Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анализ роли некачественных, фальсифицированных и суррогатных алкогольных напитков в формировании феномена высокой алкогольной смертности в Российской Федерации 13
1.1. Предмет рассмотрения, понятия и термины 14
1.2. История вопроса и гипотеза 18
1.3. Диагностика смертельных отравлений алкоголем и его суррогатами 23
1.4. Диагностика несмертельных отравлений алкоголем и его суррогатами 26
Глава 2. Хроматографический и хромато-масс-спектрометрический анализ спиртов и спиртных напитков 34
2.1.Обоснование выбора условий ГХ-МС и ГХ-ДИП анализа 34
2.1.1. Аппаратура и методы для ГХ-МС определения летучих компонентов спиртов, коньяков, коньячных спиртов 35
2.1.2. Условия хроматографического анализа коньяков и коньячных спиртов с пламенно-ионизационным детектированием (ГХ-ДИП) 35
2.1.3. Методы ГХ-МС и ГХ-ДИП парофазного анализа без термостатирования для исследования состава летучих компонентов вин и виноматериалов 36
2.1.4. Методы определения состава компонентов древесины дуба в коньяках и коньячных спиртах методом спектрометрии в ультрафиолетовой и видимой области (УФ-ВИД) и хромато-масс-спектрометрии 36
2.2. Критерии выбора внутреннего стандарта и состава калибровочной смеси летучих веществ 38
2.3. Формирование артефактов и исследование изменения состава градуировочных смесей летучих веществ при хранении 38
2.4. Выявление и устранение хроматограф ических наложений при определении летучих веществ 42
2.5. Идентификация синтетического спирта и спиртов биохимического происхождения методом ГХ-МС анализа 43
2.5.1. Формирование примесного состава синтетического спирта 44
2.5.2. Критерии выбора и условия детектирования веществ-маркеров синтетического спирта-ректификата и оценка результатов идентификации 46
2.5.3. Результаты изучения факторов, влияющих на правильность идентификации синтетического спирта 50
2.5.4. Вещества, мешающие идентификации природы спирта по бутанолу 50
2.6. Роль ацетона в идентификации природы спирта. Образование и накопление ацетона в водке из пищевого спирта при ее длительном хранении 51
2.7.Идентификация подлинности вин, коньяков и других дистиллированных спиртных напитков 53
2.7.1. Вина 53
2.7.2. Коньяки, коньячные спирты, бренди 57
2.7.3. Выбор летучих компонентов для оценки качества коньяков и коньячных спиртов 61
2.8. Типичные случаи фальсификации (выявление по составу летучих компонентов) 69
2.8.1. Выявление компонентов не характерных для коньяка 69
2.5.1. Выявление ароматизаторов (1,2-Пропиленгликолъ) 69
2.8.1. Выявление денатурирующих агентов (Диэтилфталат) 69
2.8.2. Фальсификация разбавлением 70
2.9. Исследование соства компонентов древесины дуба, экстрагируемых в коньячный спирт 79
2.9.1.Виды дубовой древесины, используемой в виноделии и производстве коньяка 79
2.9.2. Метод УФ-ВИД спектрометрии. Типичные случаи фальсификации, выявляемые методом УФ-ВИД спектрометрии 80
2.10. Исследовавание состава компонентов древесины дуба, переходящих в коньячный спирт, методом ГХ-МС на неподвижных фазах средней и малой полярности 83
2.10.1. Полифенольные, фурановые компоненты 83
2.10.2. Результаты сравнительного определения компонентов дубовой древесины в отечественных и зарубежных коньяках и коньячных спиртах 85
2.10.3. Типичные случаи фальсификации, выявляемые методом ГХ-МС по состапву компонентов дубовой древесины 87
2.11. Исследование факторов, влияющих на правильность определения денатурирующей добавки - диэтилфталата в коньяках и коньячных спиртах 101
Глава 3. Совместное применение методов хроматографии и биологических тестов в оценке токсических свойств суррогатов алкоголя 126
3.1. Исследование компонентного состава и потенциальной токсичности образцов легальной и нелегальной алкогольной продукции методами хроматографии и хромато-масс-спектрометрии 116
3.1.1.Сравнительное хроматографичское исследование состава технических и пищевых неректификованных этиловых спиртов (сырцов) 117
3.1.2. Потенциальная токсичность синтетического спирта, не очищенного ректификацией 118
3.1.3. Спирты, полученные ферментативным брожением без ректификации 119
3.1.4. Напитки домашней выгонки(самогон, чача) 120
3.1.5. Сравнительное хроматографическое исследование состава технических и пищевых ректификованных этиловых спиртов 127
3.1.6. Исследование состава фальсифицированных водок из нелегального оборота 131
3.2. Проблема выбора денатурирующих добавок и оценка их потенциальной токсичности в спиртах непищевого назначения 136
3.3.Исследование токсических свойств самогонов на лабораторных животных и методами биологического тестирования 139
3.4. Сравнительное хроматографическое и биологическое (экспресс-тест) исследование токсичности крепких алкогольных напитков домашнего изготовления (самогонов) из разных регионов России 139
3.5. Исследование токсических свойств самогона на лабораторных животных, связь токсических свойств и химического состава 148
3.6. Определение летучих токсичных веществ в биологических объектах, воде, напитках методом парофазного анализа без термостатирования 160
3.6.1. Консервация проб и условия хранения 160
3 6 2 Методика ГХ-МС определения летучих веществ методом Парофазного Анализа без Термостатирования 160
3 6 3 Экспрессное газохроматографическое определение этанола 161
3 6 4 Аппаратура и условия хроматографического анализа Условия хроматографического анализа, колонка НР-В ALC 161
3 6 5 Метрологические характеристики метода Парофазного Анализа без Термостатирования 162
3 6 6 Исследование влияния температуры окружающей среды на правильность определения 162
3 6 7 Определение летучих компонентов пива и сусла, оценка чувствительности метода 163
3.6 8 Применение метода парофазного анализа без термостатирования для определение дихлорэтана в различных объектах 164
3.7. Определение этиленгликоля в биологических объектах методами ГХ-ДИП и ГХ- МС 167
Глава 4. Хроматографическое определение обезболивающих наркотических средств 168
4.1 Фентанил 169
4.2 Дроперидол 175
4 3 Кетамин. 176
4 4 Тиопентал 182
4 5 Пропофол 203
4 6 Клофелин 211
4 7 Фенциклидин 215
4 8 Трамадол 228
Глава 5. Разработка метода безэталонной трансляции - автоматической идентификации для ГХ-МС определения наркотических и сильнодействующих средств 261
5.1. Обоснование нового методического подхода к системному ГХ-МС определению наркотических и сильнодействующих средств 261
5.2. Ограничения и мешающие влияния при автоматической обработке по программе AMDIS 262
5.3. Обоснование выбора условий подготовки пробы 263
5.3.1. Условия подготовки пробы для веществ основного и нейтрального характера 264
5.3.2. Условия подготовки пробы для веществ кислого характера (бензоилэкгонина, 11-нор—дельта-9-карбокси-тетрагидроканнабинола в моче) 264
5.4. Обоснование выбора хроматографического метода 265
5.4.1. Выбор внутреннего стандарта 265
5.4.2. Обоснование выбора хроматографических условий анализа 265
5.4.3. Обоснование выбора масс-спектрометрического детектора 266
5.5. Выявление факторов, влияющих на правильность идентификации контролируемых веществ 267
5.5.1. Межлабораторная воспроизводимость времен удерживания 267
5.5.2. Воспроизводитость времен удерживания при длительной работе колонки 268
5.5.3. Влияние соэкстрактивных компонентов матрицы и концентрации целевых веществ на воспроизводимость времен удерживания 269
5.5.4. Артефакты при многокомпонентном ГХ-МС определении наркотических и сильнодействующих веществ в биожидкостях 271
5.5.5. Влияние кислотного гидролиза и щелочной экстракции на формирование артефактов 271
5.5.5.1. Трамадол и кетамин 271
5.5.5.2. Норпромедол II- МБХ 258
5.5.5.3. Промедол - норпомедол I - норкетамин 274
5.6. Методология выявления неизвестных веществ в сложных органических матрицах биологического происхождения (на примере идентификации нового метаболита кетамина) 280
5.7. Этапы идентификации неизвестного вещества 280
5.8. Исследование II стадии метаболизма (коньюгации) новых метаболитов кетамина 288
5.9. Потенциальные фармакологические свойства новых метаболитов кетамина 289
5.10. Трамадол, связь между структурой метаболитов и примесных веществ 290
5.11. Сравнительное исследование метаболизма обезболивающих наркотических средств у наркологических больных, у хирургических больных при операционной травме, и у пострадавших при применении обезболивающих препаратов на фоне травматического шока 291
5.12. Влияние некоторых пищевых продуктов и лекарственных препаратов на правильность идентификации наркотических средств в биологических объектах 295
5.13. Определение силденафила (виагры) и его аналогов тадалафила и варденафила в биожидкостях и несертифицированных препаратах 298
Глава 6. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды 303
6.1 Методы, применяемые в массовом анализе 304
6.1.1 Применение ГХ и ГХ-МС для определения НП в объектах окружающей среды 307
6.1.2 Другие методы определения НП в окружающей среде 310
6.1.3. Извлечение НП из матрицы 311
6.1.4. Идентификация источников нефтяных загрязнений 313
6.1.5. Дистанционные методы обнаружения НП в окружающей среде 318
6.1.6. Анализ деградировавших НП 321
6.2. Применение капиллярной хроматографии с хемилюминесцентным детектированием для определения серосодержащих соединений в нефтяных загрязнениях морских вод 326
6.3.Изучение загрязненности нефтепродуктами некоторых акваторий Азовского моря
7. Выводы 347
Список литературы
- Диагностика несмертельных отравлений алкоголем и его суррогатами
- Формирование артефактов и исследование изменения состава градуировочных смесей летучих веществ при хранении
- Сравнительное хроматографическое исследование состава технических и пищевых ректификованных этиловых спиртов
- Сравнительное исследование метаболизма обезболивающих наркотических средств у наркологических больных, у хирургических больных при операционной травме, и у пострадавших при применении обезболивающих препаратов на фоне травматического шока
Диагностика несмертельных отравлений алкоголем и его суррогатами
Острые химические отравления, как это не прискорбно констатировать, являются одним из основных факторов заболеваемости населения Российской Федерацию. При сравнении с ведущими нозологическими группами, определяющими заболеваемость населения, острые химические отравления в настоящее время по распространенности находятся на четвертом месте. А по числу смертельных исходов - на первом месте, опережая показатель смертности для цереброваскулярных заболеваний на 13%, для новообразований в 2 раза и инфаркта миокарда - в 3 раза. За последние 5 лет причиной более половины летальных исходов послужили острые алкогольные отравления. Следует подчеркнуть, что по экспертной оценке в стационары поступает не более 40-60% от общего числа пострадавших. Следовательно, реальная заболеваемость этой этиологии в стране составляет, по крайней мере, 600-700 тыс. человек ежегодно [5].
Череда политических, экономических и социальных событий, произошедших сначала в СССР и затем в России на рубеже XX и XXI тысячелетий, глубоко затронула все без исключения сферы жизни общества.
Середина 1980-х годов была ознаменована проведением антиалкогольной кампании. В короткий период с 1985 по 1987 гг. производство и потребление легально произведенного алкоголя сократилось в 2,5 раза. Несмотря на значительный рост самогоноварения, размеры реального потребления алкоголя снизились в 1,3 раза и составили около 11 л абсолютного алкоголя на душу населения в год, против 14,5 л в 1984 году.
Вторым событием, резко изменившим ситуацию на алкогольном рынке России, стала либерализация торговли, ознаменованная отпуском цен на ликеро-водочные изделия. Если до этого основной частью нерегистрируемого алкоголя, потребляемого населением страны, был самогон, то, начиная с 1 января 1992 года, алкогольный рынок начал быстро наполняться разного рода фальсификатами, которые стали вытеснять легально произведенную алкогольную продукцию в силу своей более низкой цены. Главными поставщиками контрафактной продукции являлись многочисленные нелегальные производители и импортеры. Одновременно службами Госторгинспекции и Госсанэпиднадзора было зарегистрировано снижение качества производимой в стране алкогольной продукции. Алкогольные напитки, как легально, так и нелегально произведенные, стали доступнее и в силу относительного (по сравнению с другими продуктами питания и товарами народного потребления) падения цен на них. Это событие немедленно отразилось на размерах потребления алкоголя. Немцов А.В. отмечает, что резкий рост потребления алкоголя произошел уже в 1992 году, а в 1993 году достиг отметки 1984 г (14,5 л). При этом рост потребления происходил, не только за счет нерегистрируемого алкоголя, но за счет легально произведенных алкогольных напитков. По данным Госкомстата потребление легально произведенного алкоголя на душу населения увеличилось с 5,38 л в 1990 г. до 9,45 л в 1995 г. При этом реальное потребление алкоголя, согласно экспертной оценке, после 1994 года стало понижаться и в 1998 г. составило 13,5 л [6]. Постепенно, по мере осуществления рыночных реформ, выхода страны из экономического кризиса и поэтапного введения системы мер законодательного и административного характера, которые были направлены, главным образом, на пресечение незаконных производства, импорта и реализации алкогольной продукции, доля нерегистрируемого алкоголя стала постепенно сокращаться. При этом подушевое потребление легально произведенного алкоголя (включая пиво) по данным Государственной статистики начало увеличиваться и составило в 1998 г. - 7,60 л, в 1999 г. - 7,87 л, в 2000 г. - 8,07 лив 2001 г. -8,31 л. Согласно расчетным данным Немцова А.В. [6], начиная с 1998 года, происходит увеличение и реального потребления алкоголя. Так, в 1999 г. этот показатель вновь вернулся на отметку 14,5 л и обнаружил дальнейшую тенденцию к росту в 2000 г.
Изменения ситуации на алкогольном рынке страны в период с 1984 по 1999 гг. достаточно точно и на первый взгляд логично корреспондировались с изменением показателей смертности от отравлений алкоголем и его суррогатами (рисунок 1).
В период проведения антиалкогольной кампании и после ее завершения (вплоть до 1992 года) острая алкогольная смертность достигла небывало низкой отметки - около 10 случаев на 100 тыс. населения.
Начиная с 1992 года, отмечался лавинообразный рост числа смертельных отравлений алкоголем и его суррогатами, который достиг своего максимума в 1994 году (37,8 случаев на 100 тыс. населения). Столь высокого уровня показатель острой алкогольной летальности никогда не достигал, не только в СССР, но и в других странах мира.
В следующем, 1995 году было зарегистрировано столь же резкое снижение смертности, которое продолжалось еще на протяжении 4-х лет, и в 1998 году показатель смертности от отравлений алкоголем и его суррогатами достиг величины, типичной для 1970-х годов (16 случаев на 100 тыс. населения). Предполагалось, что на этой отметке он и зафиксируется. Однако, начиная с 1999 года, количество таких отравлений пошло вверх и в 2002 году вновь достигло чрезвычайно большого уровня (28,5 случаев на 100 тыс. населения). Анализ причин феномена сверхвысокой алкогольной смертности 1992-96 гг. позволил сформулировать представление о природе этого явления. В качестве главных его причин называются три [6,7]: рост потребления алкоголя за указанный период на 17% (с 12,5 до 14,6 л на человека в год), за счет снижения стоимости спиртных напитков относительно других продуктов питания и товаров; увеличение доли в населении «тяжелых» потребителей алкоголя за счет сохранивших жизнь во время антиалкогольной кампании («перенос» риска умереть на период рыночных реформ); возросшее количество и повышение токсичности фальсификатов алкогольной продукции (в 1994 году потребление регистрируемого алкоголя составляло 6,8 л, а оценка реального подушевого потребления -14,6 л). Расчеты, проведенные Немцовым А.В. [6,7], показывают, что при годовом потреблении 14,6 л алкоголя на душу населения смертность при отравлении алкоголем соответствует потреблению 18,5 л. А разница в 3,9 л является алкогольным эквивалентом повышения токсичности алкогольных напитков и увеличения количества пьющих людей и больных алкоголизмом в начале рыночных реформ. Представление о важной роли нелегально произведенной и фальсифицированной алкогольной продукции в феномене сверхвысокой алкогольной смертности было безоговорочно воспринято многими специалистами и обществом в целом, и прочно вошло в научный и паранаучный обиход.
Формирование артефактов и исследование изменения состава градуировочных смесей летучих веществ при хранении
Формирование артефактов и исследование изменения состава градуировочных смесей летучих веществ при хранении. При анализе спиртов и спиртных напитков (коньяков и водок) обнаруживали соединения и группы соединений, не характерные для исследуемых образцов. Часто эти соединения идентифицировали в напитках низкого качества, что могло быть поводом к их использованию в качестве маркеров непищевого или низкокачественного спирта. Для этого необходимо было выяснить: могли ли быть эти соединения артефактами продуктами распада лабильных компонентов пробы или могли образоваться при хранении образца. Для этого исследования использовали многокомпонентные смеси, состав которых приведен в подписи к рис.5, смеси летучих кислот, фурановых соединений. Эти образцы хранили при комнатной температуре, анализировали и в течение 8 лет фиксировали изменение их состава. Для исследования деградации Сахаров в инжекторе хроматографа анализировали 40%-ные водноспиртовые настои огурца, арбуза, смеси с лактозой, сахарозой и фруктозой, используемые как компоненты рецептур при производстве водок и коньяков. Результаты представлены в табл. 1. Изменение состава анализируемых смесей наблюдали в первые 2-3 месяца хранения. Отмечали накопление в спиртах и смесях ацеталей и производных фурфурола, которые обнаруживали и в образцах коньяков, хранившихся в тех же условиях. В водноспиртовых градуировочных смесях смесях при хранении обнаруживали соединения - продукты деградации, которые обнаруживали и в водках (см. раздел 2.6. Роль ацетона в идентификации природы спирта.). Летучие кислоты образовывали эфиры, этерифицировалось до 10% от исходного содержания кислот. Наиболее неустойчивым соединением был кротоновый альдегид, который трансформировался в диэтилкротональ, что наблюдали и при хранении реальных синтетических спиртов. Исслеование водноспировых проб с добавленными сахарсодержащими ингредиентами показало, что при анализе сахара способны распадаться в инжекторе хрломатографа с образованием воспроизводимого профиля фурановых соединений, муравьиной кислоты и других веществ (см. табл.1), такой же набор артефактных соединений обнаруживался во многих образцах коньяков и водок. Артефактый пик с невоспроизводимым временем удерживания и масс-спектром 5-гидроксиметилфурфурола появлялся на хроматограммах при работе с загрязненным инжектором. По результатам этой работы были сделаны следующие выводы. Приведенные на рис.5 смеси летучих веществ могут быть использованы в течение длительного времени для качественного анализа (получения времен удерживания определяемых соединений и не могут быть использованы для калибровки прибора из-за взаимодействия компонентов. Для калибровки прибора разработали смеси: 02-4, 02-2-25, FFPSTD 190106 (содержат летучие компоненты, характерные для подлинных и фальсифицированных коньяков), смесь летучих кислот, растворы (смеси) в этаноле индивидуальных компонентов - фурфурола и гидроксиметилфурфурола. Срок хранения калибровочных смесей не более 4-х месяцев.
Газохроматографический метод определения подлинности [29] возникли значительные трудности с достоверной трактовкой получаемых результатов по выявлению спиртов непищевого назначения. Так, согласно этому ГОСТу спирт этиловый признается непригодным для пищевых целей, если в нем присутствует хотя бы одно из 25 контролируемых веществ. Анализ проводят методом газовой хроматографии с неселективным пламенно-ионизационным детектированием. Диапазон концентраций, характерных для спиртов этиловых различного типа (пищевых и непищевых), не приведен, т.е. при определении веществ (даже на уровне фона) спирт бракуется по формальному совпадению времени удерживания исследуемого и стандартного вещества без учета возможных хроматографических наложений.. Подтверждающий метод, например хромато-масс-спектрометрический, где кроме времени удерживания есть второй аналитический параметр масс-спектр, в этом ГОСТе не предусмотрен. Использование этого ГОСТа в арбитражных лабораториях привело к массовому получению неверных результатов идентификации природы спирта, когда заведомо пищевой спирт признавался негодным для пищевых целей. Наиболее часто спирт и произведенную из него водку браковали по наличию в ней ацетона, поэтому основное внимание в будет отдано рассмотрению того, в каких содержаниях ацетон может находиться в различных этиловых спиртах и насколько правомерно использовать его в качестве маркера природы спирта в том варианте, как это сделано в ГОСТ [29]. Также необходимо рассмотреть какие примеси этиловых спиртов могут выступать в качестве маркеров происхождения и как должен строиться алгоритм распознавания (идентификации) и какие существуют ограничения в использовании методов хроматографии для установления происхождения этилового спирта.
Синтетический этиловый спирт, не разрешен (с 1 июня 1998г.) к применению в пищевых и медицинских целях и внесен в Списки сильнодействующих и ядовитых веществ Постоянного комитета по контролю наркотиков [30,31,32].
Технический этиловый спирт [33,34], получаемый из древесного сырья, и денатурированные спиртосодержащие фракции также не разрешены к применению для производства пищевых продуктов. Таким образом, проблема идентификации спиртов, производимых из пищевого сырья, и спиртов, полученных синтетическим методом, в настоящее время является очень важной, чтобы не допустить последние для производства алкогольной продукции [35].
Этилен в свою очередь получают пиролизом попутных нефтяных газов и газов нефтепереработки, а также бензиновых и газойлевых фракций нефти, типичная хроматограмма представлена на рис.6. При пиролизе основными примесными компонентами, сопутствующими этилену являются пропилен и бутены, в часности бутилен, которые при гидратации образуют примесные компоненты синтетического спирта: изопропиловый спирт и втор-бутанол [27, 38-43]. Можно предположить, что ацетон, присутствующий в синтетических спиртах, образуется из изопропилового спирта при его окислении [38,39]. В большинстве исследованных нами синтетических спиртов содержание изопропанола на порядок величины выше, чем в ферментных спиртах, что дает основания считать изопропанол прекурсором ацетона. Однако, встречаются синтетические спирты в которых изопропанол отсутствует вообще. В табл.3 приведены примесные вещества синтетического спирта-сырца, совокупность которых является признаком происхождения этого спирта.
Сравнивая набор примесных компонентов синтетического спирта и спиртов, полученных с применением технологии ферментативного брожения (см. табл.1), можно видеть существенную разницу в компонентном составе этих объектов, что и явилось основой методики. Следует отметить, что предложенная методика не позволяет различить пищевой и гидролизный спирт, поскольку примесные соединения в этих спиртах идентичны и формируются в процессе ферментативного брожения. В то же время, нами показана возможность успешной дифференциации синтетических и коньячных спиртов, несмотря на совпадение некоторых характерных веществ, а также возможность различать эти объекты в смеси. При различении синтетического и коньячного спирта основную роль играет абсолютно разное «окружение» веществ маркеров, т.е. разные сопутствующие маркерам компоненты, представляющие собой системы идентификационных признаков. Наиболее сложной задачей является выявление синтетического спирта-ректификата, который содержит ограниченный набор примесных соединений в следовых концентрациях [27, 38,39].
Сравнительное хроматографическое исследование состава технических и пищевых ректификованных этиловых спиртов
Дроперидол, 1-[3-(парафторбензоил)-пропил]-4-(2-оксо-1-бензимидазолинил)-1,2,5,6-тетрагидропиридин, представляет собой нейролептическое средство группы бутирофенона. В психиатрической практике дроперидол применяют при психомоторном возбуждении, галлюцинациях. Основное применение препарат имеет в анестезиологической практике. В сочетании с фентанилом дроперидол применяют для внутривенного наркоза (нейролептоанальгезии) [153,154]. По анальгетической активности комбинация фентанила и дроперидола в соотношении 1:50 в 3,2 раза превосходит фентанил [154]. При этом общая доза фентанила варьирует в пределах 10-20мг. Метод ВЭЖХ ниболее часто применяют для определения дроперидола и других препаратов бутирофеноновой группы (галоперидола, трифлуперидола) [21-23]. Авторы работы [169] определяли содержание дроперидола в цельной крови больного шизофренией, умершего после введения терапевтической дозы препарата (5 мг) внутримышечно. В трех исследованных пробах обнаружены различные содержания дроперидола (И; 40 и 46 нг/мл), соответствующие терапевтическим дозам. Различие результатов авторы объясняли возможным перераспределением препарата уже после смерти больного. При ГЖХ определении лекарственных веществ группы бутирофенонов возникают проблемы, связанные с термической деструкцией молекул определяемого вещества в узле ввода или колонке газоваго хроматографа. Авторам работы [172] удалось устранить этот эффект предварительной обработкой хроматографической системы силанизирующим агентом.
Кетамин (Калипсол, Кеталар), гидрохлорид (11,8)2-метиламино-2-(2 -хлорфенил)-циклогексанона , применяется в виде водных растворов (50мг/мл) для целей основного и вводного наркоза [153]. При однократном введении в вену в дозе 2мг/кг хирургическая стадия наркоза наступает через 1-2 мин и длится 10-15 мин с сохранением спонтанного дыхания, что обусловило его широкое применение при болезненных инструментальных и диагностических манипуляциях, при транспортировке больных и срочных операциях в условиях острой кровопотери и травматического шока [153,174]. Кетамин также широко используют в ветеринарной практике. Для снятия побочных явлений и усиления эффекта действия его часто применяют в сочетании с нейролептиками (дроперидол), транквилизаторами (диазепам, мидазолам) и анальгетиками (фентанил, промедол и др.) [153,154]. Методика ВЭЖХ определения кетамина и мидазолама в плазме крови описана в работе [196].
Побочное действие препарата характеризуется тем, что кетамин является галюциногеном, вызывает реакции в виде ярких образных сновидений(часто негативного характера), бреда, непроизвольных движений. Относительно малая токсичность препарата, сильные галюциногенные свойства в сочетании с отсутствием значимо выраженной физической зависимости при частом применении, привели к распространению кетамина в качестве наркотического вещества [189]. Кроме случаев злоупотреблений, отмечен также случай умышленного убийства путем введения большой дозы кетамина [173]. Широкое распространение кетамина в качестве средства для внутривенного наркоза послужило толчком для проведения углубленных исследований по фармакокинетике, фармакодинамике, метаболизму, а также по разработке новых вариантов наркоза с использованием кетамина. За два последних года опубликовано более 700 работ по проблемам, связанным с применением кетамина. Большое внимание уделяется авторами аналитической части работ. Для надежного определения кетамина и продуктов его трансформации применяют весь набор современных хроматографических методов, примеры применения которых будут даны ниже. ГЖХ является одним из наиболее широко употребительных методов определения кетамина. Широкое распространение получила методика, разработанная Чангом и Гласко [175]. Кетамин и два его метаболита определяли на наполненных колонках в виде производных гептафтормаслянго ангидрида. При использовании электронозахватного детектора (ЭЗД) это позволило обеспечить высокую чувствительность определения и исключить стадию концентрирования экстракта. Определение проводили в плазме крови хирургических пациентов: при введении 122 мг кетамина внутривенно максимальное содержание препарата в плазме наблюдали через 4 мин после инъекции. Оно составило 1,49 мкг/мл и снизилось до 0,44 мкг/мл через 35 мин. Идентификацию метаболитов: 2-амино-2-(о-хлорфенил)циклогексанона (норкетамин) и 2-амино-2-(о-хлорфенил)-3-циклогексен-1-она (3,4-дегидроноркетамин) проводили по временам удерживания специально синтезированных веществ сравнения. Максимальное содержание норкетамина в плазме составило 0,25мкг/мл через 15 мин после инъекции. В качестве внутреннего стандарта использовали бромированный аналог кетамина. Степень извлечения определяемых веществ из плазмы при экстракции бензолом составила 98, 97 и 90% для кетамина и его двух метаболитов, соответственно. Подобную методику хроматографического анализа использовали в работах [176-179] для изучения фармакокинетики кетамина. В работе [176] показано, что наименьшая доза кетамина, способная обеспечить фармакологический эффект(анальгезию) у человека, составляет 0,25мг/кг, при этом концентрация в крови составляет 100нг/мл в течение первых 5-10мин. Авторы работ [177-179] изучали различие скорости метаболизма кетамина у взрослых и детей. Показано, что при внутривенном введении кетамина в количестве 2 мг/кг коцентрация в плазме крови детей составла 70 нг/мл, у взрослых 159 нг/мл через 5 часов после инъекции. После внутримышечных инъекций различия в концентрации кетамина у взрослых и у детей нет, однако у детей кетамин быстрее всасывается и достигает максимальной концентрации в крови 2,52 мкг/мл через 17 мин, тогда как у взрослых ( 2,92мкг/мл) лишь через 22 мин. Кетамин хорошо проникает через плацентарный барьер и широко используется для обезболивания родов, так как, в отличие от фентанила и других морфиноподобных анальгетиков не угнетает дыхательный центр плода [180,181].
При изучении фармакокинетики кетамина(с использованием методики ГЖХ анализа аналогичной [175]) на различных видах лабораторных животных было установлено, что при внутривенном введении препарат быстро всасывается и уже через 1-2мин обнаруживается в органах и тканях [182-184]. Так, при введении кетамина крысам в вену в дозе 30мг/кг препарат присутствует в мозге в концентрации на порядок большей чем, в плазме крови: 90мкг/мл и 10мкг/мл, соответственно. Через 10 минут после введения в плазме крови обнаруживаются содержания, составляющие менее 1% от первоначально введенной дозы. При этом 70% препарата локализовано в мускулатуре, коже, кишечнике и печени и длительность анестезии характеризуется скоростью перераспределения кетамина из мозга в ткани организма. Авторы работы [173] использовали методы ГЖХ и хромато-масс-спектрометрии при судебно-медицинском исследовании органов, тканей и биологических жидкостей человека умершего в результате введения большой дозы кетамина. Для выделения кетамина и его метаболитов из гомогенизатов тканей и биологических жидкостей использовали метод твердофазной экстракции на патронах Bond-Elute С is- Степень извлечения кетамина и норкетамина из трупного материала составила 75%. Определенные концентрации составили: в крови 27,4 мкг/мл, в моче 8,51 мкг/мл, в желчи 15,2 мкг/мл, в тканях мозга 3,24 мкг/мл, в печени 6,6 мкг/мл, в почках 3,38 мкг/мл.
Сравнительное исследование метаболизма обезболивающих наркотических средств у наркологических больных, у хирургических больных при операционной травме, и у пострадавших при применении обезболивающих препаратов на фоне травматического шока
В настоящее время качество капиллярных колонок таково, что позволяет воспроизвести на однотипных колонках при одинаковой температурной программе относительные времена удерживания большого количества соединений с точностью не хуже 1% (+/-0.05 мин) без анализа веществ сравнения. Регулируя давление в инжекторе (для получения заданного времени удерживания внутреннего стандарта) можно с той же точностью воспроизвести и абсолютные времена удерживания определяемых соединений. При этом удается достичь большей точности воспроизведения времен удерживания по сравнению с использованием табличных индексов удерживания, полученными на колонках, параметры которых могут отличаться от параметров колонки, используемой в работе.
Принцип второй. Предварительный анализ существующих систем автоматической обработки масс-спектрометрических данных показал, что методы базирующиеся на принципе деконволюции ГХ-МС данных наиболее эффективны и являются основной современной тенденцией автоматической идентификации. Под деконволюцией понимают интегрированный набор процедур получения чистых спектров индивидуальных соединений при обработке ГХ-МС данных. Опознавание («восприятие») вещества происходит по совпадению максимумов и характера кривизны пиков ионных хроматограмм, экстрагируемых из полного ионного тока. Одной из главных проблем при реализации этого алгоритма была корректная оценка уровня фонового сигнала и дрейфа базовой линии при выявлении минорных веществ в сложных матрицах. Эту проблему авторы программы решали, выражая интенсивности анализируемых пиков в единицах сигнал/шум. Подобный подход реализован в программе AMDIS и нашей задачей было -выработать методологический подход и разработать методическое обеспечение пригодное для работы с этой программой.
Для объединения двух принципов была создана масс-спектрометрическая библиотека, которая кроме масс-спектров наркотических, сильнодействующих соединений, метаболитов и сопутствующих веществ включала и их времена удерживания, т.е. впервые в автоматическую идентификацию проводили по двум аналитическим параметрам - времени удерживания и полному масс-спектру. Разработанная методика является первой опубликованной методикой такого типа. Соединение времен удерживания и масс-спектров в методике автоматической идентификации дало следующие преимущества. Наличие второго аналитического параметра - времени удерживания в библиотеке масс-спектров позволило повысить надежность определения минорных компонентов. Так, при совпадении библиотечного и исследуемого масс-спектров на 60% минорное вещество можно считать надежно идентифицированным только при совпадении времен удерживания, и это совпадение времен дает более значимый вклад в общий результат, чем масс-спектр. Таким образом идентифицирован героин в моче наркоманов (ранее считалось, что героин полностью метаболизирует).
Возможность получения одинаковых времен удерживания контролируемых соединений на разных приборах без веществ сравнения и автоматическая идентификация по двум аналитическим параметрам позволяет унифицировать ГХ-МС анализ по условиям и результатам, что в свою очередь дает следующие преимущества: Повышение экспрессности, надежности и правильности идентификации при использовании времени удерживания и полного масс-спектра при автоматической обработке ГХ-МС результатов Унификация и систематизация ГХ-МС анализа в лабораториях наркологической службы. Создание сети лабораторий с унифицированным по условиям анализа и принципам обработки данных методическим обеспечением, создание единой оперативно обновляемой базы ГХ-МС данных по наркотическим и сильнодействующим веществам Реализация нового подхода к обучению многокомпонентному ГХ-МС анализу биологических объектов. Сам анализ и обработка результатов сводятся к набору простых стандартных процедур, что дает возможность быстрого обучения персонала. Использование унифицированных методик позволяет более эффективно проводить контроль работы лабораторий Ограничения и мешающие влияния при автоматической обработке по программе AMDIS. Можно выделить два типа мешающих влияний при использовании программы автоматической обработки AMDIS. Первая проблема это получение чистых спектров минорных соединений в сложных органических матрицах с большим количеством соединений, образующих «сплошной» фон. В наибольшей степени это зависит от условий подготовки пробы, выбора дериватизующего агента и условий анализа. Второй тип проблемы получение чистых спектров веществ, элюирующихся одним пиком. Наиболее явно эта проблема проявляется в случаях, когда коэлюирующиеся вещества имеют близкий характер кривизны ионных хроматографических пиков, совпадающие максимумы этих пиков или в случаях, когда содержание одного из веществ значительно превышает содержание другого (или других) компонента (ов). контролируемых наркотических и сильнодействующих средств содержат аминогруппы и имеют основной характер. Кислый характер имеют бензоилэкгонин, 11 -нор-дельта-9 карбокси-тетрагидроканнабинол, барбитураты (которые частично извлекаются и с веществами основного характера) и некоторые метаболиты веществ анализируемой группы. Исходя из этого, бензоилэкгонин и 11-нор-дельта-9-карбокси тетрагидроканнабинол были вьщелены в отдельную процедуру пробоподготовки. Для дериватизации этих веществ использовали эффективный силилирующий агент MTBSTFA, обеспечивающий высокую чувствительность определения. С другой стороны, при использовании любых силилирующих агентов (особенно после гидролиза пробы) на хроматограмме резко возрастает количество фоновых соэкстрактивных соединений (органических многоосновных кислот, Сахаров, других эндогенных соединений, которые после силилирования приобретают летучесть, проходят через колонку газового хроматографа и формируют значительный фон. Это резко затрудняет обработку полученных данных в режиме автоматической идентификации. Поэтому, при определении этих веществ использовали традиционный метод ручной обработки масс-спектрометрических данных. С меньшей чувствительностью можно определять эти вещества при использовании более дешевого BSTFA или применять реакцию метилирования (с йодметаном и тетраметиламмонйхлоридом), что предпочтительно в случаях, когда в лаборатории используется один прибор для определения веществ кислого и основного характера. Также в отдельную процедуру с традиционной обработкой данных выведено определение следовых содержаний клофелина в моче (дериватизация с MTBSTFA) и фентанила и его аналогов.
