Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Применение хроматографических методов при анализе сложных смесей биологически активных органических веществ. Обзор литературы 18
1.1. Методы анализа многокомпонентных лекарственных препаратов 18
1.2. Особенности применения ВЭЖХ для анализа
готовых лекарственных средств 22
1.3. Состав подвижной фазы 28
1.4. Режим элюирования 35
1.5. Механизм удерживания 42
1.6. Особенности используемых сорбентов и исследование их свойств 46
1.7. Газожидкостнаяи тонкослойная хроматография и их использование в фарманализе 53
1.8. Проблемы пробоподготовки, взаимодействия между компонентами, определения примесей и продуктов разложения 56
1.9. Некоторые метрологические аспекты хроматографического анализа 69
1.10. Заключение 73,
Глава 2. Экспериментальная часть 75
2.1. Аппаратура и реактивы 75
2.2. Общие особенности приготовления растворов и расчетов 78
2.3 Подходы к оптимизации условий анализа 80
Глава 3. Исследование свойств сорбентов, подвижных фаз и лекарственных веществ для оптимизации хроматографическойселективности 83
3.1. Оригинальный метод оценки остаточной силанольной активности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов 83
3.2. Использование оптимизации ионной силы буферной составляющей подвижной фазы при количественном анализе таблеток «Пенталгин ICN» и «Пенталгин Н» методами градиентной и изократической ВЭЖХ 93
3.2.1. Анализ таблеток «Пенталгин ICN» 98
3.2.2. Анализ таблеток «Пенталгин Н» 103
3.3. Возможности градиентной ВЭЖХ при анализе многокомпонентных лекарственных форм 112
3.3.1. Применение изократической и градиентной ВЭЖХ при количественном анализе некоторых аэрозолей 112
3.3.2. Сравнение изократического и градиентного режимов при количественном анализе препарата «Теодибаверин» 121
3.3.3. Использование градиента рН подвижной фазы для оптимизации хроматографической селективности при анализе многокомпонентного лекарственного препарата 127
3.3.4. Одновременное количественное определение водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов в препарате сложного состава 132
3.4. Заключение 143
Глава 4. К обоснованию режимов элюирования и оптимальной нагрузки на колонку 144
4.1. Сравнение воспроизводимости площадей пиков при анализе некоторых многокомпонентных лекарственных препаратов методами изократической и градиентной ВЭЖХ 144
4.2. О воспроизводимости площадей пиков при количественном анализе методом ВЭЖХ 150
4.3. Влияние нагрузки на колонку на правильность результатов анализа таблеток «Пенталгин Н» методом градиентной ВЭЖХ 159
4.4 Заключение 165
Глава 5. О возможности оптимизации хроматографического разделения при использовании сорбентов разной полярности 166
5.1. Удерживание анальгина и анестезина на сорбентах t 1 разной полярности и анализ препарата «Беллалгин» методом ВЭЖХ 166
5.2. Хроматографические свойства парацетамола, кофеина и аспирина на сорбенте с привитыми нитрильными группами і и анализ препарата «Аскофен П» 172
5.3. Заключение 178
Глава 6. Некоторые особенности и примеры использования газовой и тонкослойной хроматографии при анализе многокомопонентных лекарственных препаратов 179
6.1. О выборе стандарта для анализа препарата «Валидол» методом ГЖХ.. 179
6.2. Количественное определение примесей
в препарате «Валидол» методом ГЖХ 187
1 6.3. Комплексный подход к подтверждению
подлинности многокомпонентных лекарственных
препаратов на примере анализа сиропа «Пассифит» 192
6.4. Заключение 205
Глава 7. Некоторые особенности пробоподготовки при анализе многокомпонентных лекарственных препаратов и определение продуктов разложения лекарственных веществ 206
7.1. Определение оптимального состава растворителя при анализе анальгинсодержащих лекарственных препаратов методом ВЭЖХ 206
7.2. Исследование стабильности аскорбиновой кислоты в водных и водно-органических растворах для количественного определения 214
7.3. О роли вспомогательных веществ при количественном анализе многокомпонентных лекарственных препаратов 222
7.4. Оригинальный кинетический способ определения продуктов разложения лекарственных веществ, нестабильных при уловиях анализа...228
7.5. Заключение 240
Заключение 241
Выводы 245
Литература
- Особенности используемых сорбентов и исследование их свойств
- Общие особенности приготовления растворов и расчетов
- Использование оптимизации ионной силы буферной составляющей подвижной фазы при количественном анализе таблеток «Пенталгин ICN» и «Пенталгин Н» методами градиентной и изократической ВЭЖХ
- Хроматографические свойства парацетамола, кофеина и аспирина на сорбенте с привитыми нитрильными группами і и анализ препарата «Аскофен П»
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из приоритетных областей аналитической химии является разработка и усовершенствование гибридных методов, которые применяются для качественного и количественного анализа многокомпонентных смесей природных соединений, биологически активных веществ, лекарственных средств и пр. В частности, в фармацевтической промышленности с целью обеспечения эффективности и безопасности продукции активно внедряются самые современные инструментальные методы анализа и, в первую очередь, гибридные хроматографические методы - ВЭЖХ, ГЖХ и ВЭТСХ. Актуальность разработки методик с применением этих методов обусловлена тем, что ассортимент лекарственных средств, форм и препаратов постоянно обновляется, а в преобладающем большинстве эта продукция многокомпонентна и полифункциональна, т.е. содержит гидрофильные или гидрофобные активные и вспомогательные вещества с существенно различающимися концентрациями, с разными функциональными группами, с кислотными или основными свойствами. Например, в состав поливитаминного препарата входит комплекс соединений с диаметрально отличающимися физико-химическими характеристиками: жиро- и водорастворимые витамины, стабилизаторы, консерванты.
В сложившейся практике в методиках анализа многокомпонентных смесей, как правило, в одну стадию контролируют содержание одного-двух компонентов с сопоставимыми количествами и хроматографическими свойствами. Вместе с тем, современный уровень хроматографической техники (насосов высокого давления с точным расходом подвижной фазы (ПФ), высокочувствительных детекторов, эффективных сорбентов новых типов) обеспечил возможность создания методик анализа многокомпонентных смесей, в которых сокращено число стадий и время анализа в первую очередь за счет применения градиентного режима и расширения перечня факторов оптимизации. В связи с этим актуальным является методическое и метрологическое обеспечение химического анализа на основе градиентного элюирования с применением сорбентов нового типа и ПФ с оптимизацией ионной силы буферной составляющей.
Хроматографическое поведение аналитов на сорбентах разной полярности при различных режимах элюирования изучено недостаточно, поэтому актуальной является разработка методического обеспечения химического анализа с их применением.
Дорогое и сложное хроматографическое оборудование предъявляет ряд жестких требований к пробоподготовке многокомпонентных аналитов для обеспечения оптимальной нагрузки на колонку, стабилизации лабильных веществ и устранения мешающего влияния взаимодействия между компонентами препаратов. Этот аспект хроматографического анализа также является важной проблемой, требующей поиска оптимальных решений.
Цель настоящего исследования - разработка новых способов и усовершенствование методологического и метрологического обеспечения анализа многокомпонентных полифункциональных лекарственных препаратов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии при различных режимах элюирования на сорбентах с широким диапазоном полярности и гидрофобности.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
изучить влияние ионной силы буферной составляющей ПФ на параметры удерживания ионогенных веществ (кодеин, эфедрин, аспирин, напроксен и др.) в разных сочетаниях в разных лекарственных формах («Пенталгин ICN», «Пенталгин ФС», «Пенталгин Н», «Пенталгин Ультра», «Нео-теофедрин», «Коделак фито», «Беллалгин», «Аскофен П» и др.) в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ на сорбентах с различной полярностью и гидрофобностью для разработки экспрессного метода оценки остаточной силанольной активности хроматографических сорбентов, обоснования выбора сорбентов оптимальной полярности, оптимизации разделения, повышения экспрессности анализа многокомпонентных препаратов и улучшения метрологических характеристик методик;
определить возможности градиентного элюирования для повышения воспроизводимости и экспрессности хроматографического анализа: провести сравнительное метрологическое исследование изократического и градиентного вариантов хроматографического анализа многокомпонентных смесей, входящих в состав лекарственных препаратов «Кофицил плюс», «Проходол форте», «Ко-тримоксазол», «Теодибаверин», «Ингалипт», «Декспантенол» для выбора оптимального режима разделения; изучить особенности применения градиентного элюирования с изменением рН ПФ при разделении компонентов препарата «Максиколд»; исследовать возможности изменения состава ПФ от водных растворов к органическим растворителям и их смесям при одностадийном количественном определения гидрофильных и гидрофобных веществ в мультивитаминном препарате «Компливит»;
найти пути оптимизации условий пробоподготовки при анализе препаратов, содержащих компоненты, нестабильные при условиях анализа (анальгин в «Пенталгине ICN», «Пенталгине Н», «Беллалгине», аскорбиновая кислота в «Инфлюнорме» и «Максиколде»), или взаимодействующие со вспомогательным веществом (гидрохлорид эфедрина в «Нео-теофедрине): определить кинетические параметры разложения лабильных веществ для разработки способов их стабилизации при количественном анализе и разработки кинетического способа определения продуктов деструкции; исследовать химизм взаимодействия гидрохлорида эфедрина и натрия кросскармеллозы для разработки способа устранения мешающего влияния при количественном анализе;
изучить влияние концентрации испытуемого раствора на метрологические характеристики хроматографических методик для обоснования оптимальной нагрузки на колонку: провести сравнительное исследование способов анализа с двумя или с одним разведением испытуемого раствора на примере препарата «Пенталгин Н», содержащего компоненты в количествах, различающихся в 30 и более раз; исследовать зависимость воспроизводимости площадей пиков при последовательных инжекциях от их величины на примере модельной смеси «Аскофен П»;
использовать результаты проведенных исследований для разработки комплекса точных, экспрессных, экономичных хроматографических методик анализа многокомпонентных лекарственных препаратов.
Научная новизна:
установлено, что эффективность и направление влияния ионной силы буферной составляющей ПФ на коэффициенты удерживания органических оснований (кодеина, эфедрина, дифенгидрамина и др.) в условиях обращено- фазовой ВЭЖХ зависит от соотношения силанофильных и гидрофобных свойств сорбентов: на сорбентах с преобладающими силанофильными свойствами рост ионной силы приводит к снижению удерживания оснований, для сорбентов с преобладающими гидрофобными свойствами наблюдается противоположная зависимость; при помощи установленной зависимости определена остаточная силанольная активность ряда хроматографических сорбентов с разной полярностью и гидрофобностью;
доказано, что метрологические характеристики хроматографического анализа лекарственных препаратов в условиях градиентного режима с применением современного серийного оборудования, обеспечивающего высокую точность смешения растворителей, не уступают результатам, полученным при изократическом элюировании, при этом изменение рН ПФ на 4 ед. за 10 мин, а также градиент от водного буферного раствора (перхлорат калия и октансульфонат натрия) до смеси органических растворителей (4:1) ацетонитрил - изопропанол на колонке с монолитным сорбентом позволяет проводить одностадийное разделение и количественное определение гидрофильных и гидрофобных аналитов с различными кислотно-основными свойствами;
показаны пути оптимизации пробоподготовки: обоснована возможность и реализован одностадийный количественный анализ в градиентном режиме ВЭЖХ многокомпонентных препаратов с многократно (30 и более раз) различающимся содержанием действующих веществ, предложен способ количественной оценки такой возможности, основанный на сопоставлении количеств компонентов в образце и чувствительности их определения при используемых условиях; показано, что снижение полярности смешанного растворителя при увеличении содержания органического модификатора в растворе пробы снижает скорость деструкции анальгина и аскорбиновой кислоты, а оптимальную стабилизацию обеспечивает совместное введение ацетонитрила и сульфита натрия; установлено, что гидрохлорид эфедрина и натрия кросскармеллоза в водно-органических растворах и в твердой фазе взаимодействуют по ионообменному механизму, а мешающее влияние этого процесса при количественном определении лекарственного вещества может быть устранено добавлением в анализируемый раствор дигидрофосфата калия или хлористоводородной или ортофосфорной кислот;
обоснована перспективность применения кинетического способа для количественного определения продуктов разложения лабильных веществ, основанного на расчете теоретической площади пика аналита и его соответствующей концентрации в момент растворения пробы, по разности площадей пиков на последовательных хроматограммах анализируемого раствора.
Новизна технических решений, предложенных в работе, подтверждена 7 патентами на изобретения.
Практическая значимость работы.
-
-
Сформулировано новое перспективное направление в хроматографическом анализе - одностадийный количественный анализ многокомпонентных полифункциональных лекарственных препаратов методом ВЭЖХ с использованием ионной силы буферной составляющей ПФ как главного фактора оптимизации хроматографической селективности, с применением градиентного элюирования с изменением состава ПФ от водного буферного раствора до смеси органических растворителей, с изменением рН ПФ на 3 и более единиц в течение одного анализа, с одностадийным количественным определением веществ, содержание которых в препарате различается в 30 и более раз.
-
Разработаны способы:
оценки остаточной силанольной активности и (или) гидрофобности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов для оперативного выбора хроматографической колонки при анализе сложных смесей органических веществ, содержащих вещества основной природы;
стабилизации анальгина и аскорбиновой кислоты при условиях анализа многокомпонентных лекарственных препаратов;
кинетического определения продуктов разложения лекарственных веществ;
устранения влияния взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в многокомпонентном препарате на результаты количественного анализа на примере системы гидрохлорид эфедрина - натрия кросскармеллоза;
подтверждения подлинности нового многокомпонентного растительного препарата сиропа «Пассифит» с комплексным использованием ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ с учетом различия физико-химических свойств компонентов препарата с применением в качестве стандартных образцов (СО) экстрактов и настоек, составляющих препарат;
анализа двухкомпонентного лекарственного препарата с использованием двухкомпонентной субстанции в качестве СО для количественного определения каждого из компонентов.
-
В результате проведенных исследований разработан комплекс экспрессных одностадийных хроматографических методик анализа многокомпонентных полифункциональных лекарственных препаратов. Подтверждены правильность и воспроизводимость получаемых результатов. Методики включены в 14 государственных стандартов качества - Фармакопейные статьи предприятия (ФСП).
Положения, выносимые на защиту:
эффективность применения варьирования ионной силы буферной составляющей ПФ при разделении смесей органических веществ с разными физико-химическими свойствами и использование способа оценки остаточной силанольной активности и (или) гидрофобности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов для выбора хроматографической колонки при решении конкретной аналитической задачи;
результаты сравнительного исследования метрологических характеристик изократического и градиентного вариантов обращенно-фазовой ВЭЖХ многокомпонентных лекарственных препаратов; использование градиента рН и градиента состава ПФ от водного буферного раствора до смеси органических растворителей для количественного анализа многокомпонентных лекарственных препаратов;
ионообменный механизм взаимодействия лекарственных и вспомогательных веществ в многокомпонентных препаратах, необходимость учета этого взаимодействия при разработке методик анализа и способы устранения его влияния на результаты количественного определения;
использование кинетического способа определения продуктов разложения лекарственных веществ, нестабильных при условиях анализа, для повышения правильности результатов определения;
комплекс валидированных методик хроматографического анализа многокомпонентных лекарственных препаратов для контроля качества фармацевтической продукции.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на международном конгрессе ICAS-2006 (2006 г., г. Москва), II и III Всероссийских конференциях «Аналитика России» (2007, 2009 гг., г. Краснодар), II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (2008 г., г. Воронеж), I Всероссийской конференции «Современные методы химико- аналитического контроля фармацевтической продукции» (2009 г., г. Москва), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010 г., г. Краснодар), 4-ой всероссийской с международным участием научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ» (2010 г., г. Воронеж), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы химической науки, практики и образования (2009 г., г. Курск), научно-практической конференции «Фармация из века в век» (2008 г., г. Санкт-Петербург), 69 итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук центральночернозёмного научного центра РАМН (2004 г., г. Курск), III Всероссийской научной школе-семинаре с международным участием «Хроматографические, ионообменные и мембранные процессы» (2009 г., г. Воронеж), 65-ой научной конференции по фармации и фармакологии (2010 г., г. Пятигорск), VII международной научно-практической конференции «Наука и образование 2005» (2005 г., г. Днепропетровск), региональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ (2006 г., г. Курск), 72-ой научной конференции КГМУ и сессии центрально-черноземного научного центра РАМН (2007 г., г. Курск).
Конкретное личное участие автора. Результаты работы, полученные в соавторстве, выполнены при личном участии автора в эксперименте или под его руководством, при его теоретическом обосновании и постановке проблемы. Все данные систематизированы и проанализированы лично автором.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 статей в журналах, входящих в перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 368 страницах машинописного текста, иллюстрирована 49 таблицами, 61 рисунком и включает: обзор литературы, характеристику использованных приборов и оборудования, реактивов и материалов, изложение общих подходов к проведению анализа и расчету результатов, пять глав о результатах исследований, заключение, выводы, приложения. Библиографический указатель включает 508 источников литературы, из них 358 - на иностранных языках.
Особенности используемых сорбентов и исследование их свойств
Области применения. Для ГЛС, помимо идентификации и количественного определения действующих компонентов, ВЭЖХ используют при определении показателей «Растворение», «Однородность дозирования», для оценки стабильности препаратов при хранении. Удобно определять и различные ВВ, в том числе консерванты и стабилизаторы. Консерванты определяли в суспензии ацикловира [147], в эмульсии гидрокортизона ацетата [191], сиропе парацетамола и гвайфенезина [334], суспензии сульфаметоксазола и триметоприма [148], поливитаминном сиропе [26].
Высокая селективность метода позволяет определять родственные примеси, изомеры и продукты деградации в фармпрепаратах. Успешно разделены изомеры мезилата 2-бромэргокриптина в таблетках «Абергин» [75] и псоралена [87]. На хроматограмме субстанции витамина Вг имеется до пяти индивидуальных пиков [26], а субстанция витамина А может содержать, помимо ретинола, его- эфирные производные (ацетат, пальмитат) [70]. В подобных случаях количественный состав смеси наиболее рационально определять именно методом ВЭЖХ.
В то же время, и при использовании ВЭЖХ не исключена необходимость предварительного отделения, некоторых ВВ; в частности, суспендирующих агентов, быстро выводящих, из строя хроматографические колонки [147; 148]. Анализ многокомпонентных препаратов содержащих компоненты в макро- и микроколичествах. Наиболее общий подход — определение микрокомпонентов в концентрированном образце и остальных составляющих после соответствующего разбавления: Так, при анализе многокомпонентного препарата, содержащего парацетамол, кофеин, малеат хлорфенирамина и гваяколглицерат, готовили два испытуемых раствора с разной концентрацией. Раствор для определения парацетамола содержал 0,08 мг/мл определяемого вещества, малеата, хлорфенирамина, — 0,032 мг/мл. Вместе с тем, соотношение содержаний этих компонентов в лекарственной форме — 100:1. Авторы отмечают, что одностадийное определение: в рассматриваемом случае невозможно, так как при достижении приемлемой чувствительности определения микрокомпонента высота пика парацетамола выходит за пределы линейного диапазона, при снижении концентрации раствора — не детектируется пик хлорфенирамина [404].
Недостатками подобных методик являются перегрузка колонки, влияющая на качество разделения и форму пиков, уменьшение срока службы колонки и снижение правильности получаемых результатов.
Принципиально иной подход реализован при определении компонентов препарата «Каффетин» (0,21 г пропифеназона,. 0 25 г парацетамола, 0,05 г кофеина, 0,01 г фосфата кодеина) [18]. Фосфат кодеина отделяют и концентрируют жидкость-жидкостной экстракцией, а затем определяют методом ВЭЖХ. Такой подход также не лишен недостатков, поскольку эстракция увеличивает продолжительность анализа, приводит к потерям и снижает точность результатов: по данным авторов методики, степень извлечения кодеина из пробы - 89 -93 %.
В некоторых случаях оптимален третий подход - определение микрокомпонентов альтернативными методами. Так, например, определяли гидрохлорид эфедрина и сульфат атропина в восьмикомпонентном, препарате «Спазмовералгин нео» при содержании ниже предела обнаружения- метода ВЭЖХ с УФ-детектированием [100]. Наконец, анализ в режиме градиентного элюирования способствует одностадийному определению, поскольку повышается чувствительность анализа. Однако, в этом случае выше требования к качеству применяемой воды и реактивов для уменьшения количества и величины системных пиков, мешающих определению компонентов, содержащихся в относительно малых количествах [130].
В ряде случаев по объективным причинам ВЭЖХ с УФ-детектированием неприменима для определения «всех компонентов ГЛС. Аминокислоты, не имеющие поглощения в УФ области спектра, при использовании спектрофотометрического детектора необходимо предварительно дериватизировать. Однако дериватизация L-цистина (препарат «Элтацин») затруднена из-за нестабильности производных. Поэтому L-цистин определяют окислительно-восстановительным титрованием, два других компонента — L-глутаминовую кислоту и глицин — методом ВЭЖХ [144]. При анализе методом ВЭЖХ с УФ детектированием препарата «Меновазин» (новокаин, анестезин, ментол) ментол, молярные коэффициенты поглощения которого низки, определяют альтернативным методом [78]. Ряд методик анализа многокомпонентных ГЛС включает титриметрическое определение одного из компонентов, например, иодометрическое определение анальгина в таблетках «Пенталгин ICN». Остальные компоненты препарата определяют методом ВЭЖХ [3]. На наш взгляд, такой подход не оправдан, поскольку все компоненты можно определить в одну стадию методом ВЭЖХ, предварительно повышая стабильность анальгина в испытуемом растворе.
Продолжительность анализа. Одним из направлений развития современной ВЭЖХ является сокращение времени анализа. Этого можно достичь несколькими способами: уменьшением размеров колонки и частиц сорбента, увеличением скорости потока элюента, повышением температуры и др. Так, например, для анализа шестикомпонентной лекарственной смеси на колонке 50x2,1 мм с размером частиц сорбента 3,5 мкм при расходе ПФ 0,3 мл/мин и температуре колонки 30С требуется около 12 мин, а при соответствующих параметрах 20x2,1 мм, 2,6 мкм, 1,0 мл/мин и 40С - 1,5 мин. Кроме того, минимизация размеров колонки и увеличение скорости потока снижают время кондиционирования колонки [504]. Диаметр колонки также значительно влияет на хроматографическое разделение: при уменьшении диаметра увеличивается скорость потока и сокращается продолжительность анализа [247].
Уменьшение диаметра частиц сорбента — проверенный временем метод ускорения анализа. Более мелкие частицы обеспечивают более высокую скорость определения компонентов без потери селективности и эффективности разделения. При диаметре частиц 2,5 мкм на колонке 20x2,1 мм анализировали смесь преднизолона, дифенгидрамина, напроксена, амитриптилина и ибупрофена за 60 с [303]. Преимущество таких мелких частиц еще и в том, что зависимость эффективности колонки от скорости потока элюента выражена слабее, и можно использовать большие скорости потока при незначительном снижении эффективности [494]. Есть данные о применении сорбентов с еще более мелкими частицами. При разделении смеси аскорбиновой кислоты, гидрохинона, резорцина, пирокатехина и 4-метилпирокатехина на капиллярной колонке длиной 43 см, заполненной сорбентом с размером частиц 1 мкм, рабочее давление составляло 3000 бар, а эффективность для отдельных компонентов достигала (2,44 -3,30)х 10
Общие особенности приготовления растворов и расчетов
В работе использованы следующие приборы: - хроматограф жидкостный Waters Alliance 2695 с диодно-матричным детектором Waters 2996 («Waters», США); - хроматографы жидкостные микроколоночные «Милихром 4» и «Милихром 5» со сканирующим спектрофотометрическим детектором (ЗАО «Научприбор», г. Орел, Россия); - хроматограф газовый «Кристалл 2000М» с пламенно-ионизационным детектором (ЗАО СКВ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола, Россия); - ИК-Фурье спектрометр «Avatar 360 FT-IR E.S.P» ( Nicolet»,CIIJA); - рН-метр-милливольтметр «рН-673М» со стеклянным индикаторным электродом и насыщенным хлорсеребряным электродом сравнения (РУП Гомельский завод измерительных приборов, г. Гомель, Республика Беларусь); - установка для получения сверхчистой воды «Direct Q5» («Millipore», Франция); - хроматографические колонки и пластины указаны в описаниях конкретных работ. Для приготовления ПФ и растворов использовали: - воду с удельным электрическим сопротивлением не ниже 18,2 МОм/см (из установки Direct Q5); - ацетонитрил «для градиентной хроматографии» («Merck», Германия; «Sigma», США); - спирты метиловый и изопропиловый, хлороформ, н-гексан, октансульфонат и гексансульфонат натрия «для жидкостной хроматографии» («Merck», Германия); - дигидрофосфат калия, гидроокись калия, перхлорат калия, ортофосфорная кислота (reagent grade, «Merck», Германия); - хлорная кислота хч ТУ 6-09-2878-84; - фильтры мембранные фторопластовые с размером пор 0,45 мкм тип Acrodisk («Waters», США). Для приготовления растворов также использовали: диэтиловый эфир (ОСТ 84-2006-88); ТВИН-80 фарм. USP30-NF25 стр. 1192; ацетон «для спектроскопии («Merck», Германия); 95% ректификованный этиловый спирт ГОСТ Р 51652-2000 сорт высший.
В качестве стандартов ЛВ использовали фармацевтические субстанции, проверенные отделом контроля качества предприятия и соответствующие требованиям НД по всем показателям:
Анализ твердых лекарственных форм. Для выполнения анализа 20 единиц анализируемой формы взвешивали на аналитических весах и находили среднюю массу одной единицы в граммах с точностью до 4-го знака после запятой. Образец тщательно растирали в фарфоровой ступке, точную навеску помещали в мерную колбу, растворяли в растворителе, состав которого указан в конкретной методике и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученный раствор анализировали на хроматографе при условиях, описанных в конкретной методике. Рассчитывали площади пиков определяемых компонентов и находили количество каждого компонента в анализируемом препарате по формуле X=SKmcmm(/(ScmmH), (1) где SK и Scm — средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах растворов испытуемого и РСО соответственно, в мкВхс; тст, тс и тн масса стандарта определяемого вещества в растворе РСО, средняя масса одной единицы и масса навески растертого образца, взятой для приготовления испытуемого раствора соответственно, в граммах.
Анализ жидких лекарственных форм. Точную навеску (или точный объем) анализируемого препарата помещали в мерную колбу, растворяли в растворителе, состав которого указан в конкретной методике и фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. Полученный раствор анализировали на хроматографе при условиях, описанных в конкретной методике. Рассчитывали площади пиков определяемых компонентов и находили количество каждого компонента в одной дозе анализируемого препарата по формулам X=SKmcmVdp/(Scmml) (2) или X=SKmcmVd/(ScmVnp), (3) где Vd - объем одной дозы препарата, в миллилитрах, р - плотность препарата, в граммах на миллилитр, Vnp - объем пробы препарата, взятой для анализа, остальные обозначения соответствуют приведенным выше.
Приготовление и анализ модельных растворов для определения метрологических характеристик разработанных методик. Для подтверждения правильности и линейности разработанных методик анализа многокомпонентных лекарственных препаратов согласно утвержденной на предприятии СРП готовили модельные растворы, содержащие все ЛВ и все ВВ согласно НД. Для каждого препарата готовили 17 растворов, концентрации которых соответствовали следующим интервалам:
Оптимизация хроматографических методик подразумевает следующие моменты: разделить лучше (выше разрешение), разделить быстрее (меньше время удерживания), увидеть больше (ниже предел обнаружения), разделить дешевле (экономический эффект), разделить больше (выше производительность) [301, стр. 5]. В соответствии с этим главный критерий оптимизации, принятый в нашей работе — разрешение Rs «критической пары» пиков не должно быть меньше 1,5, то есть пики должны быть разделены до базовой линии. Вместе с тем, мы стремились не увеличивать Rs выше данного значения для обеспечения минимально возможного времени разделения.
Поскольку в данной5 работе мы не определяли низкие концентрации примесей, снижение предела обнаружения (и предела определения) не являлось нашей целью. Вместе с этим, при одновременном определении в многокомпонентных препаратах микро- и макрокомпонентов обеспечивали условия, при которых аналитический сигнал определяемых веществ находился в диапазоне от 2 ед. ОП (верхняя граница линейного динамического диапазона диодно-матричного детектора Waters 2996) до 10nD « 0,0003 ед. ОП (предел определения). Соотношение этих величин составляет 6667 и таково же может быть максимальное различие содержаний компонентов в препарате при условии, что чувствительность их определения при выбранных условиях одинакова. Если чувствительность определения микрокомпонента выше, чем макрокомпонента, то допустимое соотношение выше указанной величины, если верно обратное — ниже. Этот вывод можно проиллюстрировать в виде фактора G1, равного максимально возможному соотношению содержаний компонентов: GK2/10nD)(h hG), (7) где hi/hG - соотношение высот пиков микро- и макрокомпонента при равных концентрациях в анализируемом растворе. Учитывали недопустимость перегрузки колонки; ее отсутствие контролировали по форме пиков расчетом фактора PTF. Диапазон допустимых значений PTF, принятый в работе: 0,8-f-2,0.
Использование оптимизации ионной силы буферной составляющей подвижной фазы при количественном анализе таблеток «Пенталгин ICN» и «Пенталгин Н» методами градиентной и изократической ВЭЖХ
Во всех изученных случаях установлено снижение значений sr при росте площадей и высот пиков. Согласно предписанию Фармакопеи США sr для последовательных инжекций должно быть не более 2,0 % [487]. Используя полученные данные, с помощью линейной интерполяции можно рассчитать величины площадей, ниже которых воспроизводимость хуже указанного предела:
При 274 нм достигается наилучшая воспроизводимость площадей параллельных инжекций. /Для аспирина sr 2,0 % при величине площади, большей 10552 мкВхс, для парацетамола и кофеина это условие выполняется уже при минимальных в изученном интервале площадях (16761 и 10068 мкВхс соответственно). При 205 нм для выполнения поставленного условия необходимы значительно большие площади. Это можно объяснить сравнительно сильным поглощением растворителей при этой длине волны и более высоким уровнем шума nD. Для 295 нм и 274 нм результаты примерно равноценны. Для относительно малых пиков (S 30- 200 тыс. мкВхс в зависимости от длины волны детектирования) более воспроизводимы высоты, чем площади. Для пиков большей площади отмеченные различия уменьшаются или наблюдается противоположная картина — более воспроизводимы площади.
Для расчета площадей и высот пиков необходимо задать параметры интегрирования. Один из важнейших параметров — порог интегрирования Р. Когда скорость изменения измеряемого сигнала достигает значения Р, детектируется начало пика, при снижении скорости изменения сигнала до заданного значения отмечается конец пика. При более высоком Р расчетное значение площади пика должно быть меньше, поскольку начало пика отмечается позже, а его конец — раньше. Поскольку реальная хроматограмма не является идеально гладкой и характеризуется определенным уровнем шума, при относительно малых значениях Р за начало и конец пика программой расчета могут приниматься короткопериодические изменения сигнала. Вследствие этого на последовательных хроматограммах одного и того же раствора точки начала и конца пика могут не совпадать. Поэтому можно предположить, что от величины Р зависит воспроизводимость площадей пиков при последовательных инжекциях. Хроматограммы, полученные при п=12 последовательных инжекциях раствора 1 при 205 нм, интегрировали при разных значениях порога. Рассчитывали значения стандартных отклонений, дисперсий и критерия Фишера F [51; 143] как соотношения квадратов дисперсий для его минимального изученного значения (20 мкВ/с) и каждого значения порога (табл. 23).
Таким образом, при возрастании площадей и высот до определенных величин воспроизводимость улучшается и при дальнейшем их росте практически не изменяется. При спектрофотометрическом детектировании воспроизводимость выше при работе в области максимумов поглощения определяемых компонентов, в интервале длин волн минимального поглощения растворителей, при более низком уровне шума базовой линии. Для получения более воспроизводимых результатов следует подбирать оптимальные параметры интегрирования хроматограмм.
Влияние нагрузки на колонку на правильность результатов анализа таблеток «Пенталгин Н» методом градиентной ВЭЖХ
В литературе нет данных о сравнительном исследовании метрологических характеристик одностадийного и раздельного определения компонентов одного и того же препарата при различии содержаний в 30 и более раз. Такое исследование представляет научный и практический интерес.
Использовали колонку размером 150x3,9 мм с предколонкой 20x3,9 мм, заполненные обращенно-фазовым сорбентом Nova-Pak СІ8 с размером частиц 4,0 мкм («Waters»).
Для проведения анализа в одну стадию около 0,145 г (точная навеска) порошка растертых таблеток и около 0,500 г ЫагЗОз встряхивали в мерной колбе вместимостью 100 мл в 15 мл смеси (1:2) СН3Сїч[-вода в течение 5 мин. Объем полученного раствора доводили водой до метки и перемешивали. Параллельно готовили раствор РСО, содержащий в 100 мл около 0,500 г 160 Na2S03, 0,0600 г анальгина, 0,0200 г напроксена, 0,0100 г кофеина, 0,0020 г фенобарбитала и 0,0020 г фосфата кодеина (точные навески).
При проведении анализа с использованием двух разведений около 0,365 г (точная навеска) порошка растертых таблеток и около 0,200 г Na2S03 встряхивали в течение 5 мин в мерной колбе вместимостью 100 мл в 15 мл смеси (1:2) СН3С1ч[-вода. Объем полученного раствора доводили водой до метки и перемешивали (раствор «А» для определения кофеина, фосфата кодеина и фенобарбитала). 10,0 мл раствора «А» помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл с 0,200 г Na2S03, добавляли 2,0 мл CH3CN, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали (раствор «Б» для определения анальгина и напроксена). Для приготовления раствора РСО в мерной колбе вместимостью 200 мл растворяли около 0,400 г Na2S03, 0,0600 г анальгина, 0,0200 напроксена, 0,0500 г кофеина, 0,0020 г фенобарбитала и 0,0020 г фосфата кодеина (точные навески) в смеси (1:19) СН3Сг\[-вода.
При одновременном определении компонентов объем инжектируемых проб составлял 5,0 мкл, при использовании двух разведений — 20,0 мкл. В первом случае определяемые вещества детектировали при длине волны 212 нм, во втором - 220 нм (кофеин, кодеин, фенобарбитал) и 245 нм (анальгин, напроксен).
Характерная особенность хроматограмм, полученных по методике с двойным разведением — форма пика напроксена, имеющего более пологую по сравнению с тыловой фронтальную часть, то есть PTF \. Форма хроматографического пика связана с механизмом массообменных процессов в слое сорбента и с нагрузкой на колонку, то есть с массой инжектируемой в единичном анализе пробы. «Хвост» в тыловой части пика (PTF \) в обращенно-фазовой хроматографии характерен для веществ основной природы, более выражен при использовании сорбентов с высокой остаточной силанольной активностью и увеличивается при росте нагрузки на колонку.
Напроксен является кислотой (по нашим данным, рК«4,8). Обобщая данные о форме пика напроксена, полученные ранее (глава III, стр. 105) и в данном эксперименте, можно сделать вывод, что для него характерны ассиметричные пики, причем для диссоциированной формы величина PTF уменьшается при росте нагрузки на колонку. Как следует из сравнения рис. 28 а и рис. 28 б, в методике с двойным разведением напроксен имеет более асимметричный пик даже на хроматограмме разбавленного раствора. Это объясняется тем, что при использовании этой методики нагрузка на колонку выше — в 10 раз при анализе концентрированного раствора и в 2 раза — разбавленного (табл. 24).
Хроматографические свойства парацетамола, кофеина и аспирина на сорбенте с привитыми нитрильными группами і и анализ препарата «Аскофен П»
Как показано в обзоре литературы, ассортимент современных ВВ фармпроизводства огромен. Большинство работ посвящено технологическому применению этих веществ; значительно меньшее число публикаций освещает вопросы взаимодействия между компонентами и его влияния на стабильность препаратов. В то же время, необходимо остановиться и на аналитическом приложении данной проблемы, поскольку, на наш взгляд, без этого разработка основных методологических подходов к пробоподготовке при анализе многокомопонентных лекарственных препаратов была бы неполной. Аналитический аспект проблемы взаимодействия между компонентами рассмотрим на примере широко распространенного ЛВ и современного фармацевтического ВВ.
Взаимодействие гидрохлорида эфедрина с натрия кросскармеллозой и его учет при анализе эфедринсодержащих препаратов. Натрия кросскармеллоза (NaKK) — современное фармацевтическое ВВ, используемое в составе таблетированных лекарственных форм в качестве дезинтегранта для повышения биодоступности активных компонентов. В химическом отношении NaKK представляет собой поперечно-сшитую форму натрия карбоксиметилцеллюлозы (NaKMLQ. В водных и водно-органических растворах NaKK набухает, что ускоряет диспергирование таблеток и высвобождение действующих веществ из них.
При разработке методики анализа многокомпонентного препарата «Нео-теофедрин» мы столкнулись с проблемой: было получено содержание гидрохлорида эфедрина (ЭГХ) на 15-J-20 % ниже по сравнению с введенным количеством [112]. Поскольку ЭГХ — сильнодействующее вещество, подлежащее строгому предметно-количественному учету, его точное определение в лекарственных препаратах очень важно. Было сделано предположение, что причиной заниженных результатов является взаимодействие ЭГХ с NaKK в анализируемом растворе.
Для приготовления раствора ЭГХ около 0,050 г вещества растворяли в мерной колбе вместимостью 50 мл в смеси (1:19) ацетонитрил—вода (раствор «А»). В мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 5 мл ацетонитрила, 10 мл воды, 1,0 мл раствора «А», доводили объем раствора водой до метки и перемешивали. Для приготовления раствора смеси ЭГХ с NaKK в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали около 0,1 г NaKK, добавляли 5 мл ацетонитрила, 10 мл воды, 1,0 мл раствора «А», встряхивали в течение 10 мин, доводили объем раствора водой до метки и .перемешивали. При изучении влияния дигидрофосфата калия в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали около 0,1 г NaKK, добавляли 5 мл ацетонитрила, 10 мл воды, 1,0 мл раствора «А», необходимое количество 0,1 М раствора КН2Р04, встряхивали в течение 10 мин, доводили объем раствора водой до метки и перемешивали.
По 5 мкл каждого раствора дважды анализировали на хроматографе с колонкой Zorbax SB С8 3,5 мкм размером 150x4,6 мм с защитной предколонкой размером 12,5x4,6 мм («Agilent Technologies», США), используя в качестве ПФ смесь (15:85) CH3CN-0,025M КН2Р04 (рН 3,0). Расход ПФ составил 1,0 мл/мин, температура колонки 40С. Детектировали при 207 нм.
Для получения эфедрина основания около 0,1 г ЭГХ растворяли в 10 мл воды в пробирке вместимостью 20 мл с притертой пробкой. Добавляли 2 мл 25 % раствора аммиака, 5 мл тетрахлорида углерода и встряхивали 5 мин. Водный слой удаляли пипеткой, раствор эфедрина в тетрахлориде углерода обезвоживали безводным сульфатом натрия и фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в стакан вместимостью 50 мл. Растворитель выпаривали при нагревании на водяной бане, получая эфедрин в виде осадка на дне стакана.
Смеси для ИК-спектроскопии готовили тщательным растиранием компонентов в агатовой ступке в течение 5 мин. Полученные смеси прессовали в виде таблеток с КВг в соотношении 1:100 и снимали ИК-спектры в диапазоне волновых чисел 4000 -400 см-1 при разрешении 4 см .
Взаимодействие ЭГХ с NaKK в растворе. При разработке методики анализа препарата «Нео-теофедрин» в качестве растворителя пробы первоначально использовали первую ступень градиента — смесь (1:9) CH3CN-H2O. Было сделано предположение, что введение в растворитель КН2РО4 снизит степень связывания ЭГХ с NaKK. Действительно, при растворении пробы в смеси (1:9) CH3CN-0,025M КН2РО4 результаты по содержанию ЭГХ соответствовали введенному количеству. Было также установлено, что аналогичный эффект может быть получен и при подкислении раствора пробы до рН 2- -3 при помощи НС1 или Н3РО4. Результаты хроматографического анализа растворов ЭГХ и его смесей с NaKK представлены в табл. 44.
Похожие диссертации на Хроматографический анализ многокомпонентных полифункциональных лекарственных препаратов
-
