Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 6
1.1 ДНК в нанотехнологии 8
1.1.1 Линейные ДНК в наноэлектронике 8
1.1.2 Агрегация наночастиц посредством ДНК 9
1.1.3 Разветвленные мотивы на основе ДНК 11
1.1.4 Сложные ДНК-мотивы в качестве структурных строительных блоков 11
1.1.5 Протяженные линейные ДНК, свернутые в сложные мотивы , . 14
1.1.6 Прототипы молекулярных двигателей на основе ДНК 15
1.1.7 Основанные на ДНК биосенсоры 17
1.1.8 Выводы 19
1.2 Обзор методов компьютерной химии 19
1.2.1 Различия между методами молекулярной механики, полуэмпирическими и ab initio методами 19
1.2.2 Компоненты ab initio вычислений 21
1.2.3 Базисы 22
1.2.4 Методы 24
1.2.5 Типы вычислений 25
1.2.6 Изучение растворов 28
1.2.7 Некоторые примеры использования методов компьютерной химии в современных иследованиях 28
1.3 Обзор методов двумерной ЯМР-спектроскопии 30
1.3.1 Применение современных методов ЯМР 31
1.3.2 Модернизация представления ID 13С ЯМР-спектров: DEPT . 31
1.3.3 Гомоядерная корреляционная спектроскопия: COSY 32
1.3.4 Полная корреляционная спектроскопия: TOCSY 35
1.3.5 Гетероядерная односвязная корреляционная спектроскопия: HMQCHHSQC 35
1.3.6 Спектроскопия гетероядерной корреляции через несколько связей: НМВС 37
1.3.7 Корреляции через пространство: ядерный эффект Оверхаузера и эксперимент NOESY 39
Теоретическая часть 42
2.1 Синтез псевдопептидов 43
2.1.1 Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот 43
2.1.2 Синтез псевдопептида Boc-L-Glu(7-OBzl)-\I>-GlyOAll 47
2.1.3 Синтез псевдопептида BocGly-*-IrGlu(7-OBzl)OAll 47
2.1.4 Синтез псевдопептида Cbz-L-Glu(7-0tBu)-*(Ns)-L-His(Ns)0Me . 48
2.1.5 Синтез защищенных псевдопептидов, содержащих остатки про-лина Ґ 49
2.2 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Glu-\I>-Gly и Gly-Ф-Glu 51
2.3 ЯМР-эксперименты по доказательству структуры полностью защищенных мономеров 03 ПНК на основе псевдопептидов Gly-^-Glu и Glu-*-Gly 56
Экспериментальная часть 72
3.1 Синтез защищенных /3-аминоспиртов 74
3.2 Синтез псевдопептида Glu-^-Gly 75
3.3 Синтез защищенного псевдопептида Gly-ty-Glu 76
3.4 Синтез защищенного псевдопептида Glu-^-His 79
3.5 Синтез защищенных псевдопептидов состава ProGly-Ф-Рго 81
3.6 Синтез Cbz-защищенных цитозина и аденина 85
3.7 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептида Glu-Ф-СІу . 86
3.8 Синтез мономеров 03 ПНК на основе псевдопептида Сіу-Ф-Glu . 89
Выводы 95
Список литературы 96
- Линейные ДНК в наноэлектронике
- Различия между методами молекулярной механики, полуэмпирическими и ab initio методами
- Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот
- Синтез псевдопептида Glu-^-Gly
Введение к работе
Создание аналогов природных пептидов, содержащих в своем составе восстановленную пептидную связь (Ф), представляет интерес с точки зрения изучения их взаимодействия с протеолитическими ферментами с целью применения данных пепти-домиметиков в медицине. В связи с изучением сигнальных пептидов мозга, особый интерес представляют псевдопептиды типа ProGly-Ф-Рго. Регулярное чередование пептидной и псевдопептидной связи является основой для другого важного класса аналогов биополимеров — пептидно-нуклеиновых кислот (ПНК). Такая модификация природной пептидной связи позволяет получать не подверженные биодеградации структуры, подобные НК, что в сочетании с аффинностью к олигонуклеотидам определяет их перспективность в различных областях биотехнологии.
Таким образом, является актуальной проблема поиска наиболее оптимального подхода к созданию псевдопептидной связи, а также рациональных способов де-риватизации псевдопептидов и синтез на их основе новых биологически активных соединений.
Результаты, полученные ранее в нашей лаборатории, позволяют говорить о высоком сродстве декамеров 03 ПНК с регулярной структурой, построенной из тимин-содержащих мономеров на основе псевдопептидов Glu-Ф-СІу и Gly-Ф-ОІи, к комплементарным олигонуклеотидам, и о возможности управлять степенью этого сродства посредством изменения состава буферной среды [1]. Таким образом, актуальной становится задача препаративного получения уже синтезированных ранее мономеров для получения олигомеров 03 ПНК, а также разработка путей синтеза новых мономеров, содержащих остатки других нуклеиновых оснований.
Линейные ДНК в наноэлектронике
Использование ДНК в качестве проводящего материала является многообещающим, хотя уже на протяжении многих лет вопрос электрической проводимости нуклеиновых кислот остается открытым. Передачу электронов в природной, немодифициро-ванной ДНК наблюдали во многих случаях [2], однако есть сообщения, свидетельствующие и о полупроводниковых [3] свойствах ДНК наряду с сообщениями об изоляционных [4] и даже сверхпроводящих [5] свойствах. Помимо экспериментальных, проводятся и теоретические ab initio исследования, направленные на изучение явления передачи электронов в ДНК в зависимости от конформации самой ДНК и ее окружения [б]. В любом случае, проводимости природной ДНК явно недостаточно для того, чтобы говорить о применении ее в качестве наноразмерного проводника. Однако, ДНК может служить подобием оболочки, или, наоборот, каркаса, для более привычных проводящих материалов — ионов или атомов металлов. Lee с сотр. описали новую форму ДНК -- М-ДНК, в которой имино-протоны гетероциклических нуклеиновых оснований замещены на ионы цинка, никеля или кобальта (Рис. 1а) [7]. Было показано, что цепи М-ДНК ведут себя подобно молекулярным проводникам и, в перспективе, способны найти применение в молекулярной электронике [8].
Другой способ увеличения проводимости ДНК состоит во включении нейтральных атомов металлов в структуру ДНК. Вгаип с сотр. успешно сконструировали основанные на ДНК Ag-содержащие проводники с помощью неэлектролитического напыления [4]. Ученые присоединили дцДНК фага к металлическим электродам с помощью одноцепочечных комплементарных олигонуклеотидов. Ионы серебра затем восстанавливали раствором гидрохинона, при этом образовывались Ag-содержащие наночастицы (AgNP). Далее производили наращивание слоя серебра так же, как это делается при закреплении фотографии, что приводило к образованию тонких нанопроводников вдоль цепи ДНК {Рис. 2). Таким способом удалось получить нанопроводники около 100 нм в диаметре и длиной 15 мкм. Недавно на основе различных структур ДНК были созданы Ag-содержащие нанопроводники с толщиной, сниженной до 15 нм, и несколькими микронами в длину {Рис. lb) и были измерены их электрические характеристики как при пониженной, так и при комнатной температуре [9].
При столь миниатюрных размерах проводника актуальной становится проблема потери металла вследствие химической коррозии либо механического отслоения. Keren с сотр. сообщили об успешной защите участков молекулы ДНК от потери металла при помощи ассоциации фрагмента металлизированной цепи ДНК с белками [10]. Возможность управлять степенью металлизации вдоль цепи ДНК делает возможным не только эффективную защиту нанопроводников от разрушения, но и позволяет создавать новые наноэлектронные устройства. В частности, этим же ученым удалось создать прототип полевого транзистора [11].
Поскольку силой сцепления спиралей ДНК можно легко управлять (изменяя длину и состав нуклеотидной последовательности), линейные ДНК находят применение в качестве структурных линкеров при контролируемой агрегации наночастиц в крупные ассоциаты. 12 пар оснований — минимум, необходимый для того, чтобы образующиеся дуплексы были устойчивыми при комнатных условиях [12]. олигонуклеотид-функционализированных наночастиц золота (8 и 30 нм в диаметре) (адаптировано из [18]). (Ь) Схематическое изображение 5-ти и 10-тинанометровых наночастиц золота, закрепленных вдоль якорной цепи ДНК (адаптировано из [14]). года описывается два метода сборки коллоидных наночастиц золота в агрегаты с использованием ДНК в качестве линкеров [13, 14] (Рис. 3). В процедуре, разработанной Mirkin, используются наночастицы, меченые множеством копий одного олигонуклеотида, в то время как технология, предложенная Alivisatos, дает коньюгаты только с одной цепочкой олигонуклеотида на одну наноразмерную частицу золота. Mirkin с сотр. также сконструировали гетеродисперсные ассоциаты, состоящие из наночастиц золота двух размеров: 8 и 31 нм в диаметре. Эти наночастицы были покрыты двумя различными по составу короткими олигонуклеотидами (12 нуклеотидов), модифицированными на концах посредством тиольных групп, и таким образом были присоединены к металлическим наночастицам через связи S-Au [15]. Когда добавлялась третья последовательность ДНК (24 нуклеотида), комплементарная обоим закрепленным на поверхности наночастиц золота олигомерам, образование дуплекса приводило к ассоциации обоих сортов наночастиц друг с другом. (Рис. За). Также были исследованы электрические и оптические свойства этих агрегатов ДНК-НЧЗ и не так давно были разработаны различные варианты их применения в области детекции молекул [16].
Метод, включающий мечение наночастиц лишь одним типом олигонуклеотидов, Alivisatos с сотр. использовали для получения димеров и тримеров из наночастиц золота при помощи гибридизации молекул ДНК, прикрепленных к наночастицам, с комплементарными последовательностями якорной ДНК (Рис. ЗЬ) [14]. Этот метод позволил расположить наночастицы золота в строго определенных положениях спроектированной структуры, что значительно повысило контроль над общей архитектурой конъюгата. Также была описана двумерная сборка наночастиц золота на случайной сетке из поли(сІА-сІТ) цепей ДНК [17].
Хотя линейные ДНК часто используются для сборки широкого ряда наноструктур, для создания более разнотипных и сложных конструкций крайне полезными оказываются разветвленные фрагменты ДНК. Ьио с сотр. сконструировали дендримеро-подобные структуры, собранные при помощи сцепленных липких концов из образцов ДНК с разветвленной вторичной структурой (Рис. 4а) [19], на их основе были получены трехмерные гидрогелей, созданные целиком из гибких разветвленных ДНК [20]. Х-, Y- и Т-формы субъединиц ДНК были гибридизованы посредством липких концов и ковалентно соединены друг с другом при помощи лигазы. Размер и форма этих больших трехмерных гидрогелей может с легкостью контролироваться использованием различных по форме емкостей (Рис. 4Ь). Новые эластичные материалы, созданные из гидрогелей на основе ДНК, могут найти применение в технике выращивания клеточных и тканевых культур, а также в сфере доставки лекарственных субстанций и в процессах бесклеточного синтеза белка.
Различия между методами молекулярной механики, полуэмпирическими и ab initio методами
Существует два направления в компьютерной химии, с помощью которых возможно изучать структуру молекул и их реакционную способность: молекулярная механика и квантовая механика. Оба этих метода позволяют вычислять энергию молекулярных структур, осуществлять оптимизацию геометрии, вычислять различные производные энергии, что в результате может дать сведения о таких свойствах, как спин-спиновые взаимодействия, корреляции с различными физико-химическими параметрами и т. п. Методы молекулярной механики (ММ) используют законы классической физики для предсказания структуры и свойств молекул. Существует множество методов ММ, каждый из которых характеризуется определенным силовым полем (force field). Последнее складывается из: 1. набора уравнений, определяющих, каким образом изменяется потенциальная энергия молекулы с изменением положений составляющих ее атомов; 2. набора типов атомов (в т. ч. атомов элементов в различных валентных состояниях) ; 3. одного или более параметрических наборов, приводящих первые два набора к значениям экспериментальных данных. ММ вычисления не учитывают присутствие электронов в молекулярных системах; влияние электронов на расчитываемые свойства добавляется в силовые поля путем параметризации. Все это делает ММ вычисления нетребовательными к ресурсам вычислительной техники и крайне быстрыми, что позволяет использовать эти методы для расчетов очень больших систем, содержащих сотни и тысячи атомов. Однако, это также накладывает ряд ограничений в использовании: 1. каждое силовое поле дает хорошие результаты только для ограниченного круга структур (классов веществ), причем лучшие результаты получаются для тех классов, по которым данное силовое поле было параметризовано. Как следствие, ни одно силовое поле нельзя использовать для любых возможных молекулярных структур; 2. отсутствие учета корреляции электронов означает, что методами ММ нельзя решать задачи, в которых доминируют электронные эффекты. Например, методами ММ невозможно расчитать процессы, включающие образование или разрыв связи.
Квантовомеханические методы, напротив, используют законы квантовой механики, а не классической физики в качестве основы для вычислений, т. е. в ходе расчетов решается уравнение Шредингера. Однако, как известно, точное решение этого уравнения возможно лишь для самых малых систем, поэтому в любом квантовомеха-ническом методе используется определенный набор ограничений и упрощений. Эти методы можно разделить на два вида: 1. Полуэмпирические методы, такие как AMI, MINDO/3, РМЗ, которые используют параметры, полученные из экспериментальных данных для упрощения вычислений. В этих методах решается упрощенная форма уравнения Шредин-гера, причем эти упрощения основываются на ряде параметров, полученных экспериментально; 2. Ab initio методы, в отличие от ММ или полуэмпирических, не используют никакие экспериментальные параметры в ходе вычислений. Вместо этого, их вычисления базируются исключительно на законах квантовой механики и на небольшом числе физических констант (скорость света, масса и заряд электрона и нуклонов, константа Планка). В ab initio методах используются приближения исключительно математического характера.
Третий класс квантово-механических методов — DFT (от Density Funtional Theory). Этот метод схож с ab initio, однако менее затратен с точки зрения компьютерных ресурсов. В DFT методах учитываются эффекты электронной корреляции, что в сравнении с простейшим методом ab initio вычислений (метод Хартри-Фока, HF), не учитывающим корреляцию электронов, зачастую может давать гораздо лучшие результаты.
Все ab initio вычисления определяются комбинацией теоретического метода и базиса. Третий компонент большинства ab initio вычислений определяет поведение электронных спинов. Вычисления закрытой (ограниченной) оболочки предполагают четное число электронов в системе, представленных в виде пар электронов с противоположными спинами. В системах с открытой (неограниченной) оболочкой допускается присутствие нечетного количества электронов, либо наличие пар электронов с одинаковыми спинами. В первом случае на каждой орбитали предполагается наличие пары электронов, тогда как во второй модели для каждого электрона в паре задается своя орбиталь. Этим моделям соответствуют термины UHF и RHF для вычислений методом Хартри-Фока (HF) открытой и закрытой оболочек соответственно. Вычисления типа UHF необходимы для расчета свойств ионов, возбужденных состояний, процесса диссоциации связей и т. п. Для нейтральных молекул в основном невозбужденном состоянии UHF чаще всего не дает никаких преимуществ по сравнению cRHF.
Изучение стадии восстановления защищенных дикарбоновых аминокислот
Восстановление защищенных о;-аминокислот до соответствующих /3-аминоспиртов является ключевой стадией в синтезе многих аналогов биологически активных пептидов, в частности ингибиторов каспаз [71] и катепсинов [72], для получения аналогов пептидов с простыми эфирными связями [73, 74], конструирования нейропро-текторов [75]. Из /5-аминоспиртов также получают важные в химическом отношении синтоны: а, У-диаминодикарбоновые кислоты [76], 3-(8)-амино-7-бутиролактон [77], (3)-7-фторлейцин [78], различные / -аминокислоты через /?-иодамины [79]. Дополнительную функциональность этим синтонам можно сообщить за счет добавления к имеющимся амино- и спиртовой группам карбоксильной группы, что достигается селективным восстановлением дикарбоновых аминокислот. Такие трифункциональ-ные оптически активные синтоны находят применение не только в синтезе аналогов пептидов, но и как спиртовые компоненты для реакции конденсации по Мицуно-бу с целью получения мономеров отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот (03 ПНК) [80, 81].
Стандартный способ селективного восстановления «-карбоксильной группы до спиртовой действием 1 М раствора борана в THF (Схема 1) позволяет получать такие соединения, однако невысокий выход (не более 50%), необходимость осуществления реакции при —78С, токсичность и высокая стоимость используемого реагента заставили нас искать более дешевый и воспроизводимый способ синтеза /?-аминоспиртов 3 из производных дикарбоновых аминокислот 1.
В качестве дешевого селективного восстановителя, способного превратить карбоксильную группу в спиртовую, часто используют боргидрид натрия или лития, растворенный в воде или водно-спиртовой среде, поскольку в ходе гидролиза боргидрид-иона образуется комплекс борана с водой, аналогичный комплексу борана с молекулой THF [82]. Однако действие NaBHU в условиях реакции восстановления на N-ацилированные аминокислоты приводит к расщеплению амидной связи [83]. Поэтому карбоксильную группу активируют, превращая ее в сложный эфир, либо смешанный ангидрид. В первом случае используются циануроновые [84], сукцинимидные [75, 76] и даже метиловые эфиры [76], восстанавливаемые боргидридами натрия или лития. Во втором случае аминокислоты превращают в смешанные ангидриды с этиловым или изо-бутиловым эфиром угольной кислоты, используя для этого этил- или изо-бутилхлорформиат (ECF и IBCF соответственно). Таким образом, одностадийная в случае восстановления комплексом борана в THF реакция превращается в двух-стадийную: на первой стадии получают активированное производное защищенной аминокислоты 2, которое in situ восстанавливают раствором боргидрида натрия.
Все известные методики восстановления а-карбоксильной группы в защищенных аминокислотах до спиртовой основываются на двух работах [73, 85] и являются их незначительными модификациями (Табл. 5). Согласно этим работам, стадию образования смешанного ангидрида необходимо осуществлять прибавлением к охлажденному раствору аминокислоты в DME или THF третичного основания (NMM или TEA) с последующим добавлением хлорангидрида моноэфира угольной кислоты (IBCF или ECF).
В ходе настоящей работы для препаративного синтеза соединения За из 7-бензилового эфира iV-Boc-L-глутаминовой кислоты (1а) были опробованы различные комбинации третичных оснований (TEA и NMM) и растворителей (THF и DME) с использованием IBCF в качестве активирующего агента. Во всех случаях образовывался липкий осадок соли 4а, препятствующий перемешиванию реакционной массы. Из литературы следовало, что наибольшие выходы при восстановлении защищенных дикарбоновых аминокислот наблюдали в случае использования DME в качестве растворителя и NMM в качестве третичного основания, поэтому все дальнейшие эксперименты мы проводили с использованием именно этих веществ. Известно, что в ходе образования смешанного ангидрида необходимо поддерживать постоянный избыток IBCF по отношению к аминокислоте с целью подавления побочного процесса — образования симметричного ангидрида аминокислоты [87]. Поэтому нами было предложено изменить порядок добавления реагентов, а именно: к охлажденному раствору IBCF в THF добавлять одновременно и с одинаковой скоростью эквимолярные растворы аминокислоты и третичного основания.
В ходе исследования стадии восстановления гп situ полученного интермедиата 2 мы обнаружили, что оптимальным является трехкратный избыток восстановителя. Важен также порядок прибавления: к охлажденному раствору смешанного ангид Таблица 5: Сводная таблица методик восстановления смешанных ангидридов защищенных аминокислот водным раствором боргидрида натрия.
Нами было установлено, что флеш-хроматография растворенного в этилацетате продукта через слой окиси алюминия освобождает его от примесей, являющихся, вероятно, органическими соединениями бора. Без этого этапа очистки соединения За и Зс не вступали в дальнейшие реакции конденсации по Мицунобу.
Полученные таким образом соединения За-с были охарактеризованы с помощью -ЯМР-спектроскопии. Степень чистоты подтверждали данными элементного ана лиза, а энантиомерную чистоту проверяли по значениям удельных углов оптического вращения, которые были аналогичны описанным в литературе.
Таким образом, в ходе работы была проведена оптимизация реакции восстановления а-карбоксильной группы защищенных производных дикарбоновых аминокислот 1 на следующих этапах: (1) стадии получения смешанного ангидрида с моноэфиром угольной кислоты, (2) стадии восстановления in situ этого интермедиата и (3) стадии очистки полученных /3-аминоспиртов от примесей, препятствующих протеканию последующей конденсации в условиях реакции Мицунобу. Следует: (1) одновременно прибавлять два раствора (NMM и защищенной аминокислоты) к охлажденному раствору IBCF; (2) к отфильтрованному от гидрохлорида iV-метилморфолина и охлажденному раствору смешанного ангидрида следует в несколько приемов добавлять свежеприготовленный раствор NaBELi в водно-метанольной смеси; (3) обезвоженный этилацетатный слой, содержащий продукт восстановления, следует пропускать через окись алюминия.
Синтезированные приведенным способом /3-аминоспирты За и Зс были использованы для получения защищенных псевдопептидов BocGlu(7-OBzl)-lP-GlyOAll (6) и CbzGlu(7-OtBu)- (Ns)-His(Ns)OMe(12).
Синтез псевдопептида Glu-^-Gly
Бензиловый эфир 4-[ІУ-(гарет-бутилоксикарбониламино)]-5-[ІУ7-(орто нитробензолсульфонил)-а-аллилглициноат]валерьяновой кислоты, BocGlu(7-OBzl)\I (Ns)-GryOAll (5). К охлажденному до 0С раствору- 1.6 г а-аллилового эфира N-(орто-нитробензолсульфонил)глицина (4) (5.3 ммоль), 1.44 г соединения (За) (4.4 ммоль) и 1.40 г PPh3 (5.3 ммоль) в 20 мл свежеперегнашюго THF добавляли по каплям в атмосфере аргона 2.32 г DEAD (40%-ный раствор в толуоле) (2.42 мл, 5.3 ммоль) в течение 15 мин. Через 1 ч температуру доводили до комнатной и реакционную массу перемешивали без аргона в течение 12 ч. Растворитель удаляли, полученное масло сушили в вакууме масляного насоса, затем добавляли 20 мл абсолютного диэтилового эфира и выдерживали 12 ч при 4С. Выпавший трифенилфосфиноксид отфильтровывали. Растворитель удаляли, вещество сушили в вакууме масляного насоса. Полученное масло хроматографиро-вали на колонке (30 х 500 мм) в системе растворителей гексан — этилацетат, 1:1. Растворитель удаляли, вещество в виде масла сушили в вакууме масляного насоса. Выход 2.18 г (65%), R/ 0.80 (гексан — диэтиловый эфир, 1 : 1), [а] —17.30 (с = 1, метанол). -ЯМР-спектр (CDC13): 8.07 (1Н, d, J 7.85 Гц, -CH-C-S, Ns), 7.85 (ЗН, m, Ns), 7.35 (5Н, m, Ph), 6.70 (1H, d, J 9.30 Гц, NHBoc), 5.78 (1H, m, CH, All), 5.25 (1H, dd, Jx 1.0 Гц, J2 17.20 Гц, =CH2, All), 5.15 (1H, dd, Ji 1.0 Гц, J2 10.5 Гц, =CH2, All), 5.12 (2H, s, CH2-Ph), 4.48 (2H, d, J 5.63 Гц, -0-CH2, All), 4.27 (Ш, m, a-CH, Glu), 4.05 (2H, s, CH2, Gly), 3.45 (2H, m, CH2-N, Glu), 2.35 (2H, m, 7-CH2), 1.78 (1H, m, /?-CH2), 1.55 (1H, m, /?-CH2), 1.35 (9H, s, 4Ви). 13С-ЯМР-спектр (50.32 МГц, CDC13): 172.86, 168.31, 155.94, 147.94, 135.82, 133.63, 133.26, 131.74, 131.29, 130.71, 128.58, 128.25, 124.17, 118.99, 79.76, 66.44, 65.99, 51.79, 47.63, 30.76, 28.30, 27.59. Найдено, %: С 55.58, Н 6.03, S 4.92; N 6.39. CsgHssSxNaOio. Вычислено, %: С 55.53; Н 5.82; S 5.29; N 6.94.
Бензиловий эфир 4-[ІУ-(трет-бутилоксикарбонил)амино]-5-[ІУ-а-аллилглициноат]валерьяновой кислоты, BocGlu(7-OBzl)-\I/-GlyOAll (6). К раствору 5.0 г соединения 5 (8.0 ммоль) в 80 мл ацетонитрила при интенсивном перемешивании и охлаждении до 0С добавляли 2.2 г карбоната калия (15.9 ммоль) и 5.25 г тиофенола (4.90 мл, 47.8 ммоль). Через 20 мин охлаждение убирали и перемешивали при комнатной температуре 6 ч. Растворитель удаляли. Остаток растворяли в 40 мл диэтилового эфира и промывали 20%-ным раствором лимонной кислоты (3 х 10 мл). Водный слой промывали диэтиловым эфиром (2 х 10 мл), доводили до рН 6 добавлением твердого карбоната калия (происходило бурное выделение газа) и экстрагировали хлористым метиленом (5 х 20 мл). Органическую фазу сушили Na2S04, растворитель удаляли. Полученное масло хроматографировали на колонке (30 х 350 мм) в системе гексан — этилацетат, 4 : 6. Растворитель удаляли, полученное масло сушили в вакууме масляного насоса и сразу использовали на следующей стадии. Выход 2.24 г (67%), Rj 0.31 (гексан — этилацетат, 1:1). а-Аллиловый, 7"бензиловый диэфир іУ-(трега-бутилоксикарбонил)-І/-глутаминовой кислоты, BocGlu(7-OBzl)OAll (7). К раствору 83.3 г 7-бензилового эфира Лг-(трет-бутилоксикарбонил)-1г-глутаминовой кислоты (1а) (247.18 ммоль) в 830 мл свежеперегнанного DMF добавляли 80.5 г Cs2C03 (247.18 ммоль) . Реакционную смесь перемешивали 20 мин, после чего добавляли 60.5 г бромистого аллила (43.03 мл, 494.36 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре 30 мин, фильтровали от солей, удаляли растворитель. Оста ток растворяли в 300 мл этилацетата и промывали насыщенным раствором NaHCC 3 (1 х 200 мл). Водную фазу экстрагировали этилацетатом (2 х 200 мл). Органические слои объединяли и сушили Na2S04. После удаления растворителя полученное желтое масло переупаривали 2 раза с абсолютным диэтиловым эфиром до кристаллизации. Вещество сушили в вакууме масляного насоса. Выход 64.6 г (72%), Rj 0.26 (гексан — диэтиловый эфир, 7 : 3), Тпл 55-57С, [а\$ +7.4 (с = 1, метанол; лит. [а\$ +7.4 [1]). -ЯМР-спектр (CDC13): 7.35 (5Н, m, Ph), 5.89 (1Н, т, СН, АН), 5.45 (Ш, s, NHBoc), 5.26 (1Н, dd, Ji 1.1 Гц, J2 17.3 Гц, =CH2, All), 5.18 (Ш, dd, Ji 1.1 Гц, J2 10.5 Гц, =CH2, All), 5.10 (2H, s, CH2-Ph), 4.58 (2H, d, J 5.40 Гц, -0-CH2, All), 4.05 (1H, m, a-CH), 2.43 (2H, m, 7-CH2), 2.00 (1H, m, /3-CH2), 1.85 (1H, m, /?-CH2), 1.36 (9H, s, Ви).
Трифторацетат а-аллилового, 7-бензилового диэфира Х-глутаминовой кислоты, TFA-HGlu(7-OBzl)OAH (8). К раствору 68.3 г а-ал лилового, -у-бензилового диэфира ІУ-трет-бутилоксикарбонил-і глутаминовой кислоты (7) (194.6 ммоль) в 370 мл хлористого метилена, охлажденному до 0С, прибавляли 187 мл трифторуксусной кислоты. Через 1.5 ч растворитель удаляли, остаток переупаривали из толуола (3 х 90 мл) и абсолютного диэтилового эфира (3 х 90 мл). Вещество сушили в вакууме масляного насоса. Образовавшиеся кристаллы затирали из абсолютного диэтилового эфира, фильтровали и сушили в вакууме масляного насоса. Выход 85 г (количественный); Rf 0.80 (изопропанол — водный аммиак (25%), 9 : 1). № -7.5 (с = 1, метанол). Тпл 89-9ГС. -ЯМР-спектр (CDC13): 8.41 (ЗН, s, NHJ), 7.35 (5Н, m, Ph), 5.82 (Ш, га, СН, АН), 5.35 (1Н, dd, Jx 1.1 Гц, J2 16.9 Гц, =СН2, All), 5.25 (Ш, dd, Jx 1.1 Гц, J2 10.2 Гц, =СН2, All), 5.12 (2Н, s, CH2-Ph), 4.66 (2Н, d, J 5.41 Гц, -0-СН2, АН), 4.10 (Ш, т, а-СН), 2.58 (2Н, т, 7-СН2), 2.16 (2Н, т, /3-СН2). а-Аллиловый, 7-бензиловый диэфир ІУ-(оршо-нитробензолсульфонил)-Іг-глутаминовой кислоты, Ns-Glu(7-OBzl)OAH (9). К охлажденному до 0С раствору 66 г трифторацетата а-аллилового, 7-бензилового диэфира L-глутаминовой кислоты (8) (167.94 ммоль) и 36 г триэтиламина (49 мл, 352.94 ммоль) в 660 мл хлористого метилена добавляли порциями 41 г орто-нитробензолсульфонилхлорида (185 ммоль). Через 20 мин реакционную массу нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 ч. Растворитель удаляли, полученное масло растворяли в 100 мл воды и экстрагировали этилацетатом (2 х 50 мл). Органическую фазу последовательно промывали 1 М раствором НС1 (2 х 10 мл), насыщенным раствором NaCl (2 х 10 мл), насыщенным раствором NaHC03 (2 х 10 мл), насыщенным раствором NaCl (2 х 10 мл). Органическую фазу сушили NaoSO Растворитель удаляли. Продукт в виде масла выделяли с помощью колоночной хроматографии (60 х 500 мм), элюируя системой растворителей гексан — этил ацетат, 1:1. Растворитель удаляли, вещество в виде масла сушили в вакууме масляного насоса. Выход 58.4 г (75%), Rf 0.29 (гексан,— диэтиловый эфир, 1 : 1), [а]р +56.5 (с = 1, метанол). 1Н-ЯМР-спектр (CDC13): 8.05 (1Н, d, J 9.1 Гц, CH-C-S, Ns ), 7.92 (1Н, d, J 9.3 Гц, CH-C-N, Ns ), 7.70 (2H, m, -CH-CH-, Ns ), 7.35 (5H, m, Ph ), 6.21 (1H, d, J 8.9 Гц, NH ), 5.65 (1H, m, CH, All), 5.19 (1H, dd, Л 1.0 Гц, J2 17.2 Гц, -CH2, All), 5.11 (2H, s, CH2-Ph ), 5.10 (1H, dd, Jx 1.0 Гц, J2 9.2 Гц, =CH2, All ), 4.30 (2H, d, J 5.36 Гц, -0-CH2, All ), 4.30 (Ш; m, a-CH ), 2.60 (2H, m, 7-CH2), 2.25 (1H, m, /?-CH2), 2.03 (1H, m, /3-CH2). a-Аллиловый, 7-бензиловый диэфир і\Г-2-(трет-бутилоксикарбонил-аминоэтил)-.Е-глутаминовой кислоты, BocGly-\l/(Ns)-Glu(7-OBzl)OAll (11).
К охлажденному до 0С раствору 3 г а-аллилового, 7"бензилового диэфира N-(ортсънитробензолсульфонил)--глутаминовой кислоты (9) (6.71 ммоль), 1.62 г Вос-этаноламина (Ю) (10.07 ммоль) и 2.64 г трифенилфосфипа (10.07 ммоль) в 250 мл свежеперегнанного THF, добавляли по каплям в атмосфере аргона 1.75 г DEAD (40%-ный раствор в толуоле) (4.15 мл, 10.67 ммоль) в течение 30 мин. Через 2 ч температуру доводили до комнатной и реакционную массу перемешивали без аргона в течение 12 ч. Растворитель удаляли, полученное масло сушили в вакууме масляного насоса, затем добавляли 50 мл абсолютного диэтилового эфира, 50 мл гексана и выдерживали 48 ч при 4С. Выпавший трифенилфосфиноксид отфильтровывали. Растворители удаляли, вещество сушили в вакууме масляного насоса. Полученное масло хроматографировали на колонке (20 х 600 мм), используя хлористый метилен в качестве элюента. Растворитель удаляли, вещество в виде масла сушили в вакууме масляного насоса.
