матрицей (не идентичной матрице исследуемого образца) для определения широкого диапазона концентраций химических элементов при анализе биотканей является актуальной задачей.
Цель работы заключалась в разработке методических подходов для РФА-СИ анализа образцов миокарда и стенок сосудов у здоровых людей и пациентов с различными сердечнососудистыми патологиями, основываясь на применении способа внешнего стандарта для определения концентраций химических элементов в образцах.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
обосновать правомерность использования различных биологических стандартных образцов (матрица которых не идентична биологической матрице исследуемых тканей) для определения широкого диапазона концентраций химических элементов в различных типах мышечных тканей;
оценить рассеивающие характеристики матриц образцов и стандартов для обоснования использования стандартных образцов с разной биологической матрицей при определении концентраций химических элементов в разных типах мышечных тканей;
определить содержание химических элементов, концентрации которых не аттестованы в используемых стандартных образцах;
исследовать эффективность способа учега неидентичности геометрии образцов и стандартов при помощи нормирования площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния, что является необходимым этапом при анализе образцов биопсии;
оценить влияние неоднородности распределения химических элементов в используемых стандартных образцах на правильность определения концентраций химических элементов при анализе образцов малой массы (биопсия).
разработать методику недеструктивного РФА-СИ определения S, С1, К, Са, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, As, Se, Br, Rb и Sr в применении к образцам стенок сосудов и миокарда человека методом РФА-СИ;
апробировать аналитические данные (полученные при разработке методических подходов) при решении задач, поставленных Новосибирским иаучно-исслсдовагельским институтом патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкииа для изучения механизмов развития сердечнососудистых патологий, выявления возможных предикторов заболеваний для их более эффективной кардиохирургической коррекции.
Научная новизна работы:
для выбора внешнего стандарта при анализе образцов мышечных тканей методом РФА-СИ были впервые определены коэффициенты относительной спектрометрической чувствительности (по отношению к пику некогерентиого рассеяния) для каждого химического элемента в международных биологических стандартных образцах;
определено количественное содержание химических элементов (V. Mn, Bi\ Rb, Sr), концентрации которых не были аттестованы в используемых для РФЛ-СИ анализа биотканей международных биологических стандартных образцах па основе рассчитанных кривых относительной спектрометрической чувствительности;
впервые были оценены рассеивающие характеристики матриц образцов мышечных тканей (скелетные мышцы, миокард, сосуды) и различных биологических стандартов для обоснования правомерности использования разных стандартных образцов при РФА-СИ анализе тканей миокарда и сосудов;
для исследования уникальных образцов, полученных при биопсии (толщина которых варьирует) определена область значений поверхностной плотности, для которой нормирование площадей пиков определяемых элементов на площадь пика некогерентного рассеяния является эффективным способом учета неидентичности геометрии образцов и стандартов в случае излучателя «промежуточной» толщины.
Практическая значимость работы состоит в разработке методических подходов для определения S, С1, К, Са, V, Cr, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, As, Se, Br, Rb и Sr в образцах миокарда и стенок сосудов методом внешнего стандарта. Разработанные подходы применены для определения концентраций химических элементов в образцах, полученных при аутопсии и биопсии для: 1) установления физиологической нормы содержания элементов у здоровых людей, 2) определения степени отклонения концентраций элементов у больных при ишемической болезни сердца, пороках сердца и аневризме аорты от их «нормального» физиологического уровня содержания, 3) установления распределения химических элементов по отделам сердца у пациентов при ишемической болезни сердца и у детей с врожденным пороком сердца, а также по зонам миокарда (интактный миокард; зона инфаркта, рубца, периферии инфаркта). Полученные данные могут помочь в изучении механизмов возникновения и развития вышеперечисленных сердечнососудистых патологий, установить возможные элементы-маркеры развития заболеваний, а также позволяют наметить более эффективные способы коррекции заболеваний сердечно-сосудистой системы.
На защиту выносятся:
методика выбора внешнего стандарта для определения широкого диапазона концентрации химических элементов (от S до Sr) при анализе разных типов мышечных тканей методом РФЛ-СИ, используя международные биологические стандартные образцы;
результаты определения концентраций химических элементов, содержание которых не аттестовано в используемых биологических международных стандартных образцах;
методические подходы к анализу биопсийного материала малой массы методом РФА-СИ.
Личный вклад автора. Автором была проведена экспериментальная работа; произведены расчеты, необходимые для оценки рассеивающих свойств матрицы, коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности и соответствующих кривых, пределов обнаружения, концентраций химических элементов; проведена оценка метрологических характеристик. Автор принимал активное участие в апробации разработанных методик на биообъектах, наряду с научным руководителем и соавторами участвовал в написании всех имеющихся публикаций, обсуждении результаюв и выводов.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на следующих Международных и Всероссийских конференциях: VI Всероссийской конференции по рентгеноспектральному анализу, Краснодар, 2008г.; XVII Международной конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2008г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2008», Кавтат, 2008г.; X Аналитическом российско-германско-украинском симпозиуме ARGUS «Нано-аналитика», Саратов, 2007г.; Европейской конференции по рентгеновской спектрометрии «EXRS 2006», Париж, 2006г.; XVI Российской конференции но использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2006г.; Международной конференции «Аналитическая химия и химический анализ», Киев, 2005г.; IX Аналитическом россиско-германско-украинском симпозиуме «ARGUS», Киев, 2005г.; XIV Российской конференции по использованию синхротронного излучения, Новосибирск, 2004г.; VII Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего востока», Новосибирск, 2004г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 статей и 12 тезисов докладов на международных и российских конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), экспериментальной части (глава 2), обсуждения результатов (глава 3 и 4), выводов и списка цитируемой литературы (211 наименований). Диссертация изложена на 131 странице, содержит 42 иллюстрации и 16 таблиц.
Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте неорганической химии им. А.В. Николаева Сибирского отделения РАН, эксперименты проводились на экспериментальной станции элементного рентгено-флуоресцентного анализа в Центре синхротронного излучения на базе Учреждения Российской Академии Наук Института ядерной физики им. Г.И. Будкера Сибирского отделения РАН.
Автор выражает благодарность своему научному руководителю Труновой В.А., а также всем соавторам, в сотрудничестве с когорыми были проведены исследования, за всестороннюю помощь и поддержку.
Количественные методы определения элементного состава биологических объектов: тканей сердца и сосудов
В настоящее время забота о состоянии окружающей среды и оценке уровня ее загрязнения вследствие промышленной деятельности человека требует новых методов анализа содержания химических элементов (особенно тяжелых металлов) в органических матрицах. В связи с этим и изучение состояния организма человека требует проведения исследований на содержание химических элементов в тканях и биологических жидкостях человека [76]: накоплено большое количество разнообразных данных о содержании макро- и микроэлементов в различных органах и биологических жидкостях человека. Необходимо отметить, что определение содержания микроэлементов в биологических образцах требует использования чувствительных и селективных методов анализа [77]. В частности, для исследования мышечной ткани сердца и сердечных клапанов используются в основном такие многоэлементные методы анализа, как атомпо-абсорбционная спектрометрия [51, 55, 78, 79], атомно-эмиссионной спектрометрия с индуктивно связанной плазмой [27, 28, 80], метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой [31, 59, 81, 82], методы рентгепо-флуоресцентного анализа [24. 25], нейтронно-активационный анализ [55, 60]. Ohnishi Y et al. (2003) были проведены исследования степени аккумуляции элементов в артериях и клапанах сердца человека в зависимости от возраста. Содержание S, Р, Mg. Са, Fe, Си и Zn определяли методом ИСП-АЭС [27].
Также были предприняты исследования по изучению изменений в элементном составе миокарда человека в зависимости от возраста Tohno S. et al. (2007), содержание элементов от Р до Zn определялось методом ИСП-АЭС [28]. Eva Funseth et al. (2000) определяли содержание микроэлементов Al, Mg, Са, V, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, As, Se и Ag одновременно в плазме крови и в ткани миокарда здоровых мышей и мышей заражённых вирусом (coxsackie В virus) методом ИСП-МС [31]. В исследовании, предпринятом Nystrom-Rosander Christina et al. (2004), были определены концентрации 15 микроэлементов Al, As, Cd, Са, Со, Си, Fe, Pb, Mg, Mn, I Ig, Se, Ag, V и Zn методом ИСП-МС в крови и в ткани склерозированных аортальных клапанов пациентов и здоровых людей [59]. Frustaci A. et al. (1999) методом ИАА было определено содержание 32 элементов: Ag, As, Au, Ва, Са, Cd, Се, Со, Cr, Cs, Eu, Fe, Hf, Hg, Ir, La, Lu, Mo, Ni, Rb, Sb, Sc, Se, Sm, Sn, Sr, Та, Tb, Th, U, Yb, Zn и Zr в образцах ткани миокарда и скелетных мышц, полученных при биопсии (1,5 - 2,8 мг (сырая ткань)) у 13 пациентов с сердечной недостаточностью и у здоровых людей [60]. С помощью метода рентгено-флуоресцентного анализа с энергетической дисперсией были определены концентрации 14 элементов: Mg, Al, S, СІ, К, Са, Mn. Fe, Ni, Cu, Zn, Ga, Br и Sr в ткани аортальных клапанов, отобранных при аутопсии у 35 пациентов [24]. В настоящее время существует много методов элементного микроанализа для определения содержания химических элементов в тканях. В последнее время для исследования биологических образцов и, в частности ткани миокарда, чаще всего используются такие методы, как метод электронно-зондового микроанализа (ЭЗМА) [83-87] и рентгено-эмиссионный метод с возбуждением протонами [19, 88-90]. Хотя оба метода основаны на одном и том же принципе — регистрации характеристического рентгеновского излучения, генерируемого образцом при бомбардировании его заряженными частицами, есть существенные различия - в величинах пределов обнаружения и пространственном разрешении методов. Для протонов с энергией несколько МэВ тормозное излучение гораздо слабее по сравнению с электронами с энергиями в области кэВ, что обуславливает пределы обнаружения на уровне мкг/г и ниже. Эти пределы обнаружения на 2-3 порядка величины ниже, чем пределы обнаружения для электронно-зондовой микроскопии, однако, рентгено-эмиссионный метод с возбуждением протонами имеет худшее пространственное разрешение по сравнению с ЭЗМА [19]. При помощи рентгено-эмиссионный метода анализа с возбуждением протонами (размер микро-пучка 3x3 мкм ) на участках площадью 50x50 мкм было проведено исследование распределения Na, Mg, Р, S, К, Са и Fe (слои ткани толщиной 10-15 мкм были получены с помощью крио-микротома) в миокарде сердца крыс в условиях нормального кровотока и в условиях ишемии, а также у здоровых особей [19]. Было также проведено количественное определение внутриклеточных концентраций элементов Na, Mg, Р, S, СІ, К и Са в миокарде морских свинок при помощи электронно-зондового микроанализа [83]. Bradley М. Palmer et al. (2006) было проведено исследование внутриклеточного пространственного распределения 9 эссенциальных элементов (Р, S. О, К, Са, Mn, Fe, Си, Zn), обнаруженных в кардиомиоцитах с помощью метода рентгеновской флуоресценции с синхротронным излучением на микропучке. Изучение подробного пространственного распределения этих и других элементов может помочь объяснить структурную функцию элементов и их ионных форм как специализированных сигнальных переносчиков в кардиомиоцитах [91]. Полученные в ходе исследования данные о средних концентрациях элементов согласуются с данными, полученными другими исследователями ранее методами электронно-зондовой микроскопии [91]. Метод сканирующей туннельной микроскопии, спектроскопии обратного рассеяния и метод рентгеновской эмиссии с возбуждением про іонами были также использованы для исследования распределения элементов от Са до Zn в новообразовавшихся атеросклеротических повреждениях в стенке аорты у кроликов. Для определения концентраций элементов, в частности, Fe и Zn, был использован метод рентгеновской эмиссии с возбуждением протонами [41]. В целом, метод РЭС с возбуждением протонами в 2-5 раз более чувствителен, чем РФА с энергетической дисперсией, и больше подходит для анализа образцов, имеющих малые размеры.
Однако, часто для обоих методов при определении содержания ультрамикроэлементов требуется предварительный этап концентрирования из-за недостатка чувствительности (пределы обнаружения для обоих методов составляют мкг/г или несколько десятков мкг/г), что обычно осуществляется высушиванием образцов на воздухе, озолением (при низких температурах) или при помощи лиофилыюй сушки. Многие материалы, состоящие из элементов с низким Z, используются в качестве подложек (толщина менее 4 мкм): тонкие пленки углерода, Formvar, Kapton, Mylar, различные фильтры (Millipore, Nuclepore) и др. [92]. Что касается исследования элементного состава сердца, то в литературе за большой период времени приводятся данные о содержании химических элементов в сердце лишь как в целостном органе [31, 93], представлены отдельные данные по исследованию миокарда. В последнее время, в связи с развитием таких методов, как ИСП-МС, рентгено-эмиссионный метод с возбуждением протонами и электронно-зондового микроанализа появились данные исследований элементного состава и распределения элементов по отдельным компартментам сердца, участков ткани сердечных и аортальных клапанов [24, 59] а также исследования внутриклеточного элементного состава клеток миокарда [19, 83, 88, 91J. Данные литературы по содержанию химических элементов в различных отделах сердца у больных и здоровых людей приведены в таблице 2. Широко использующиеся методы атомно-абсорбционной спектрометрии (АЛС) отличаются высокой чувствительностью и возможностью определения очень низких концентраций элементов в биологических образцах. Эти методы, как правило, используются при анализе биологических жидкостей (цельной крови, мочи). В последнее время получили широкое распространение и считаются весьма эффективными методы определения
Пробоподготовка стандартных образцов для РФА-СИ анализа
Сухой материал стандартного образца (порошок; 80 мет) в количестве 8-20 мг спрессовывался при помощи гидравлического пресса (Р = 120 кг/см ) в таблетки диаметром 8 мм. Таблетки помещали между двумя маиларовыми пленками и закрепляли фторопластовыми кольцами. Поверхностная плотность таблеток стандартов составляла порядка 15 - 46 мг/см2, что соответствует «промежуточному» слою для РФА-СИ анализа [173] Для РФА-СИ анализа исследуемых образцов методом внешнего стандарта использовались следующие международные биологические стандартные образцы: Mussel NIES №6 (мышцы моллюска), Bovine liver NIST 1577 (печень быка), Beef liver NCS ZC 85005 (печень быка). Oyster tissue NIST 1566 (мягкие ткани устрицы), Human hair NIES №5 (волосы человека), Animal blood IAEA A-13 (цельная кровь животных), Freeze-dried human serum NIES №2 (сыворотка крови человека). Был проведен предварительный анализ различных майларовых пленок, используемых для рентгеновского анализа: №1 - пленка из пролена для рентгеновского анализа № 416 (Chemplex, USA), толщина 2,5 мкм; №2 - майларовая пленка №.021464 (Chemplex, USA), толщина 2,5 мкм; №3 - майларовая пленка № 01865-АВ (Structure Probe, Inc., USA), толщина 2.5 мкм; №4 - пищевая пленка (исследовалась па предмет возможного использования). Данные по оценке относительного содержания элементов в перечисленных выше пленках приведены на рис. 10. (Для учета различий в геометрии пленок, интегральные площади пиков химических элементов (Sp) нормировали на площадь пика комптоновского рассеяния). Наиболее высокие значения величины отношения Sp (элементауЭр (некогерентного рассеяния) наблюдаются для К, Са, Ті, Fe, Со, Ni, Си, Zn, Br, Sr в сравнении с остальными определяемыми элементами: S, CI. Sc, V, С г, Mn, As, Se, Rb, Y, Zr, Mo. Рис. 10. показывает, что наиболее высокие значения отношения площадей пиков наблюдаются для таких элементов, как Со и Ті в пленке №3, Са - в пленке №1 и №2, а также для Zn - в пленке №1, №2 и №4.
Для анализа биологических объектов (мышечных тканей) была выбрана пленка №3, поскольку в данном случае наблюдаются наиболее низкие величины отношений пиков для таких важных (с точки зрения определения в биологических образцах) элементов, как К, Са, Fe, Ni, Си, Zn, Br и Sr. 2.3. Пробоподготовка образцов биотканей. ФГУ Новосибирским научно-исследовательским институтом патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина (г. Новосибирск) были предоставлены образцы тканей миокарда (мышечной ткани сердца) здоровых людей и пациентов разного возраста с различными сердечно-сосудистыми патологиями (ишемическая болезнь сердца, порок сердца, различные формы сердечной недостаточности), а также образцы стенки аорты. Кроме того, исследовались образцы тканей грудной мышцы (скелетная мускулатура). Отбор образцов осуществлялся как при аутопсии {post mortem), так и при биопсии (в том числе - операционный материал). Все образцы тканей были зафиксированы с помощью формалина (№ 05-01004/F, Италия). Дополнительно был проведен анализ образцов формалина на предмет содержания примесей химических элементов. Для используемой марки не было выявлено наличия значительных примесей определяемых элементов. Материал хранился в растворе формалина не более 48 часов [174]. Было проведено исследование элементного состава ткани миокарда различных отделов сердца человека: правого и левого желудочка, правого и левого предсердия; зоны инфаркта миокарда, зоны на периферии инфаркта и рубца (соединительная ткань); также исследовались образцы, отобранные в различных частях аорты. Отобранные фрагменты ткани миокарда и стенок сосудов помещались во фторопластовые пленки и выдерживались под грузом в течение 12-36 часов (до постоянного веса сухой ткани) при комнатной температуре (t = 20 С) для придания им плоско-параллельной геометрии. Высушенные образцы помещались между двумя майларовыми пленками (№3) и закреплялись фторопластовыми кольцами [175, 176]. Масса образцов, отобранных при аутопсии, составляет порядка 6-12 мг (на сухой вес). Однако, в случае образцов, отобранных при биопсии, количество материала строго ограничено (масса образцов варьирует от 3 до 1 мг на сухой вес). Таким образом, после проведения пробоподготовки, вследствие различия масс проб, наблюдаются значительные вариации толщины анализируемых образцов (поверхностная плотность образца (учитывая площадь образца, облучаемую пучком СИ - эллипс) варьирует в данном случае от до 15 — 30мг/см2)[176]. Все используемые инструменты: скальпель для приготовления необходимых фрагментов аутопсийного материала (марка стали ЭИ-515), пинцет (с фторопластовым наконечником) обрабатывались этиловым спиртом марки "ОСЧ" (ГОСТ 10749-80). Перед упаковкой образцов в майларовые пленки последние также обрабатывались этиловым спиртом. Концентрации химических элементов в образах рассчитываются методом внешнего стандарта, в качестве которого используются международные биологические стандарты, перечисленные выше. Концентрации химических элементов рассчитываются по следующей формуле: (И), Xmi; ц xmi и ц mi, Ц mi - массовые коэффициенты поглощения для первичного излучения и аналитической линии і, соответственно в пробе и эталоне, р и \(/ - углы падения первичного излучения и отбора флуоресцентного излучения из пробы.
Подбирая эталон (внешний стандарт) соответствующего состава, когда наполнители проб и образца имеют близкий химический состав, а концентрации определяемого элемента в анализируемых пробах меняются мало, приходим к упрощенному виду формулы [133, 177, Геометрия измерений: монохроматизированнный пучок СИ попадает на образец под углом 45 к его поверхности, возбуждая флуоресценцию в образце; отбор флуоресцентного излучения также осуществляется под углом 45 по отношению к поверхности образца. Детектор располагается под углом 90 по отношению к направлению падающего первичного излучения. Длина пути флуоресцентного излучения от образца до детектора составляет 3 см. Измерения проводились в различных режимах энергии первичного возбуждения: от 12 до 23 кэВ. Режимы энергии возбуждения были подобраны в соответствии с тем, содержание каких химических элементов должно было быть определено. Величина энергии возбуждающих квантов должна на 4-6 кэВ превышать величину К-края поглощения самого тяжелого из определяемых элементов (по К-линиям флуоресцентного излучения). Для разложения спектра по энергиям флуоресцентных квантов используется многоканальный анализатор OXFORD (номер 03.80.26-102061, Oxford Instruments Inc., USA). Набор спектра при измерении отображается при помощи OXFORD WFNMCA, в режиме 2048 каналов. Время набора спектров варьировало от 400 до 1000 секунд. Интенсивность флуоресцентных линий определяемых элементов в данном случае представляет собой количество квантов флуоресценции/ в ед. времени. Примеры флуоресцентных спектров для стандарта Mussel NIES №6 и образца стенки аорты (аневризма) представлены на рис. 11 и 12 в координатах: каналы энергии флуоресцентных квантов (ось абсцисс) и интенсивности линий (ось ординат). Основной вклад в фон вносит, главным образом, излучение, некогерентно рассеянное в образце, которое превалирует в органической матрице (легкие элементы: II, С, N, О). Размер коллиматора (пучка СИ) выбирается в соответствии с размером образца. Условия измерений идентичны для образца и стандарта. Вследствие циклической работы ВЭПП-3 и падения тока пучка электронов, интенсивность СИ падает на протяжении 4-6 часов непрерывной работы. Таким образом, принята следующая схема измерений, которая является наиболее оптимальной: три образца - стандартный образец (эталон) -три образца и т.д. [170].
Определение коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности химических элементов для международных биологических стандартных образцов в РФА-СИ анализе
Для определения коэффициентов относительной спектрометрической чувствительности и построения соответствующих кривых для каждого из используемых международных биологических образцов было проведено по 5 параллельных измерений в трех режимах энергии возбуждения (Есх): 13, 18 и 20 КэВ. Живое время измерения составляло tijVC = 500 с. Коэффициенты спектрометрической чувствительности (RjS) по отношению к комптоновскому пику для каждого элемента в каждом из стандартных образцов были рассчитаны по следующей формуле [76, 143, 154]: где NIS - интегральная площадь пика Ка-линии элемента і в стандартном образце, NJNC -площадь пика некогерентно рассеянного излучения (комптоновское рассеяние). CjS -концентрация элемента і в стандарте (аттестованное значение). В данном случае пик некогерентного излучения используется в качестве внутреннего стандарта. При этом необходимо, чтобы выполнялись следующие условия: излучение первичного источника возбуждения должно быть монохроматическим; матрица образца должна состоять из легких элементов (Н, С, N, О), содержание (тяжелых) химических элементов в образцах должно быть на уровне ррт. В настоящем исследовании при использовании монохроматического СИ для возбуждения флуоресценции биотканей (легкая матрица) выполняются все вышеперечисленные условия. Все кривые относительной спектрометрической чувствительности были аппроксимированы полиномиальными функциями второго и третьего порядка [143, 154]. Стандартное отклонение для коэффициентов относительной чувствительности (Rjs, формула 14) рассчитывалось по следующей формуле: где RiS - рассчитанная по формуле 1 величина коэффициента относительной чувствительности, Spi — площадь пика Ка-линии элемента і в стандарте, Spincoi, - площадь пика некогерентного (комптоновского) рассеяния в стандарте, Qs - концентрация элемента і в стандарте (паспортное значение), SDRJS, SDspi, SDspincoh, SDCis - стандартные отклонения соответствующих величин (для опорных значений концентраций элементов, приведенных в паспорте стандартного образца, величина стандартного отклонения принята равной 20%). При п (5) параллельных измерений одного стандартного образца необходимо учитывать также воспроизводимость измерений [175, 176, 182, 183].
В используемых стандартных образцах аттестовано содержание не всех химических элементов. Паспортные значения концентраций химических элементов в используемых международных стандартных образцах приведены в таблице 5. Как видно из таблицы, не определено содержание таких важнейших (в исследовании биотканей) микроэлементов, как Mn, Br, Rb, Sr и др. Соответственно, определение их содержания в используемых для анализа биотканей стандартных образцах является необходимым этапом работы. После серии измерений и расчетов было определено содержание следующих химических элементов, концентрации которых не аттестованы в стандартном образце NIKS №6 Mussel: V - 0.52 ± 0.11 мкг/г (Есч =13 кэВ), Вг - 98 ± 5 мкг/г (Еех = 20 кэВ), Rb -2.70 ± 0,44 мкг/г (Ееч = 20 кэВ) [175, 176,182-184]. Для стандартного образца NIST 1566 Oyster tissue аналогичным образом было определено содержание Вг. Найденная концентрация брома составляет 64 ± 6 мкг/г. Рассчитанные концентрации химических элементов, не аттестованные в стандартном образце Animal blood IAEA Л-13, составляют: Mn - 3.7 ± 0.4 и Sr - 0.20 ± 0.02 мкг/г 1176]. Содержание Вг и Rb, определенное для стандартного образца мышечной ткани моллюска (Mussel NIES №6) близко к уровням содержания этих элементов в исследуемых образцах ткани миокарда человека. Коэффициенты относительной чувствительности для не аттестованных элементов определялись по кривым относительной спектрометрической чувствительности (Рис. 18. 19, 20, и 21), построенным для соответствующих стандартных образцов (на основании рассчитанных коэффициентов относительной чувствительности, полученным для аттестованных элементов) при энергиях возбуждения (Еех) 20 кэВ и 13 кэВ. Все кривые были аппроксимированы полиномиальными функциями второго порядка. Концентрации всех химических элементов были рассчитаны по формуле 14 (с учетом достоверности аппроксимации кривых). На графиках также приведены величины стандартных отклонений для коэффициентов относительной чувствительности, которые характеризуют воспроизводимость результатов РФА-СИ анализа (п=5) [175, 176, 183, 184].
Оценка однородности распределения химических элементов в образцах ткани миокарда и сосудов человека. Воспроизводимость РФА-СИ анализа
Воспроизводимость результатов анализа (Sri%) в методе РФА-СИ может варьировать в зависимости от выбранного режима энергии возбуждения флуоресценции, для определяемых элементов эта величина также варьирует. Значение воспроизводимости определялось в стационарном режиме при неизменном положении образца (или стандарта). Неоднородность распределения химических элементов в образцах и стандартах учитывалась путем усреднения данных, полученных при измерении образца при его последовательных поворотах (п=8- -20). При этом, полученные данные (Sr2%) характеризуют как воспроизводимость, так и неоднородность распределения элемента (суммарный фактор). Данные воспроизводимости и степени однородности распределения определяемых элементов в стандартных образцах представлены в таблице 9 на примере стандарта мышечной ткани моллюска (Mussel NIES №6). В таблице 10 приведены значения воспроизводимости результатов анализа (Sri%), а также результаты, полученные при поворотах образца (миокард левого желудочка сердца - ишемическая болезнь сердца) в ходе измерений (Sr2%) при энергии возбуждения флуоресценции 12 кэВ. Данные были получены для серии образцов миокарда. В данном случае представлены результаты для того образца, для которого величины Sri и Sr2 были максимальными. В таблице 11 приведены аналогичные данные для образца ткани гипертрофированного миокарда левого желудочка при энергии возбуждения флуоресценции 23 кэВ. Содержание Сги Se в данном образце - ниже пределов обнаружения. 3.7. Проверка правильности результатов РФА-СИ анализа образцов миокарда и сосудов человека. Для проверки правильности результатов анализа был проведен одновременный анализ нескольких стандартных образцов.
В таблице 7 приведены данные полученные при одновременном измерении стандартных образцов мышечной ткани моллюска (Mussel NIES №6) и мягких тканей устрицы (Oyster tissue NIST 1566). Полученные значения концентраций элементов для Mussel NIES №6, определенные при помощи Oyster tissue NIST 1566, который использовался в качестве внешнего стандарта, попадают в доверительный интервал их паспортных значений. Величины концентраций приведены в мкг/г (сухой вес). Кроме того, был проведен анализ случайно выбранных образцов ткани миокарда (материал аутопсии: врожденный порок сердца - левый желудочек сердца) методом РФА-СИ и методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС). Образцы №1 и 2 были проанализирован методом РФА-СИ, затем проводился ИСП-АЭС анализ тех же образцов, так как метод РФА-СИ является недеструктивным методом анализа. Масса образцов №1 и 2 составляла 8,9 и 7,9 мг, соответственно. Анализ образцов миокарда сердца человека методом ИСП-АЭС осуществлялся при помощи атомно-эмиссионного спектрометра с индуктивно связанной плазмой IRIS Advantage (Thenno Elemental, Jarrell Ash Corporation, USA)) в ОИГТМ CO РАН. Для разложения органической матрицы образцов использовалась смесь I мл IINO3 (70%) и 0,5 мл II2O2 (30%) (ОСЧ ТУ 6-02-570-75). Разложение проводилось в микроволновой печи (t=180 Mars 5, СЕМ Corporation, USA). После разложения пробы охлаждали в течение 10-20 мин до температуры 25-30 С. После разложения к полученному бесцветному раствору добавляли 0,80 мл Sc (100 мг/л) в качестве внутреннего стандарта и доводили объем раствора до 4 мл водой Milli-Q, после чего производился ИСП-АЭС анализ. Число параллельных измерений п = 3. Пробоподготовка образцов для анализа метода РФА-СИ проводилась практически без использования каких-либо реагентов, за исключением этилового спирта ("ОСЧ" ГОСТ 10749-80), который применялся для обработки инструментов, которыми производилось иссечение определенной массы образца из полученного материала. Образцы высушивались при комнатной температуре. Съемка образцов производилась в режиме энергии возбуждения 19 кэВ. Было проведено 6 параллельных измерений. Значения концентраций определяемых элементов, полученные в ходе анализа данными методами, представлены в таблице 8. Метод РФА-СИ не позволяет проводить определение более легких элементов (Na, Mg, Si). Для этого необходимо проводить измерения в вакуумной камере. Таким образом, данные о концентрациях соответствующих элементов приведены только для метода ИСП-АЭС. Однако, в случае ИСП-АЭС отсутствуют данные о концентрациях таких элементов, как Р, S, CI, Cr, Ni, Se, Br и Rb. Данные о содержании Mn, Fe и Си хорошо согласуются между собой. Для других элементов: К, Zn, Sr данные по одному образцу (№2) хорошо согласуются, тогда как в случае образца №1 наблюдаются некоторые расхождения в результатах анализов. Величины концентраций Са, полученные в результате анализа методом ИСП-АЭС, вышены по сравнению с результатами, полученными при анализе методом РФЛ-СИ. Более высокие концентрации также обнаруживаются и для Zn и Sr (образец №1) для ИСП-АЭС. Нужно отметить, что масса образцов являлась критической для ИСП-АЭС анализа. Разработанные методические подходы были применены для определения содержания макро- и микроэлементов (МЭ) в различных участках сердечной мышцы (миокарда) у больных и здоровых людей, в стенках аорты у пациентов разного возраста и при различных заболеваниях. Литературные данные, касающиеся изучения МЭ у больных с инфарктом миокарда (ИМ) и ишемической болезнью сердца, крайне противоречивы и посвящены определению уровней МЭ в основном в плазме крови. Однако, именно миокард несет основную функциональную нагрузку при сократительной работе сердца, нагрузка на различные функциональные отделы сердца различна.
Была проведена работа по изучению распределения МЭ в разных отделах сердца: гипертрофированный участок миокарда левого желудочка (ЛЖ), правый желудочек (ПЖ), зона инфаркта, зона рубца, стенка аорты у больных с диагнозом ишемическая болезнь сердца (5 пациентов), перенесших инфаркт миокарда (ИМ). В качестве контрольных образцов была принята норма содержания химических элементов, приведенная в литературе (принята за единицу). Весь материал был получен при аутопсии (post mortem) (31 образец миокарда). Бы ло определено содержание 18 элементов: S, С1, К. Са, Р. Ті, Сг, Mn, Fe, Ni, Си, Zn, Se, Br, Rb, Sr, Ba, I [186]. При ишемической болезни сердца основные нарушения коронарного кровообращения и основная нагрузка связаны с ЛЖ сердца. Был проведен сравнительный анализ содержания макро- и микроэлементов в ЛЖ и ПЖ сердца (Рис. 33.). Было обнаружено, что количество макроэлементов в ЛЖ по сравнению с ПЖ было выше в несколько раз: Р - в 15 раз, О и К - в 2,7 раза, S - в 1.4 раза. Похожие закономерности выявлены для МЭ. В ЛЖ повышено содержание Rb в 2,8 раза, Ni - в 2,4 раза, Си - в 1,8 раза, Мп - в 1,7 раза, Вг - в 1,3 раза, Fe - в 1,2 раза. При сравнении гипертрофированного и негипертрофированного миокард ЛЖ (Рис.34), обнаруживается, что содержание макроэлементов С1 и К было ниже в 2 раза в гипертрофированном миокарде ЛЖ, а Са - выше в 1,3 раза но сравнению с нормальным. Уровни содержания следующих элементов в гипертрофированном ЛЖ были значительно выше по сравнению
Похожие диссертации на Разработка методических подходов для элементного анализа тканей сердца и сосудов человека методом рентгено-флуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения
