Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 11
1. Инсулин 11
2. Способы производства инсулина человека 20
2.1. Подуемнтстический и генно-инженерный способы 20
2.2. Ферментаивное превращение предшественника в инсулин .31
2.3. Методы очистки инсулина 35
2.4. Валидация процессов и аналитического контроля в производстве
биофармацевтических препаратов 49
3. Фармацевтические аналоги генно-инженерного инсулина 53
Результаты и обсуждение 63
1. Постановка задачи 63
2. Ферментативный гидролиз предшественника инсулина 66
2.1. Внутрипроизводственный контроль ферментативного гидролиза 67
2.2. Ферментативный гидролиз: влияние температуры 74
2.3. Ферментативный гидролиз: оптимальные концентрации реагентов .76
2.4. Производственный ферментативный гидролиз 81
2.5. Ферментативный гидролиз: обратимая модификация лизина (Б29) 82
3. Разработка и валидация метода контроля производства ГИЧ 85
3.1. Линейность 85
3.2. Правильность и точность (сходимость и воспроизводимость) 86
3.3. Предел обнаружения и нижний предел количественной оценки 88
3.4. Специфичность 89
3.5. Устойчивость метода 91
3.6. Выводы 94
4. Хроматографическая очистка инсулина 96
4.1. Подготовка опытного образца 97
4.2. Изучение состава подвижной фазы 98
4.3. Определение оптимальной наїрузки на сорбент 107
4.4. Определение оптимальной геометрии колонны 110
4.5. Подбор оптимальной неподвижной фазы 117
4.6. Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, проинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей 121
4.7. Производственная очистка инсулина 124
4.8. Валидация процесса хроматографической очистки инсулина... 126
5. Технология получения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро. 129
Материалы, приборы и методы 134
1. Материалы 134
1.1. Реактивы 134
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны 135
2. Приборы 137
2.1. Хроматографические системы 137
2.2. Оборудование 138
3. Методы . 138
3.1. Контроль производства ГИЧ методом ОФ ВЭЖХ ..138
3.2. Контроль содержания дТИ методом ион-парной ОФ ВЭЖХ 139
3.3. Контроль содержания ВМП методом SEC 140
3.4. Получение рекомбинаитных предшественников ..140
3.5. Проведение ферментативного гидролиза 141
3.6. Проведение ВЭЖХ-очистки 142
3.7. Проведение гель-фильтрации 143
Выводы 144
Список опубликованных работ 147
Благодарности 151
Библиография 152
- Ферментаивное превращение предшественника в инсулин
- Ферментативный гидролиз: оптимальные концентрации реагентов
- Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, проинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей
- Получение рекомбинаитных предшественников
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. С момента открытия того факта, что инсулин, вырабатываемый поджелудочной железой, отвечает за
снижение уровня сахара В крови [Banting F.G., Best СП. /The Internal Secretion of the Pancreas//J. Lab. Clin. Med. 1922. V.7. P.251-266], до настоящего времени прошло уже более 80 лет. Тем не менее, и по сей день этот гормон вызывает огромный интерес. Сахарный диабет занимает третье место по смертности после сердечнососудистых И онкологических заболеваний [BarfoedH.C. /Insulin Production Technology //Chem. Eng. Prog. 1987. V.83. F'.49-54; Ladish M.R.. Kohlmann K.L. /Recombinant Human Insulin /IBiotechnol. Prog. 1992. V.461. P.469-478]. В 2000 году в мире насчитывалось около 150 МИЛЛИОНОВ больных сахарным диабетом [Kjeldsen Т., Ludvigsen S., Diers I.. Balschmidt P., SorensenA.R., Kaarsholm N.C. /Engineering Enhanced Protein Secretory Expression in Yeast With Application to Insulin //J. Biolog. Chem. 2002. V.277. P.18245-I8248], и эта цифра ежегодно растет на 2-6 % [Klyushnichenko V., Brush R., BulychevA. /Feasibility of International Technology Transfer for the Production of Recombinant Human Insulin. Parti: Preparing for Product-Specific Manufacturing on a Global Scale //Bioprocess International. 2004. V.2. P.45-59; Баирамашвили Д.И. /Генно-инженерный Инсулин Человека: Успехи и Перспективы //Рос. Хим. Ж. 2005. TJO.IX. №1. С.34-45]. Так, например, К 2010 году прогнозируется увеличение числа страдающих этим заболеванием примерно до 33 МИЛЛИОНОВ В странах Европы [ZimmetP., AlbertiK. /Shaw Global and Societal Implication of the Diabetes Epidemic//Nature. 2001. V.414. P.782-787], а В нашей стране более 300 тысяч человек нуждаются в регулярном приеме препаратов инсулина. С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. Так в 80-е годы XX века
американской компанией Genentech разработана технология производства ГИЧ, которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [Clark A.J.,
Adeniyi-Jones R.O., Knight G, LeiperJ.M., Wiles P.G., Jones R.H., Keen #., MacCuish A.C., Ward J.D., Watkins P.J., CauldwellJ.M., GlynneA., ScottonJ.B. IBiosynthetic Human Insulin in the Treatment of Diabetes. A Double-Blind Crossover Trial in Established Diabetic Patients. //Lancet. 1982. V.2 (8294). P.354-357]. В настоящее время ежегодное производство АФС инсулина ВО всем мире превышает 15000 КГ [Petrides D., SapidouE., Calandranis J. I Computer-A ided Process Analysis and Economic Evaluation for Biosynthetic Human Insulin Production - A Case Study//Biotechnol. Bioeng. 1995. V.48. P.529-541]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие зарубежные фирмы, как Novo Nordisk (Дания), Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция). В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые организовать производство полного цикла и выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.
Разработка конкурентоспособной высокоэффективной технологии получения лекарственных препаратов ГИЧ и других терапевтических белков является одним из основных направлений современной отечественной бифармацевтики. Не менее важно производство аналогов ГИЧ, таких как инсулин-аспарт, инсулин-лизпро, которые существенно улучшают физиологическую динамику инсулина в крови. В инсулине-аспарт модификация молекулы, выраженная в замене остатка пролина (В28) на остаток аспарагиновой кислоты, привела к снижению способности молекулы к самоассоциации. Подобный же эффект был достигнут изменением местами остатков пролина (В28) и лизина (В29) в инсулине-лизпро. Эти модификации способствуют более быстрой абсорбции препаратов в кровь человека после введения.
Современные стандарты качества, принятые как в нашей стране, так и за рубежом предъявляют очень высокие требования к чистоте АФС, предназначенных для производства инъекционных лекарственных препаратов [United States Pharmacopeia. Philadelphia, PA. USA. 2000. (USP24). Suppl. 3; British Pharmacopoeia 1988. London: H.M. Stationary Office. 1988. P. 1-312; Фармакопейная Статья Предприятия ФСП 42-0452361302 // 2002. С.I-44]. Однако разделение инсулина и близкородственных ему белков является сложной задачей из-за сходства их физико-химических характеристик.
Цель исследования.
Разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения и очистки ГИЧ и его фармацевтических аналогов (инсулина-лизпро и инсулина-аспарт), ее оптимизация, разработка методов внутрипроизводственного контроля.
Задачи исследования.
Изучить и оптимизировать процесс ФГ РП с образованием инсулина.
Разработать и оптимизировать очистку инсулина методом ВЭЖХ на аналитическом уровне.
Масштабировать результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственного уровня, рассчитать производительность процесса.
Разработать и валидировать методы внутрипроизводственного контроля содержания ГИЧ.
Провести валидацию процесса очистки инсулина.
Разработать процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ФГ).
Разработать эффективный способ очистки аналогов.
Научная новизна.
Разработан метод контроля содержания дТИ в растворах ГИЧ, основанный на аналитической ион-парной ОФ ВЭЖХ.
Разработан и валидирован внутрипроизводственный метод контроля содержания ГИЧ, основанный на ОФ ВЭЖХ, более оперативный, чем метод, рекомендованный фармакопейной статьей.
Разработан способ получения ГИЧ ферментативным расщеплением РП с предварительно блокированными аминогруппами, что позволило снизить содержание дТИ в растворах ГИЧ до минимума.
Изучен процесс фибриллобразования (агрегации) инсулина в растворах с низким значением рН, предложены условия, в которых волокнообразование минимально.
Разработан и валидирован эффективный технологический процесс очистки ГИЧ, основанный на ОФ ВЭЖХ в смешанном (элюентном и «вытеснительном») режиме.
Практическая значимость работы.
Разработана и запатентована эффективная технология получения ГИЧ из РП методом ФГ с выходом ГИЧ около 90 % от теоретически возможного. Предложена схема ФГ РП с предварительно блокированными аминогруппами с помощью цитраконового ангидрида и последующим снятием защиты с получением инсулина. Разработан эффективный процесс очистки ГИЧ от примесей, содержание которых регламентировано фармакопейной статьей. Технология в настоящее время успешно внедрена и реализована на Опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Разработана технологическая схема выделения и очистки инсулина-аспарта и инсулина-лизпро, позволившая наработать опытные образцы АФС аналогов инсулина, которые в настоящее время проходят государственную регистрацию.
Апробация работы.
Результаты исследований были изложены на Третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2005), Московской международной конференции «Биотехнология и медицина» (Россия, Москва, 2006), Пятой международной конференции «HIC/RPC Bioseparations» (Швейцария, Интерлакен, 2007), Пятом
московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2009).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 10 статей в научных журналах и 1 патент.
Объем и структура диссертации.
Ферментаивное превращение предшественника в инсулин
Исторически первым способом получения инсулина для терапевтических целей выделение аналогов этого гормона из природных источников (островков Лаигерганса поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней). В 20-х годах прошлого века было установлено, что бычий и свиной инсулины (которые являются наиболее близкими к инсулину человека по своему строению и аминокислотной последовательности) проявляют в организме человека активность, сравнимую с инсулином человека 10]. После этого долгое время для лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом первого типа, применяли инсулины крупного рогатого скота или свиньи. Однако со временем в ряде случаев в организме человека начинают накапливаться антитела к бычьему и свиному инсулинам, вызывая нежелательные аллергические реакции. Тем более что потребности в препарате инсулина не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы [П].
Существенный вклад в развитие современной фармакологии вносит технология получения рекомбинантных ДНК с помощью методов генной инженерии. Созданные штаммы кишечной палочки, дрожжей, культивируемых клеток растений и животных используются для получения гормонов, большинства известных ферментов, противовирусных вакцин и т.д. С появлением технологии рекомбинантных ДНК впервые стало возможным производить инсулин в крупных масштабах. Так в 80-е годы XX века американской компанией Genentech разработана технология производства генно-инженерного инсулина человека (ГИЧ), которая впоследствии была коммерциализирована корпорацией Eli Lilly [12]. В настоящее время ежегодное производство активной фармацевтической субстанции (АФС) инсулина во всем мире превышает 15000 кг [13]. К лидирующим производителям ГИЧ относятся такие зарубежные фирмы, как Eli Lilly (США), Sanofi-Aventis (Германия-Франция), Novo Nordisk. (Дания). В нашей стране исследования н области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАМ) при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.
Разработка конкурентоспособной высокоэффективной технологии получения фармацевтических препаратов ГИЧ и других терапевтических белков является одним из основных направлений современной отечественной биотехнологии. Не менее важно производство аналогов ГИЧ, таких как инсулин-аспарт, инсулин-лизпро, инсулин-гларгин, которые существенно улучшают физиологическую динамику инсулина в крови.
Современные стандарты качества, принятые как и нашей стране, гак и за рубежом предъявляют очень высокие требования к чистоте рекомбимаптного инсулина человека, предназначенного для производства инъекционных лекарственных препаратов [14, 15, 16]. Однако разделение инсулина и близкородственных ему белков является сложной задачей из-за сходства их физико-химических характеристик. Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения и очистки ГИЧ и его фармацевтических аналогов, ее оптимизация, разработка контроля производства ГИЧ.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования . 1. Изучить и оптимизировать процесс ферментативного расщепления РП с образованием инсулина. 1.1. Определить оптимальную температуру для проведения ферментативного гидролиза; 1.2. Определить оптимальное соотношение ферментов; 1.3. Определить оптимальную концентрацию РП; 1.4. Изучить процесс ферментативного расщепления РП с предварительным блокированием аминогрупп. 2. Разработать и оптимизировать очистку инсулина методом ВЭЖХ на ана литическом уровне. 2.1. Определить оптимальную неподвижную фазу (размер частиц, пористость, длина алкИЛЬНОЙ прививки); 2.2. Изучить сорбенты различных производителей и выбрать оптимальные; 2.3. Определить оптимальный состав подвижной фазы (органический модификатор, буферные вещества, pil); 3. Масштабировать результаты ВЭЖХ очистки от аналитического до производственною уровня, рассчитать производительность процесса. 4. Разработать и валидировать метод контроля производства инсулина. 5. Провести валидацию процесса очистки инсулина от примесей. 6. Разработать процесс получения аналогов инсулина из соответствующих рекомбинантных предшественников (ферментативный гидролиз). 7. Разработать эффективный способ очистки аналогов от примесей.
Инсулин является полипептидным гормоном, ШраюЩИМ ключевую роль 8 процессах обмена веществ. Основная функция инсулина состоит и том, что в мышцах, печени и жировой ткани он усиливает апаболитические и иигиби-рует катаболитическис процессы. В частности, инсулин повышает скорость синтеза гликогена, жирных кислот, белков, а также стимулирует гликолиз. Существенное значение имеет стимуляция проникновения глюкозы, ряда других Сахаров, а также аминокислот в клетки мышц и жировой ткани. Способствуя транспорту глюкозы в указанные клетки, гормон снижает се содержание в крови (так называемый гипогликемический аффект). Инсулин инги-бирует такие катаболические процессы, как распад гликогена [17]. Он тормозит также гликонеогенез путем снижения уровня ферментативной активности пируват-карбокси.чачы и фруктозо-1,6-бисфосфатазы. Показано, что инсулин увеличивает также активность пируват-дегидрогеназы, ацетил-СоА-карбоксилазы и глицеролфосфат-ацетилтрансферазы [18]. Действие инсулина во многом противоположно действию адреналина и глюкагона [17]. Наиболее мощным нейромедиатором, стимулирующим секрецию инсулина р-клетками, служит ацетилхолин. Секрецию инициирует связывание па поверхности клеток ацетилхолина или карбамоилхолина с мускарииовыми хо-линергическими рецепторами, которые сопрягаются посредством G-белков с фосфолииазой С, генерирующей из фосфатидилинозит-4,5-бие-фосфата инозит- 1,4,5-трифосфат, мобилизующий Са24 из внутриклеточных пулов, и диа-цилглицерин; последний служит активатором протеинкиназы С. Т.Биден [19] обнаружил также, что пищевые раздражители мосле метаболического превращения опосредованно передают на р-клетки сигнал, резко повышающий чувствительность к Са2 секреторного аппарата и, по-видимому, связанный с активацией протеинкиназ.
Ферментативный гидролиз: оптимальные концентрации реагентов
Как известно, длина С-пептидов различных животных варьируется от 26 до 38 аминокислотных остатков [30]. Долгое время было принято считать, что укороченный С-псптид рекомбинантного проинсулина (менее 31 аминокислотного остатка) будет способствовать ухудшению правильного сворачивания цепи белка после восстановления дисульфидных связей 81}. Тем не менее, корейским биотсхиологам удалось синтезировать белок, С-пептид которого состоит из пяти аминокислотных остатков, при этом показано, что ренатурация такой системы протекает должным образом 80]. Важно отметить, что прогормон биологически активного инсулина может быть синтезирован в прокариотических клетках либо как неактивный белок в составе нерастворимых агрегатов, или телец включения, либо как нативный белок. Рсфолдинг проинсулина, выделенного из телец включения, сопровождается образованием правильно замкнутых дисульфидных связей in vitro. Однако успешно проводятся исследования, направленные на получение про-гормона in vivo, т.е. синтезируемого в пернплазматическую среду прокариотических клеток в нативной конформации [82, 83, 84]. Показано, что периплазм таких прокариотов, как Rcoli, обеспечивает необходимой средой белки для правильного замыкания дисульфидных мостиков in vivo. Этому способствуют окислительные условия компартмента, наличие облегчающих образование дисульфидных связей белков (белки семейства Dsb), а также проницаемость внешней мембраны E.coti для молекул, размером не превышающих 600 Да [85]. Немецкими учеными был получен рекомбинантный проинсулин с достаточно высоким выходом путем синтеза белка в периплазматическое пространство клеток, при условии добавления во время фолдинга дитиол -вектразы Р (Vectrase-P) или подобной ей дисульфид-изомеразы [86]. Такое применение изомераз описывалось ранее. Например, добавление вектразы-Р в культуральную среду использовалось для увеличения секреции нативной рекомбинантной кислотной фосфатазы дрожжевыми клетками S.ceievisiae [87]. Одним из наиболее перспективных разработок биотехнологии, направленных на использование в крупномасштабных производствах рекомбииатных бел-ков, оказались системы внеклеточной экспрессии, когда в качестве продуцентов используются дрожжевые клетки. Синтезируемые таким образом ре-комбинаптные белки имеют правильно замкнутые дисульфидные связи. Важным преимуществом использования дрожжевых систем является то, что, в отличие от прокариотических клеток, они нс содержат ни эндотоксинов, ни пирогенов клеточной стенки. Также в случае использования дрожжевых продуцентов синтезируемые рекомбинантные белки более доступны для их выделения, т.к. они либо накапливаются в цитоплазме, либо секрегируются в культу рал ьную среду [6,68].
Дрожжевые организмы уже достаточно давно используются для производства ряда белков, которые через секреторные везикулы комплекса Гольджи секрегируются во внеклеточное пространство [88]. Такие белки относят к разряду секреторных; они используются для выполнения своих функций за пределами клеточного пространства. Эти белки изначально синтезируются в цитоплазму, я затем транслоцируются через мембрану на эндоплазматиче-ский ретикулюм в составе предшественника, или так называемой проиептид-ной последовательности, служащей для правильного направления белка (транслокации) и перевода продукта через мембрану. Часто такая сигнальная последовательность выполняет функцию протеолитической защиты молекулы, а также способствует правильному замыканию дисульфидиых связей [89].
Использование дрожжевых продуцентов для получения предшественника инсулина человека описано уже достаточно давно [90]. При этом одноцепо-чечный нрогормон состоит из сигнальной последовательности, цепи А, сайтов щепления (лизин или аргинин в случае использование трипсиноподобных ферментов или метионин в случае гидролиза бромцианом), С-пептида и цепи В, что придает системе сходство с природным препроинсулином [69]. Однако показано, что С-пептид в такой системе может быть пренебрежимо мал, что не отражается ни на фолдингс, ни на транслокации молекулы, зато повышает выход синтеза. Отмечается, что возможна система, в которой С-пептид состоит всего из четырех аминокислотных остатков [91]. Однако показано, что уровень экспрессии прогормона инсулина с использованием продуцента S.cerevisiae достаточно низок и в несколько раз уступает выходам, полученным при использовании прокарнотических клеток (70]. Экспрсссионная система на основе P.pastoris отличается от системы S.cerevisiae тем, что представляет собой «метилотрофик» [92]. Метилотроф-ные дрожжевые микроорганизмы замечательны тем, что растут в присутствии метанола как єдинотвєнного источника углерода. Продуцент P.pastoris позволяет синтезировать рекомбинантиый предшественник инсулина в куль-туральную жидкость с выходами, сравнимыми с показателями, получаемыми при использовании прокарнотических клеток таких, какЕ.соіі [70]. Существенным недостатком технологии на основе дрожжевой экспрессии является тот факт, что предшественники инсулина сскрстируются продуцентом в культуральную среду в виде молекулы, лишенной остатка треонина в положении 30 цепи В. Далее полученный минипроинсулин выделяют из культуральной жидкости и после очистки превращают в инсулин человека реакцией транспептидации в присутствии трипсина и трет-бутилового (метилового) эфира треонина в водно-органической реакционной среде, что требует дополнительных стадий очистки ЦслвВОГО белка от нежелательных побочных продуктов [68].
В настоящее время для практической медицины представляет огромный интерес поиск фрагментов инсулина, ответственных за его связывание с рецептором. Четко ли разделены эти функции у инсулина, сегодня еще неизвестно. Вполне возможно, что синтетические фрагменты инсулина в растворе будут иметь нс ту конформацию, в которой они существуют в составе нативиой молекулы, что, несомненно, отразится на их функциональных свойствах. Возможно также, что они будут иметь низкую растворимость и значительную склонность к агрегации, что сделает затруднительным их практическое использование. Не исключено, что для взаимодействия с рецептором и проявления гормонального эффекта нужна полностью вся молекула инсулина. Вероятно, что для ответа на подобные и другие вопросы в первую очередь необходимо выявить иммунохимическую идентичность ипсулинов различного происхождения или их фрагментов. Л.Е.Панип и др. [93] предлагают для этого попытаться получить антитела к предполагаемому рецепторному домену. Авторами [93] в результате исследования показана иммунохимическая идентичность модельного димерного пептида, ими же синтезированного, и соответствующего района натииного инсулина человека, что свидетельствует о сходстве их пространственной организации.
Очистка от эндотоксинов клеточной стенки, проинсулинподобных полипептидов и высокомолекулярных примесей
Третье важное требование к хроматографическим сорбентам касается нагрузочной емкости [140]. Чем выше величина нагрузки на колонну, тем экономичнее процесс разделения и ниже стоимость очищенного продукта. Но с другой стороны, слишком большая нагрузка на колонну нанесенным материалом сокращает срок эксплуатации сорбента.
Емкость сорбента для обращеио-фазовой хроматографии определяется, во-первых, длиной алкилыюй цепочки, которой модифицирован силикагель, а во-вторых, степенью покрытия сорбента связанной фазой. Причем, несмотря на то, что второй показатель считают более важным для определения емкости сорбента [НО], производители сорбентов обычно не указывают степень покрытия неподвижной фазой силикагеля.
Важным фактором для разделения пептидов является разрешающая способность, но так как в препаративной хроматографии колонну часто перегружают, и пики уширяются, то более показательна селективность разделения. При более высокой селективности, на колонну можно нанести больше материала без изменения степени разделения веществ.
ОФ ВЭЖХ является методом, дающим очень хорошо воспроизводимые результаты [128]. Этот факт в совокупности с достаточно высокой степенью механической устойчивости сорбента позволяет проводить большое количество хроматографических циклов, и даже при ухудшении разделения между полипептидами проведение регенерации способно продлить использование сорбента без его замены [131],
При оптимизации подвижной фазы, используемой для элюирования инсулина с ВЭЖХ-сорбента, задача сводится к подбору органического модификатора и компонента, обеспечивающего необходимую буферігую емкость для поддержания постоянного рИ раствора.
Описано достаточно большое количество различных органических модификаторов, составляющих подвижную фазу при очистке инсулина. Как правило, для этих целей используют органические спирты, содержащие от 1 до 3 атомов углерода в цепи, кстоїш или ацетонитрил. Несмотря па то, что в некоторых патентах; действительно описаны элюенты на основе таких кетоиов, как диметилкетон (ацетон), использование их в препаративном масштабе крайне проблематично. Они обеспечиваю! плохую растворимость инсулина, поглощают в диапазоне УФ, предпочтительном для работы с инсулином (260-280 им), и могут растворять некоторые части хроматографической аппаратуры и даже сам сорбент (если он основан на полистироле) [121]. Другие предлагаемые растворители, такие как диоксан, диметилсульфоксид, метанол и ацетонитрил слишком токсичны и поэтому также нежелательны [54, 57, 62, 115, 120, 141 ]. Хотя ацетонитрил все равно используется на многих производствах инсулина, т.к. обладает низкой вязкостью (0,38 МПа с [142]) и хорошо растворяет инсулин и иисулиновые производные. Но, главное, при использовании ацетонитрил а можно достигнуть очень высоких показателен разделения инсулина и примесных соединений. Пропанол и изопропанол -достаточно вязкие жидкости (более 2 МПа с [142]), поэтому их добавление в подвижную фазу приводит к повышению рабочего давления в хроматографической системе и вынуждает снижать скорость потока [57]. Этанол наименее токсичен из всех выше описанных растворителей, и, к тому же обладает приемлемой вязкостью (1,2 МПа с [142]); однако разделение инсулина при его использование не настолько эффективно, как при использовании ацето-нитрила или метанола [57]. Таким образом, идеального варианта не существует. Поэтому правильный выбор органического модификатора подвижной фазы будет иметь существенное влияние на оптимизацию процесса очистки в целом.
Одним из основных параметров процесса хроматографической очистки инсулина является рН подвижной фазы. Очевидно, что подвижная фаза должна хорошо растоорять инсулин, т.е. се рН должен отличаться от изоэлектриче-ской точки инсулина (pi 5,4). В противном случае, белок может выпадать в осадок непосредственно в хроматоірафической системе и/или колонне. Как уже говорилось выше, следует использовать подвижную фазу с таким рН, который не приведет к гидролизу привитого липофилыюго модификатора сорбента. Таким образом, выбор рН ограничен диапазонами от 2 до 5 и от 6 до 8. В области аналитической хроматографии инсулина уже давно сформировалось убеждение, что лучше всего работать в диапазоне рН подвижных фаз от 2 до 3. В таком случае не возникает проблем с растворимостью анализируемых образцов, не наблюдается остаточной сорбции компонентов па хромато-графическом геле, а сам сорбент служит достаточно долго, т.к. привитый ал-кильный «хвост» практически не гидролизустся [57, 66, 67, 128, 143]. Поэтому в Фармакопее также принята методика анализа инсулина, основанная па кислой подвижной фазе [14, 15]. Однако показано, что воспроизводимость результатов количественного определения содержания инсулина в растворах гораздо выше, когда используют подвижную фазу с рН от 7 до 8 [127]. Кроме того, разделение между инсулином и одним из родственных ему компонентов, а именно ВЗ-дезамидоинсулином, гораздо выше в условиях, когда для определения используется подвижная фаза со значением рН выше изоэлск-трической точки [65].
Получение рекомбинаитных предшественников
Первым удачным аналогом сверхкороткого действия был инсулин-лизпро, характеризующийся изменением аминокислотной последовательности в положениях В28 (лизин) и В29 (пролин) [174, 175, 176, 177]. Показано, что назначение ежедневных подкожных инъекций инсулина-лизпро пациентам, страдающим сахарным диабетом первого типа, вместо инъекций обычного инсулина приводит к значительному снижению риска гипогликемии II78]. 1 Іосле внутримышечной инъекции препарата, инсулин-лизпро попадает в плазму крови быстрее, чем обычный инсулин; действие инсулина-лизпро также короче действия обычного инсулина. Это связано с отсутствием самоассоциации (молекула инсулина-лизпро в растворе находится только в мономерной форме) [9, 36]. Также сообщалось, что, в отличие от обычного инсулина короткого действия, инсулин-лизпро можно принимать непосредственно перед едой или (что лучше) после еды, в зависимости от предпочтений пациента или прочих условий [179, 180]. Отмечено, что фармакокинетика инсулина-лизпро меньше зависит от дозы препарата [181] или места инъекции 1182], чем кинетика обычного инсулина. Некоторые исследования проводились по использованию инсулина-лизпро совместно с инсулином НПХ. Отмечено, что так обеспечивается гораздо лучшее поддержание необходимого уровня глюкозы как до принятия пищи, так и после, по сравнению с совместным использованием растворимого инсулина и инсулина НПХ [183]. Другие клинические исследования показали, что использование инсулина-лизпро совместно с пролонгированной формой инсулина-лизпро, так называемым инсулином НПЛ (протамин-лизпро), приводит к улучшению динамики всасывания инсулина по сравнению с использованием только инсулина-лизпро [184, 185, 186].
Поиск инсулииового производного сверхкороткого действия в основном проводили, изменяя аминокислотную последовательность в области В22-В29 молекулы инсулина. Получали аналоги, в которых фенилаланин в положении В25 заменяли на гистидин или тирозин [63J. Заменой аминокислоты в положении В28 на лизин или аргинин получены производные с подобными свойствами [187]. Перечисленные манипуляции главной целью имели обойти патентные права Eli Lilly and Со на производство такого аналога сверхкороткого действия, как инсулин-лизпро (коммерческое название «Хумалог»). Конкурирующей фирме Novo Nordisk A/S в 2001 году удалось вывести на фармацевтический рынок быстродействующий аналог инсулина, который оказался равноценен инсулину-лизпро (коммерческие названия «НовоРапид» и «НовоЛог»). Интересно, что разработка этого модифицированного инсулина была предложена гораздо раньше, чем появился инсулин-лизпро [188, 189]. Этот аналог, называемый инсулин-ас парт, образован заменой пролила В28 на аспарагиновую кислоту [164, 190]. Клинические исследования достоверно показали, что применение инсулина-зспарт обеспечивает заметное улучшение в контролировании уровня глюкозы в крови пациента, страдающего сахарным диабетом, после принятия пищи [164, 191, 192, 193]. С точки зрения пациентов, качество их жизни повышалось при замене инъекций обычного быстродействующего инсулина именно на инсулии-аспарт [194, 195, 196]. Сообщалось, что во многих случаях использование инсулина-аспарта целесообразнее, чем использование обычного инсулина, в силу отсутствия или уменьшения уровня гиперчувстнителыюсти у пациентов к препарату [197, 198]. Интересно, что в отличие от препаратов инсулина-лизпро [178], при подкожных инъекциях препараты инсулипа-аспарт не только снижают уровень глюкозы в крови, но и уровень ацетилированного гемоглобина, что обеспечивает максимальное моделирование физиологической секреции инсулина в организме человека [199, 200, 201]. Большинство клинических исследований показало, что между инсулииом-аспартом и инсулином-лиэпро нет существенной разницы, сели сравнивать их профили абсорбции и относительное влияние на уровень глюкозы в крови [200, 201, 202]. Тем не менее, некоторые исследователи указывают на то, что инсулии-аспарт абсорбируется быстрее, что выражается в большей концентрации инсулина в крови через 40-120 минут после назначения препарата (максимум эффективности) в случае нисулина-аспарта, чем в случае инсулина-лизпро [203, 204]. Ниже представлены фармакокииетичсскис/динамические профили для инсулина-аспарта и инсулина-лизпро в сравнении с инсулином (Рис. 13, Рис. 14).
Необходимо также сказать несколько слов о новом инсулиноиом аналоге, так называемом глулизнне. Глулизин, разработанный как аналог сверхбыстрого действия, ча рынке фармпрепаратов появился относительно недавно («АПИДРЛ», Авентис) [205, 206]. Этот аналог отличается от человеческого инсулина заменой остатка аспарагица на лизин в положении ВЗ, а также лизина на глутаминовую кислоту в положении В29 [207, 208]. Новый фармацевтический продукт обладает преимуществом понижать уровень ацетилиро-ванного гемоглобина до базальиых значений и рекомендован для терапии совместно с такими пролонгированными формами инсулина как НГГХ [208], Как было сказано выше, для поддержания необходимого гликемического контроля, особенно в ночное время, необходимы препараты инсулина пролонгированного действия. Пролонгирующий эффект достигается в первую очередь за счет подкожного введения препарата, представляющего собой суспензию (протамин-иисулин). Подобная суспензия может включать в себя как кристаллы инсулина, так и кристаллы инсулиновых аналогов короткого действия [184, 185, 209, 210]. Подобный метод, однако, не лишен определенных недостатков. Во-первых, рссуспендирование препарата пациентом может привести к неверной дозировке. Во-вторых, инъекция препарата, представляющего собой суспензию, достаточно болезненна.
