Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
1.1. Основные проблемы анализа чистых органических веществ13
1.2. Методы определения содержания основного компонента в чистых органических веществах 14
1.3. Методы определения содержания основного компонента в фармацевтических препаратах 22
1.4. Методы одновременного определения общего содержания фтор-, хлор,, бром-, серо- и фосфорорганических примесей в чистых органических веществах 28
Глава 2. Оборудование, исходные вещества и описание эксперимента 37
2.1. Оборудование 37
2.2. Исходные вещества и материалы 42
2.3. Описание эксперимента 47
2.3.1. Автоматический элементный анализ для определения азота в органических соединениях 47
2.3.2. Высокотемпературное разложение в потоке кислорода (окислительная конверсия) для определения общего содержания галоген-, серо- и фосфорорганических соединений 48
2.3.3. Приготовление растворов анионов 49
2.3.4. Ионно-хроматографический анализ 49
Глава 3. Разработка способов определения содержания основного компонента в чистых органических веществах и содержания активного вещества в фармацевтических препаратах, основанных на элементном анализе 50
3.1. Разработка способа определения степени чистоты азоторганических соединений, основанного на элементном анализе 51
3.2. Контроль качества фармсубстанций и других чистых органических веществ при использовании разработанного способа определения степени чистоты 64
3.3. Разработка способа анализа фармацевтических препаратов на содержание активного вещества 68
3.4. Определение содержания активного вещества в твердых фармацевтических препаратах с использованием предложенного способа 69
Глава 4. Разработка способа анализа чистых органических веществ на содержание фтор,, хлор,, бром,, серо- и фосфорорганических примесей 85
4.1. Оптимизация условий ионохроматографического определения анионов на следовом уровне 87
4.2. Изучение высокотемпературной окислительной конверсии галоген,, серо- и фосфорорганических веществ до соответствующих анионов 94
4.3. Определение общего содержания фтор-, хлор,, бром,, серо-и фосфорорганических примесей в образцах чистых органических веществ, молекулы основного компонента которых не содержат определяемых элементов 99
Выводы 104
Список литературы 106
- Методы определения содержания основного компонента в фармацевтических препаратах
- Разработка способа определения степени чистоты азоторганических соединений, основанного на элементном анализе
- Определение содержания активного вещества в твердых фармацевтических препаратах с использованием предложенного способа
- Изучение высокотемпературной окислительной конверсии галоген,, серо- и фосфорорганических веществ до соответствующих анионов
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальных проблем анализа чистых органических веществ и фармацевтического анализа является разработка быстрого и универсального метода определения содержания основного компонента. Такие методы необходимы для улучшения контроля качества чистьк органических веществ и фармпрепаратов и для быстрого обнаружения фальсификатов.
Для проведения контроля качества химической продукции высокой чистоты наиболее часто используют газовую хроматографию, а для анализа фармацевтической продукции — ВЭЖХ, при этом контроль в общем случае осуществляют на известные примеси. В то же время состав примесей, особенно в чистых органических веществах, как правило, полностью неизвестен, поэтому необходимо предварительно проводить оптимизацию условий разделения с целью увеличения числа регистрируемых примесей. Следует отметить, что отделение примесей, схожих по физико-химическими свойствам с основным компонентом, часто является неразрешимой задачей. Кроме того, определение состава примесей затруднительно в связи с их малым содержанием на фоне основного компонента, концентрация которого на порядки превосходит концентрацию примесей. Для проведения количественного анализа необходимо наличие стандартных образцов определяемых веществ, характеристика которых представляет самостоятельную проблему. В то же время требуется осуществление быстрого контроля качества продукции.
В случае прямого хроматографического определения содержания, основного компонента стандартные образцы определяемых веществ (охарактеризованные в выбранных условиях разделения для конкретного вещества и примесей) отсутствуют. Вместо них используют образцы, степень чистоты которых определяют хроматографическим методом вычитанием из 100% суммы концентраций зарегистрированных примесей (если они известны). В случае неизвестных примесей их концентрацию оценивают методом нормировки. Обычно степень чистоты стандартных образцов принимают равной 100%. При прямом определении содержания основного компонента используют метод внешнего стандарта. Погрешность определения может составлять 3% и более. Прямое определение степени чистоты органических веществ с использованием стандартных образцов для большинства органических веществ практически неосуществимо в связи с отсутствием последних. Отдельной проблемой является само определение степени чистоты стандартных образцов и стабильность таких образцов при хранении.
В случае косвенного хроматографического определения содержания основного компонента регистрируют лишь малую часть присутствующих примесей в связи с трудностью их отделения от основного по концентрации компонента и их обнаружения. Это связано с неизвестностью числа и состава примесей и сложностью их регистрации в присутствии основного компонента. Кроме того, при таком подходе не учитываются примеси, неэлюируемые в выбранных условиях из колонки. В этом случае можно утверждать, что ?<с0к. < 100%-2с,, то есть левая граница доверительного интервала не определена. Из приведенного неравенства видно, что результаты определения основного компонента всегда завышены, что выгодно производителю.
В случае как прямого, так и косвенного определения, фактически определяют содержание основного компонента в смеси, вышедшей из хроматографической колонки при выбранных условиях анализа, специфических для каждого анализируемого вещества, а не истинное содержание в анализируемом образце, так как не учитываются неэлюируемые примеси (особенно это справедливо при использовании метода внутренней нормировки).
Последние могут быть зарегистрированы только методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), которая не получила широкого распространения при анализе чистых органических веществ в связи с меньшей эффективностью разделения. Таким образом, результаты хроматографического определения основного компонента в чистых органических веществах являются в общем случае неопределенными и малодостоверными и требуют больших затрат времени на проведение определения.
Актуальным является поиск новых подходов к контролю качества рассматриваемой продукции, позволяющих сократить время анализа и обеспечить универсальность определения. Сокращение времени анализа особенно актуально для решения проблемы быстрого обнаружения фальсификатов чистой химической продукции (таможенный контроль), фармсубстанций и фармпрепаратов и обеспечения оперативного контроля качества рассматриваемой продукции.
Актуальным является и оперативный контроль суммарного содержания в фармацевтической и химической продукции F-, С1-, Вг-, Р- и S-органических соединений на уровне следов, так как примеси этих соединений в чистых органических веществах определяют потребительские качества продукции и ее безопасность. Особенно это относится к фармацевтической продукции.
Цель работы: разработка способа определения содержания основного по концентрации компонента в чистых органических веществах и фармацевтических субстанциях и содержания активного вещества в различных формах фармпрепаратов, основанного на элементном анализе, как универсального и экспрессного метода контроля качества чистых органических веществ и фармпрепаратов. Кроме того, целью работы являлась разработка способа определения общего содержания примесей, содержащих такие элементы, как галогены, серу и фосфор в чистых органических веществах, основной компонент которых не содержит таких элементов в молекуле.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработать способ определения степени чистоты твердых азоторганических соединений с использованием элементного анализатора.
-
Разработать способ определения активного вещества в твердых фармацевтических препаратах.
-
Разработать способ определения содержания активного вещества в водных растворах фармацевтических субстанций.
-
Сопоставить результаты определения содержания активного вещества в образцах фармпрепаратов и основного компонента в чистых органических веществах с использованием разработанных способов и стандартных способов контроля качества.
-
Разработать способ определения содержания активного вещества в микрокапсулированных фармпрепаратах.
-
Разработать способ определения общего содержания фтор-, хлор-, бром-, серо- и фосфорорганических примесей в чистых органических веществах, молекулы которых не содержат этих элементов.
-
Определить общее содержание фтор-, хлор-, бром-, серо- и фосфорорганических примесей в различных чистых органических веществах при использовании предложенного способа элементного анализа на эти элементы.
Научная новизна работы. Разработан способ определения степени чистоты твердых органических веществ, содержащих в молекуле азот, основанный на элементном анализе и взятии таких навесок общепринятого стандарта и исследуемого вещества, чтобы соответствующие количества азота, полученные в результате конверсии, были близки по величине. Способ является универсальным быстрым и, в отличие от общепринятых методов,
не требует использования стандартных образов исследуемых веществ. Показано, что погрешность определения содержания основного компонента не превышала 1% отн. и не было значимого расхождения с результатами определения другими методами.
Разработан способ определения содержания активного вещества в твердых фармпрепаратах, в которых соотношение количеств наполнитель/активное вещество варьировалось в широком диапазоне. Сопоставление результатов определения активного вещества в ряде фармпрепаратов этим и общепринятыми методами показало отсутствие значимого расхождения результатов определения.
Разработан способ определения содержания активного вещества в водных растворах, основанный на нанесении раствора на сорбент, не содержащий азота, и определении активного вещества способом, предложенным нами для анализа твердых веществ. Анализ ампулированных водных растворов ряда фармсубстанций при использовании разработанного метода показал отсутствие расхождения полученного и специфицированного содержаний активного вещества в пределах технологического допуска.
Разработан способ определения содержания активного вещества в микрокапсулированных фармпрепаратах, основанный на сожжении микрокапсул и определении содержания такого вещества при использовании способа, предложенного нами для анализа твердых фармпрепаратов.
Разработан способ определения общего содержания фтор-, хлор-, бром-, серо- и
фосфорорганических примесей в чистых органических веществах, в состав молекул
основного компонента которых не входят перечисленные элементы. .і
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработан универсальный способ определения содержания основного компонента в чистых органических веществах, содержащих в молекуле азот, не требующий использования стандартных образцов определяемых веществ. Предложенный способ позволяет проводить определение степени чистоты органических веществ с погрешностью, не превышающей 1% отн. Разработаны способы определения активного вещества в фармпрепаратах (твердых, водных растворах и микрокапсулированных фармпрепаратах). Показано, что погрешность этих способов сопоставима либо меньше общепринятых методов контроля качества лекарственных средств. Предложенные способы могут быть использованы для проведения экспрессного контроля качества чистых органических веществ и фармацевтических препаратов. Предложенный подход позволяет осуществлять быстрый скрининг проб на выявление фальсификатов и открывает новые возможности для организации надежного экспрессного контроля качества фармацевтических субстанций и препаратов и различных чистых органических веществ. Разработан способ определения общего содержания галоген-, серо- и фосфорорганических примесей в чистых органических веществах, не содержащих эти элементы в молекуле основного компонента. Этот способ позволяет определить общее содержание примесей наиболее опасных соединений.
На защиту вынесены следующие положения:
-
Способ определения степени чистоты твердых азоторганических соединений с использованием элементного анализатора.
-
Способ прямого определения содержания активного вещества в твердых фармацевтических препаратах.
-
Способ определения содержания активного вещества в водных растворах фармацевтических субстанций.
-
Способ определения содержания активного вещества в микрокапсулированных фармпрепаратах.
5. Способ определения общего содержания фтор-, хлор-, бром-, серо- и фосфорорганических примесей в чистых органических веществах, молекулы которых не содержат этих элементов.
Апробация работы. Результаты работы представлены в виде стендовых докладов на Шестьдесят девятом Международном Конгрессе по Фармацевтике и Фармацевтическим Наукам ICFIP'2008 (Базель, Швейцария, 2008 г.); Тридцать втором Международном Симпозиуме по Капиллярной Хроматографии ISCC08 (Рива дель Гарда, Италия, 2008 г.); Всероссийском Симпозиуме «Хроматография и Хромато-масс-спектрометрия» (Клязьма, Россия, 2008 г.); Всероссийской Конференции «Теория и Практика Хроматографии. Хроматография и Нанотехнологии» (Самара, Россия, 2009 г.); Третьей Всероссийской Конференции «Аналитика России 2009» (Краснодар, Россия, 2009 г.); Тридцать четвертом Международном Симпозиуме по Капиллярной Хроматографии ISCC10 (Рива дель Гарда, Италия, 2010 г.); Всероссийской Научно-практической Конференции «Хроматография — народному хозяйству» (Дзержинск, Россия, 2010 г.); Съезде аналитиков России «Аналитическая Химия — Новые Методы и Возможности» (Клязьма, Россия, 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы
Методы определения содержания основного компонента в фармацевтических препаратах
Для лекарственных препаратов содержание активного вещества считают одной из их важнейших характеристик. Знание его необходимо как для контроля качества фармпрепаратов, так и для обеспечения возможности быстрого распознавания фальсификатов.
В настоящее время во всем мире и, в частности, на фармацевтическом рынке России, все большее распространение получают фальсифицированные лекарственные средства. Различают несколько видов фальсификации:
- имитация препаратов, не содержащая активное вещество или содержащая его недостаточное количество;
- имитация препаратов, содержащая другое активное вещество (не соответствующее указанному в маркировке);
- препараты, содержащие загрязняющие или токсические вещества.
Анализ 771 сообщения о фальсифицированных препаратах, полученных Всемирной Организацией Здравоохранения в период с 1982 по 1999 г., показал, что около 60% из них не содержали активного вещества, 19% содержали неправильное количество активного вещества, 16% содержали не те активные вещества, которые указаны в маркировке [24],
Стадия пробоподготовки, предшествующая анализу фармацевтических препаратов, должна отвечать следующим требованиям [25-27]:
- извлечение определяемого соединения из образца должно быть количественным или же воспроизводимым от образца к образцу. Желательно, чтобы степень извлечения определяемого соединения из образца при анализе фармацевтических субстанций и препаратов в процессе пробоподготовки составляла 100%. В этом случае получают наиболее точные результаты;
- последующую пробоподготовку проводят без потерь определяемого соединения;
- в процессе пробоподготовки полученный раствор не загрязняют примесями, мешающими дальнейшему анализу.
В процессе пробоподготовки целевое вещество должно быть переведено в раствор, удовлетворяющий следующим требованиям:
- раствор должен быть гомогенным;
- концентрация определяемого соединения в растворе должна находиться в пределах рабочего диапазона определяемых концентраций прибора, на котором будут производить дальнейший анализ;
- раствор определяемого соединения стабилен до и во время проведения анализа. В противном случае используют дополнительные стадии пробоподготовки, например, корректировка рН. Это особенно важно для определения следовых количеств примесей или методов, связанных с разложением образца.
Условия экстракции должны быть выбраны таким образом, чтобы степень извлечения определяемого соединения из образца была как можно более полной. Кроме того, при выборе растворителя необходимо учитывать особенности последующего метода анализа полученного раствора. Так, например, в ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии, ВЭЖХ и ГХ требования к растворителям различны. Наиболее часто при анализе фармпрепаратов на содержание активного вещества используется ВЭЖХ. Таким образом, последовательность разработки метода анализа сложной смеси можно описать следующим образом [28]:
- оптимизация хроматографического разделения;
- оптимизация пробоподготовки;
- оптимизация сочетания пробоподготовки с инструментальным методом определения.
В случае ВЭЖХ, если это возможно, то для растворения образца лучше всего использовать растворитель, являющийся подвижной фазой в системе ВЭЖХ. Однако из-за плохой растворимости или стабильности определяемого соединения не всегда оказывается возможным использовать в качестве растворителя подвижную фазу.
При выборе растворителя для определяемого соединения в случае ВЭЖХ большое внимание уделяют различным хроматографическим эффектам. Из литературы хорошо известны проблемы изменения времени удерживания исследуемых веществ, размывания пиков, вызванные влиянием растворителя — его природой, концентрацией, ионной силой, рН [29].
Таким образом, для проведения анализа фармацевтических препаратов на содержание активного вещества в соответствии с общепринятыми методами необходима предварительная специфическая пробоподготовка. Методы определения активного вещества, входящего в состав различных фармпрепаратов, подробно описаны в Международной, Европейской и других Фармакопеях. Однако каждый метод анализа. описанный в этих справочниках, является специфицированным подходом при анализе каждого конкретного фармпрепарата.
Так, например, для определения основного компонента в препаратах каптоприла и преднизолона в таблетированной форме, известно множество различных аналитических подходов: иодометрическое титрование, жидкостная хроматография с УФ-детектором, ВЭЖХ с хемилюминесцентным детектором, флуориметрия, вольтамперометрия, колориметрия, потенциометрия, использование биосенсеров [30]. Каждый из них характеризуется своими преимуществами и недостатками. Выбор метода анализа будет зависеть от цели конкретной аналитической задачи.
Согласно Европейской Фармакопее и Фармакопее Соединенных Штатов официальным аналитическим методом для определения лекарственного вещества бацитрацина в сырьевом материале и фармацевтических препаратах является микробиологический анализ [31]. Микробиологические методы являются достаточно надежными в отношении определения биологической активности вещества. Эти методы основаны на измерении интенсивности развития микроорганизмов в зависимости от количества определяемого вещества. К основным недостаткам микробиологических методов относят высокую трудоемкость и продолжительность измерений, низкую чувствительность. Кроме того, на определяемую антимикробную активность препарата влияют примеси присутствующие в анализируемом образце которые также характеризуются определенной антимикробной активностью.
Использование жидкостной хроматографии для определения бацитрацина также имеет ряд недостатков. Относительно низкий коэффициент поглощения бацитрацина в УФ-области приводит к низкой чувствительности фотометрического детектирования. В этом случае для получения удовлетворительных результатов обычно используют послеколоночную дериватизацию.
В то же время хорошо известны и недостатки дериватизации: зависимость реакции дериватизации от различных экспериментальных параметров; неполнота реакции дериватизации; использование подвижной фазы, перегруженной реагентом; длительное время анализа; дополнительные затраты на систему дериватизации и реагенты. В результате высокая стоимость и сложность такого подхода делает его использование нецелесообразным в случае поточного анализа.
В ряде работ [32, 33] определение содержания активного вещества в фармпрепаратах определяли с помощью метода инфракрасной спектроскопии в ближней инфракрасной области (БИК) в сочетании с соответствующим программным обеспечением (без которого метод БИК не применим). Метод БИК может быть использован для анализа жидких и твердых фармпрепаратов [34]. Он находит пока еще ограниченное применение для быстрого неразрушающего контроля качества фармпрепаратов в промышленности и для быстрого скрининга проб таких препаратов на фальсификаты.
Метод БИК не является основным методом анализа. Для разработки должной количественной модели необходимо определение качества проб, которые будут использованы для построения этой модели с использованием другого сравнительного метода. Для построения математической количественной модели и оценки ее адекватности необходимо наличие нескольких наборов проб. Первый набор (градуировочный набор) используется для построения модели. Второй набор, называемый набором для оценки адекватности модели, используется для оценки возможности модели предсказывать содержания активного вещества в неизвестных пробах. Оба набора должны быть независимыми и должны состоять из проб относящихся к различным партиям. Проведение градуировки требует большого числа проб, больших затрат времени и дорого ввиду необходимости проведения анализов другим сравнительным методом Градуировка проведенная на одном приборе не может быть воспроизведена на каждом новом спектрометре Поэтому проводят разработку такой модели которая могла бы быть использована на нескольких спектрометрах с одинаковой погрешностью предсказания результата определения
Разработка способа определения степени чистоты азоторганических соединений, основанного на элементном анализе
Для решения задачи контроля качества чистых азоторганических веществ, в частности фармсубстанций, нами был разработан способ определения степени чистоты твердых таких веществ при использовании элементного анализатора. Для достижения высокой точности определения необходимо было оптимизировать условия проведения элементного анализа.
Для проведения элементного анализа органических соединений в настоящее время различными фирмами производится автоматизированное оборудование. В нашей работе для определения азота мы использовали элементные анализаторы модели «Flash ЕА 1112» фирмы «Thermo» (Италия) и «Dumatherm» фирмы «Gerhardt» (Германия). Приборы снабжены автосамплером, позволяющим определять элементный состав большого числа образцов в автоматическом режиме. В подавляющем большинстве случаев эти приборы используются для анализа твердых веществ.
Подобное оборудование предназначено для проведения определения содержания азота в органических соединениях. Схема осуществления анализа основана на классическом методе Дюма, который заключался в том, что из образующихся после сожжения навески продуктов конверсии удаляют воду и диоксид углерода сорбцией на соответствующих сорбентах. Оксиды азота на восстановленной меди превращают в азот (N2). В элементном анализаторе он регистрируется с помощью катарометра [65]. Пробоподготовка при анализе твердых веществ состоит только в измельчении образца, капсулировании и взвешивании. Для проведения анализа необходимо 0.3-15 мг образца. Взвешивание образцов проводили с помощью микровесов модели «МХ5» фирмы «Мettleг Toledo» (Швейцария) с точностью 0.0005 мг. Анализируемое вещество помещали в оловянные капсулы. Эта операция является единственной стадией пробоподготовки. Время анализа, состоящее из времени взвешивания образца, его сожжения и получения конечных результатов, составляет около 7 минут.
В головной части партии анализируемых образцов находятся две-три капсулы с любым азотсодержащим веществом для стабилизации режима работы реактора. Далее помещают стандартные вещества с известным содержанием азота в молекуле для проведения градуировки прибора. При определении азота образец, помещенный в оловянную капсулу, из автосамплера поступает в кварцевый реактор на катализатор. Температура реактора поддерживают на уровне 940С. Через реактор проходит постоянный поток гелия со скоростью 200 мл/мин. В момент попадания капсулы с образцом в реактор одновременно происходит дозирование кислорода в объеме, необходимом для полного сгорания образца. Кислород дозируют путем изменения времени его подачи в реактор, при этом скорость потока кислорода варьируют в зависимости от природы вещества. Сгорание самой оловянной капсулы приводит к значительному увеличению температуры. Для дожигания вещества в нижней части реактора помещают слой катализатора — смесь С03О4 и Ад.
Окисление происходит в динамическом режиме, и из реактора смесь продуктов сгорания в потоке гелия поступает в реактор восстановления, заполненный восстановленной медью. Этот реактор выполнен из кварца и нагрет до температуры 650С. В нем происходит удаление избыточного количества кислорода и восстановление оксидов азота до азота. На выходе восстановительный реактор соединен с двумя адсорбционными фильтрами, через которые проходит смесь газообразных продуктов. Первый фильтр, заполненный натронной известью, улавливает диоксиды углерода и серы, второй с молекулярными ситами и безводным перхлоратом магния — воду.
Таким образом, из реакторной системы в потоке гелия выходит единственный конечный продукт конверсии — молекулярный азот, который поступает в детектор по теплопроводности — катарометр. Полученные хроматограммы обрабатывают с помощью программного обеспечения, и на основе их рассчитывают процентное содержание азота в образце. Обычно при формировании партии образцов для анализа в нее включают пустые капсулы для оценки возможного содержания азота в них или в системе автосамплера (холостой опыт). Усредненную площадь пиков азота для холостого опыта вычитают из площади азота при анализе образца.
Элементный анализатор не дает абсолютные значения содержания азота по измеренному отклику детектора, содержание азота может быть рассчитано из градуировочной зависимости. Ежедневно перед началом анализа исследуемых веществ необходимо проводить сжигание навесок стандартного вещества для построения градуировочной зависимости. Градуировочная зависимость — зависимость площади регистрируемого пика азота от массы азота в навеске стандартного образца.
Использование этой линейной зависимости, которая проходит через начало координат, возможно только в случае полного перевода азота анализируемого соединения в молекулярную форму (N2) без каких-либо потерь и учета холостого опыта. Этого можно достичь только при условии полного сжигания вещества и конверсии оксидов азота до молекулярного азота.
Нами была изучена зависимость коэффициента чувствительности (К) от соотношения масс азота, зарегистрированного после сожжения навесок чистого органического вещества и вещества-стандарта, общепринятого в органическом элементном анализе (цистин). В качестве аналита был использован фталофос (С11Н1204NS2Р) (%М = 4.42%). Было показано, что величина К не остается постоянной при изменении соотношения соответствующих масс азота в широком диапазоне. Контролем правильности анализа являлась точность определения содержания азота в молекуле аналита (при сопоставлении с теоретическим значением).
Как видно из рис. 5, коэффициент чувствительности в узком диапазоне величин количеств азота, полученных при конверсии соответствующих навесок вещества-стандарта (ацетанилид), остается постоянным.
Нами изучен вопрос изменения коэффициента чувствительности для азота во времени (при анализе большого числа проб). В качестве анализируемого образца взят стандартный образец фталофос (Ci1Н1204NS2PI %(/V) = 4.42%). Целью этого исследования являлась минимизация частоты проведения градуировки и увеличения за счет этого производительности анализов чистых органических веществ. Проведенный эксперимент показал, что в течение дня наблюдали небольшое различие в величине коэффициента чувствительности, отнесенного примерно к одному и тому же количеству азота. Это различие может быть скомпенсировано при определении азота сжиганием примерно одной и той же пробы стандарта в начале и в конце рабочего дня.
Кроме того, изучена стабильность данных определения азота в стандартном образце, используемого в элементном анализе (ацетанилид, C8H9NO, %(/V) = 10.36%). Для построения градуировочной кривой использовали другой стандартный образец (цистин, CeH- NzCUSz, %(/V) = 11.66%). Для изучения стабильности данных после построения градуировочной кривой проводили сжигание большого числа проб этого вещества (35 проб). Время одного определения составляло 7 минут. Относительное стандартное отклонение полученных результатов не превышало 1.0%.
Таким образом, в течение одного рабочего дня можно провести градуировку прибора и определение азота в 35 пробах анализируемого вещества. При анализе стандартных образцов для элементного анализа точность метода соответствует сертифицированной (1%).
Данные, полученные на одном и том же приборе разными операторами, практически не различались между собой. Это свидетельствует о правильности определения азота и целесообразности применения элементного анализатора для высокопроизводительного контроля качества анализируемых веществ.
Определение содержания активного вещества в твердых фармацевтических препаратах с использованием предложенного способа
В отличие от твердых фармсубстанций, содержащих в молекуле азот, твердые фармацевтические препараты (таблетки) содержат в качестве наполнителя инертные вещества такие, как тальк, метилцеллюлоза, стеараты металлов и др., которые не содержат в молекуле азот. Соотношение активное вещество : наполнитель составляет от 1 : 1 до 1 : 100.
С целью разработки способа определения содержания активного вещества в фармпрепаратах предложенным способом определения степени чистоты органических веществ и выявления зависимости погрешности определения содержания активного вещества в таблетке от соотношения масс активное вещество : наполнитель был проведен анализ таблеток ряда фармпрепаратов, в которых соотношение содержаний активное вещество : наполнитель составляло от 1 : 1 до 1 : 50. Перед определением проводили измельчение таблеток, их растирание, взятие навески в оловянной капсуле и ее капсулирование, и затем - элементный анализ на азот. Навеску фармпрепарата и вещества-стандарта для элементного анализа выбирали таким образом, чтобы количества полученного в результате конверсии каждого из них азота были близки между собой. Расчет содержания активного вещества в таблетке проводили по формуле азота в молекуле активного вещества; ттабл — средняя масса таблетки; т„ — масса навески.
Затем проводили сравнение величин экспериментально полученной массы активного вещества в таблетке и массы, указанной на упаковке фармпрепарата.
Подавляющее большинство веществ, используемых в качестве наполнителей таблеток, не содержат азот. Исключение составляют такие вещества, как повидон и его производные, которые в некоторых случаях входят в состав наполнителя. Их присутствие однозначно регистрировали при проведении элементного анализа таблеток, так как полученное содержание активного вещества в таблетке намного превышает специфицированное. Необходимо отметить, что повидон и его производные обладают рядом побочных эффектов, и их применение в фармпрепаратах, выпускаемых в России, запрещено.
Кроме того, используемые в фармацевтической промышленности красители являются в основном производными различных азотсодержащих органических веществ (азосоединений). Их присутствие в фармацевтическом препарате влияет на общее содержание азота. Элементный анализа для определения азота не пригоден для фармацевтических препаратов, содержащих краситель. В основном красители добавляют не в сырьевую смесь, из которой затем формируют таблетки, а в оболочку таблетки, поэтому наличие красителя можно определить визуально.
Было проведено исследование возможности определения содержания активного вещества в твердых фармпрепаратах (таблетках), наполнитель которых не содержал азота, и которые не были окрашены, при использовании предложенного нами способа. В табл. 8 приведены результаты определения активного вещества в ряде фармацевтических препаратов.
Погрешность анализа таблетированных форм фармацевтических препаратов несколько превышает погрешность анализа соответствующих субстанций (табл. 2). По-видимому, это связано с неравномерностью распределения активного вещества в таблетке и с недостаточно полной гомогенизацией пробы при растирании. В то же время не наблюдается значимого различия между заявленным и экспериментально полученным содержанием активного вещества в изученных фармпрепаратах в пределах допустимого технологического интервала (согласно Фармакопее [67]). Согласно Фармакопее отклонения в содержании активного вещества должны составлять при заявленных его количествах в таблетке до 1 мг ± 15%, от 1 до 10 мг± 10%, от 10 до 100 мг± 7.5% и от 100 мг и более ± 5%. При этом погрешность определения содержания активного вещества в фармпрепарате при использовании предложенного метода должна быть ниже, чем при использовании стандартных методов, так как стандартные методы анализа предполагают проведение предварительной экстракции (степень которой точно неизвестна, но принимается равной 100%) и использование стандартных образцов активного вещества (степень чистоты которых также принимается равной 100%). Элементный анализ для определения активного вещества в таблетках, напротив, не требует проведения предварительных стадий пробоподготовки и наличия стандартных образцов фармсубстанций.
В табл. 8 приведены результаты определения активного вещества в ряде таблетированных фармпрепаратов с помощью ВЭЖХ с использованием соответствующего стандарта, представленные фирмами-производителями (данные предоставлены нам FDA) и с использованием предложенного нами способа. Сопоставление этих данных показывает, что значимого различия между ними нет.
Следующим этапом нашего исследования являлось определение активного вещества в фармацевтических препаратах с различным соотношением активное вещество : наполнитель. Градуировку по азоту проводили в максимально узком диапазоне навесок стандартного образца. Это позволило снизить общую погрешность определения азота в навеске фармпрепарата. По уравнению (3) рассчитаны величины навесок, выбранных для анализа фармпрепаратов, с учетом диапазона масс стандартного вещества, используемого для градуировки. При этом величины площадей пиков азота для каждого препарата укладывались в интервал величин площадей пиков азота полученных для стандартного вещества при построении градуировки.
С соблюдением указанных выше условий проведены серии анализов по оценке содержания активного вещества в некоторых фармацевтических препаратах. В табл. 9 представлены специфицируемые и экспериментальные данные содержания активного вещества в таблетках исследованных фармпрепаратов.
Согласно Фармакопее отклонения в содержании активного вещества должны составлять при заявленных его количествах в таблетке до 1 мг ± 15%, от 1 до 10 мг ± 10%, от 10 до 100 мг ± 7.5% и от 100 мг и более ± 5%. Из табл. 9 видно что при различных соотношениях активное вещество . наполнитель не наблюдается значимого отличия экспериментально полученного содержания активного вещества от заявленного в пределах технологического интервала. Во всех случаях кроме кавинтона согласно Фармакопее расхождение не превышало допустимое. Результаты анализа кавинтона могут свидетельствовать либо о большем содержании активного вещества в таблетке либо о наличии в составе наполнителя других азотсодержащих веществ. Из табл. 9 видно что значения SR в случае фармпрепаратов выше чем в случае анализа соответствующих фармсубстанций. Это, по-видимому связано с неравномерностью распределения активного вещества в таблетке и недостаточно полной гомогенизацией пробы при растирании. Таким образом, нами показана возможность определения содержания активного вещества в твердых фармпрепаратах с использованием предложенного способа, основанного на элементном анализе, и осуществления благодаря этому быстрого и высокопроизводительного контроля качества фармпрепаратов, что открывает новые возможности в производственном контроле, внеочередном контроле качества фармпродукции и контроле фальсифицированных фармпрепаратов.
Следующим этапом нашего исследования было изучение числа и точности определений активного вещества, которое может быть проведено в течение дня при осуществлении только одной градуировки по азоту в начале дня. Исследование было проведено для четырех фармпрепаратов: норсульфазол, сульфадиметоксин, анальгин и кларитин. В табл. 10-13 приведены данные по определению активного вещества в течение одного дня для каждого из рассмотренных препаратов, полученные при использовании элементного анализатора.
Как видно из представленных таблиц, число анализов проб фармпрепаратов (по 3 параллельных определения каждого) составляло не менее 12, при этом обеспечивалась высокая воспроизводимость (sR 1.8%). Для всех фармпрепаратов, кроме анальгина, заявленное и экспериментально полученные содержания активного вещества совпадали (в пределах технологического интервала). В случае анальгина расхождение было значимым и объяснялось недостатком активного вещества в таблетке (технологический брак).
Следующим этапом нашего исследования было определение активного вещества в фармпрепаратах различных производителей. Для этого исследования мы использовали фармпрепараты рифампицин и анальгин, выпущенные различными производителями (табл. 14).
Изучение высокотемпературной окислительной конверсии галоген,, серо- и фосфорорганических веществ до соответствующих анионов
Оптимизация условий ИХ определения анионов в растворе элюента, выбранном нами в качестве абсорбата, на низком уровне позволила перейти к следующему этапу исследований, а именно, к изучению высокотемпературной конверсии различных органических веществ, содержащих такие элементы, до соответствующих анионов. Окисление изучаемого образца, помещаемого в кварцевую лодочку, проводили в потоке кислорода в кварцевом реакторе, помещенном в трубчатую электропечь сопротивления, нагретую до 950С. Скорость потока кислорода составляла 80 мл/мин.
Кроме того, задачей данного этапа являлся выбор условий сожжения больших навесок (миллиграммовых) твердых чистых органических веществ. Для проведения сжигания в потоке кислорода твердых веществ в миллиграммовых количествах нами был изготовлен реактор большего внутреннего объема, схема которого приведена на рис. 12. Реактор выполнен с возможностью ввода пробы в лодочке. Такой способ обеспечивает возможность ввода в реактор, как навесок твердых веществ, так и растворов таких веществ после удаления растворителя за счет его испарения из лодочки.
Необходимую длину выходного капилляра реактора определяли экспериментально по границе образования в нем водного конденсата при вводе в реактор 10 мкл воды. Образование в капилляре реактора водяной пробки, не подаваемой в абсорбер потоком газа, могло приводить к адсорбции продуктов конверсии в пробке конденсата. Конденсат водяного пара на холодной поверхности капилляра возникал на расстоянии 7 см от реактора. При уменьшении длины капилляра до 6 см продукты конверсии поступали с потоком кислорода непосредственно в абсорбер, заполненный элюентом. В качестве абсорбера использовали одноразовые пластиковые медицинские шприцы Injekt (ВВraип, Германия) объемом 5 мл. Время разложения пробы и сбора в абсорбер полученных продуктов конверсии составляло 5 мин, при этом объем абсорбата составил 4 мл.
Размеры реактора (внутренний диаметр и длина) были увеличены с целью обеспечения возможности ввода в реактор большой навески чистого органического вещества и ее сожжения в лодочке. Такой ввод пробы позволил минимизировать погрешность анализа, связанную с вводом пробы (по сравнению с вводом пробы растворов шприцем). Кроме того, способ ввода пробы с лодочкой позволял вводить в реактор большую навеску вещества по сравнению с вводом пробы растворов шприцем, что позволяло снизить предел обнаружения примесей. Пределы обнаружения, рассчитанные, как тройной уровень флуктуации фона холостого опыта, составили от 3 X 10" V г (для брома и фосфора) до (3- -6) х 10 г для фтора, хлора и серы, соответственно.
В качестве абсорбера, как мы отмечали, использовались одноразовые пластиковые шприцы. Исследования показали, что от партии к парии и даже в пределах одной партии шприцев наблюдались флуктуации фонового сигнала холостого опыта по F", СГ и S042" в пределах до двух порядков. В связи с этим из большого числа экспериментов были получены средние значения фоновых сигналов по этим элементам (остальные анионы не регистрировались), и за предел обнаружения по фтору, хлору и сере мы принимали утроенную величину среднего значения флуктуации фона. Измерения проводились для элюента, помещенного в абсорбер, после барботажа кислорода в течение 5 минут. Пределы обнаружения составили для фтора, хлора, брома, фосфора и серы Зх 1(Г9, 6х 10 9, 3 X 10 11\ 3 х 10"11 и 5 X 10 Г, соответственно. На разделительную колонку поступала 1/20 часть объема абсорбата, то есть во всем объеме абсорбата (в 4 мл) эти количества должны быть равны, соответственно, около 6 х 10 8, 1.2 х Ю-7, 6хЮ"1, 7х00-1 и 1x10 г. Минимально определяемые концентрации этих элементов в навеске вещества 1 мг, не содержащего определяемых элементов, составляют 6 х 1СГ3, 1.2 х 10 2, 6 х 1СГ6, 7 х 10" и 1 X1СГ2%.
Проводили оптимизацию условий сожжения в зависимости от размеров навески и способа подачи пробы в реактор. Были выбраны условия, исключавшие образование сажи в реакторе и выброс элюента из абсорбера. В условиях, оптимизированных для сожжения больших навесок (1-2 мг) чистых органических веществ, была изучена полнота конверсии до соответствующих анионов ряда веществ, содержащих в молекуле определяемые элементы. Для этого в кварцевую лодочку шприцем вводили определенный объем раствора аналита, содержавшего определенное его количество (концентрация вещества в растворе составляла около 10 г/мкл; объем пробы раствора, введенного в лодочку — 10 мкл), растворители упаривали и лодочку с аналитом вводили в реактор. Масса определяемого элемента в навеске аналита составляла 10 —10 г. Полученные данные приведены в табл. 21.
Как видно из приведенных в табл. 21 данных степень конверсии ряда изученных соединений до определяемых элементов была количественной.
Следует отметить, что на хроматограммах абсорбатов, полученных при конверсии сероорганических соединений, были зарегистрированы анионы сульфита и сульфата. Для правильного определения серы в анализируемом образце необходимо учитывать образование диоксида серы наряду с триоксидом. Так как раствор сульфита неустойчив во времени вследствие окисления кислородом воздуха до сульфата, то построение отдельной градуировочной зависимости для сульфита было невозможным. В связи с этим нами проведено сопоставление чувствительности пика сульфита с другими пиками на хроматограмме.
На хроматограмме стандартного свежеприготовленного раствора сульфита натрия в элюенте помимо пика сульфита зарегистрирован незначительный пик сульфата, величиной которого можно пренебречь. Сравнение хроматограмм сульфита и сульфата при анализе растворов анионов одинаковой концентрации показало, что чувствительности сульфата и сульфита сопоставимы. Поэтому содержание серы в исследуемом образце можно рассчитывать, исходя из суммы пиков этих анионов. Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан способ определения суммарного содержания Р-, CI-, Вг-, Р- и 8-содержащих органических примесей, который мог быть использован для определения таких примесей в чистых органических веществах, не содержащих такие элементы.
