Содержание к диссертации
Введение
1. Методы химического синтеза аналогов модифицированных по межнуклеотидным фосфатным группам 9
1.1. Введение . 9
1.2. Тиофосфатные аналоги НК. 12
1.2.1. Синтез 5'-фосфотиоэфирных(5'1^) аналогов Ж 12
1.2.2. Синтез фосфотионатных аналогов НК 15
1.3. Фосфамидные аналоги НК ,17
1.3.1. Синтез 5'-фосфамидных(5'Рм) аналогов НК 17
1.3.2. Синтез зЦ^сфамидных(3'Рм) аналогов НК 19
1.3.3. Синтез амидофосфатных аналогов НК 20
1.4. Фосфонатные аналоги НК 23
1.4.1.Синтез 3- и 5^-фосфонатных(з5Рси 5І?0) аналогов НК 23
1.4.2. Синтез бЇЕ-фосфонатннхСЙР^) аналогов НК 24
1.4.3. Синтез 5І-0-метилфосфонатннх(5Ї>0+) аналогов НК 24
1.4.4. Синтез фосфонометильных(Рс) аналогов НК 25
1.5. Синтез фосфотриэфирных(Р^) аналогов НК 27
1.6. Синтез фосфитных(Ри) аналогов НК 31
2. Результаты и обсуждение результатов 32
2.1. Исследование кинетики реакции алкилирования 32
2.1.1. Определение порядка реакции алкилирования 33
2.1.2. Зависимость констант скорости реакции алкилирования от различных факторов 39
2.1.2.1. Зависимость реакции алкилирования от природы противокатионов реагентов 39
2.1.2.2. Зависимость к-j- реакции алкилирования от концентрации воды в реакционной смеси 40
2.1.2.3.Зависимость Kj реакции алкилирования01 добавок солей.41
2.1.2.4. Зависимость Kj реакции алкилирования от рН 43
2.1.2.5.Зависимость Kj реакции алкилирования от температуры.45
2.1.3. Рекомендации для синтеза 5Р^-аналогов НК 45
2.2. Синтез электронейтральных мономеров INpgR 48
2.2.1. Выбор структуры и метода синтеза мономеров 48
2.2.2. Синтез алкилирущего реагента (R+Br)I 48
2.2.3. Синтез алкилтиофосфатов NpsR 51
2.2.4. Реакция иодирования NpsR 54
2.2.5. Синтез ГГр^реакциеЙ переалкилирования ITp$CNEt 56
2.3. Исследование кинетики реакции Щр5К*сTpg в ]Щк 65
2.4. Синтез 5Р$-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов 67
2.4.1. Синтез 5'Pg-aHsuioraT4sT)5()
2.4.2. Синтез5'Рз-аналога гексадекадезоксирибонуклеотида(ХШ. 71
3. Экспериментальная часть 77
3.1. Исходные материалы 77
3.2. Основные методы работы 77
3.3. Методики синтеза 77
3.3.1.Синтез 2-бром-^-(п-диэтилметиламино)фенил]пропионамида иодида (К*Ьґ)І~ 78
3.3.2. Синтез мономеров INpgR 79
3.3.3. Синтез 1Тр5К*из ITpgCN Et реакцией переалкилирования 80
3.3.4. Синтез 5'Р5-аналогов (ХХШ) и (XXIV) 80
3.4. Методики кинетических измерений 84
3.5. Реакция циклизации мономеров INpsR 86
Выводы 87
- Тиофосфатные аналоги НК.
- Фосфонатные аналоги НК
- Синтез электронейтральных мономеров INpgR
- Синтез5'Рз-аналога гексадекадезоксирибонуклеотида(ХШ.
Введение к работе
Быстрое развитие исследований в области молекулярной биологии и генной инженерии стимулирует не только разработку новых методов синтеза олигонуклеотидов[1,2], но и их разнообразных аналогов [3-5]. Интерес к таким соединениям обусловлен наличием у них специфических физико-химических и биологичесг-ких свойств, отсутствуюпщх у природных НК. Основными областями применения таких соединений являются физико-химические исследования, направленные на изучение структуры и функций НК [ЗІ, а также исследования, связанные с изучением молекулярных механизмов действия и субстратной специфичности ферментов метаболизма НК&,5]. Некоторые аналоги НК проявляют противовирусную активность [6,7].
Одними из наиболее перспективных соединений этого типа являются 5^-фосфотиоэфирные аналоги НК, содержащие неприрод-ные Р-Я-ССб'Э-межнуклеотидкые связи Ш-10]. Замена 0(5)-атомов на атомы серы приводит к некоторому удлинению межнуклеотид-ной связи в таких производных НК, изменению ее геометрии [II], [12] и появлению новых свойств. Так, они проявляют большую устойчивость к ферментативному гидролизу по сравнению с природными прототипами [10,13], но легко расщепляются окислителями [143. Вторичная структура таких аналогов похожа на структуру Ж, они образуют комплементарные комплексы с полинуклеоти-дами[9,141. Рассматриваемые аналоги являются субстратами ряда ферментов метаболизма НК, таких,как ДНК-полимераза IE.coli [І5І, полинуклеотидлигаза и полинуклеотидкиназа фага Т4 [Е6],
а также различных нуклеаз[10,13]. Дальнейший прогресс в этой
исследований области связан с распіирениешфизико-химических и субстратных
свойств таких производных НК с целью выявления перспектив их
практического применения. Для обеспечения таких исследований
разнообразными по длине и составу 5'Р$-аналогами НК необходим эффективный и быстрый метод их синтеза. Известные методы не обеспечивали решение этой задачи.Они немногочисленны 19,10,1 однотипны и основаны на использовании высокой нуклеофильности тиофосфата[18] и его производных. Ключевой стадией в этих способах является реакция алкилирования Ps -компонента( на первой стадии Nps ) 5-активированными нуклеотидными мономерами, например, 5^-0-тозил-[9]или 5-дезокси-5-иоднуклеозид-3^0-(5 --Р-цианэтил)тиофосфатами[19,20] в ДШ. или смесях его с водой. Ранее нами было показано, что наибольшая скорость реакции алкилирования достигается при применении І.і*-солей Nps и иод-мономеров lNp$CNEt[20-22]. Но скорость реакции и в этом случае была невысокой, уменьшаясь значительно к тому же на конечных стадиях синтеза при увеличении длины и отрицательного заряда Ps -компонента. Например, длительность реакции алкилирования на первой стадии синтеза 5Р5-аналога нонатимидилата составляла 1ч , а на восьмой - 20ч. Увеличение длины Ps-компонента сопровождается рвзвш ухудшением растворшоогс его U-оолел в ДША, вследствие чего реакция большую часть времени протекает в гетерофазном режиме, что также приводит к значительному уменьшению ее скорости[.21]. Перечисленные недостатки ограничивают сферу применения метода [21] , наиболее эффективного . из известных, синтезом сравнительно коротких 5'РБ-аналогов НК.
Таким образом, разработка усовершенствованного метода синтеза ЗІ^-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов, отличающегося от известных способов большей скоростью и эффективностью, являлась весьма актуальной задачей. Ее решение затруднялось практически полным отсутствием данных о механизме реакции алкилирования, лежащей в его основе.
Основными вопросами, решению которых посвящена данная ра-
бота, являются следующие. Во-первых * проведено систематическое исследование кинетики реакции алкилирования на примере взаимодействия Tps с иодпроизводными1Тр5СМЕ1 и IT в ]Щк с целью выяснения ее механизма и поиска путей увеличения ее скорости. Во-вторых, определена зависимость реакционной способности иодпроизводных в данной реакции от их строения, в частности, от их заряда, a 1-компонента - от типа соли. На основе найденных закономерностей выбрана структура иодмономеров и тип соли Ps-компонента, обеспечивающие повышение скорости реакции алкилирования, и разработан метод синтеза таких моно-ров. В-третьих, проведено исследование кинетики реакции полученных мономеров с Tps в ДОА.
В результате решения указанных задач разработан усовершенствованный метод синтеза 5 Ps -аналогов олигодезоксирибо-нуклеотидов, ключевой стадией которого является реакция алкилирования ВьцЛ/ -солей Nps новыми мономерами - 2',5-дидезок-си-5-иоднуклеозид-3^042 -Р-[М -(п-диэтилметиламино)фенил]кар-бамоилэтил]тиофосфатами, представляющими собой электронейтральные внутренние соли, в безводном ДШ?А. Средние затраты времени на проведение одной стадии синтеза снижены в 10 раз, в том числе на проведение реакции алкилирования - в 100 раз,по сравнению с известным методом [21] . Достигнута независимость скорости реакции алкилирования от длины и заряда Ps -компонента. Эффективность метода продемонстрирована-на примере синтеза Sfs-аналогов гексатимидилата и гексадекадезоксирибонуклеотида. Структура последнего соответствует одному из фрагментов гена гормона человека ангиотензина I. Доступность 5 Р5-аналогов такой длины позволила существенно расширить, исследование их биохимических свойств, в частности, провести изучение их матричных свойств в системе ДНК-полимеразы I E.coli [15].
Тиофосфатные аналоги НК.
Первоначально интерес к -аналогам НК также как и к 5 PN -аналогам, был вызван не столько возможностью их использования для исследования ферментов обмена НК, сколько стремлением разработать эффективный и быстрый метод синтеза заменителей олигонуклеотидов, альтернативный распространенному в начале 70-х годов диэфирному методу[27,291. Но второй аспект быстро утратил свою актуальность в связи с появлением эффективных триэфирного и фосфитного методов синтеза олигонуклеотидов, и вследствие выявления существенных отличий физико-химических и биохимических свойств таких аналогов от природных прототипов [12,15,16] . Первый представитель 5 Р5-аналогов был синтезирован в 1962 г. Микельсоном [8], путем полимеризации 5-дезокси-5-мерка-птоуридин-2 ,3-циклофосфата ( схема 4): Схема 4. В дальнейшем этот метод не применялся ввиду труднодоступности меркаптонуклеозидов и низкого выхода продукта реакции. Более эффективным и селективным оказался другой подход к синтезу таких соединений, основанный на высокой нуклеофильности тиофосфата \18] . Почти одновременно Кук [10] и Нэгивари с сотр. [8,14] синтезировали в 1970г. 5 Р5-аналоги НК при помощи реакции алкилирования N p$ 5-активированными производными нуклеози-дов и нуклеотидов(І). Кук применил для этой цели 5-иод-, а Нэгивари с сотр. - 5 -0-тозильные производные (схема 5): обойтись без повышенной температуры и добавления воды, существенно уменьшающей скорость реакции алкилирования [14]. Достоинством метода [141 является возможность продолжения синтеза путем удаления цианэтильной защитной группы после обработки продукта (II) щелочью ш последующей реакции с новым мономером (I). Выход полученного таким образом аналога T-sA-jT составил только 10$. Одной из причин такого низкого выхода было отсутствие защитной группы на атоме серы в мономерах (I), что приводило к побочной реакции циклизации их в вдклотиоосфаты р5[121. Поэтому позднее эти же авторы применили более стабильные моно-меры(Ш), в которых атом серы защищен цианэтильной защитной грушюй( схема 6): При помощи таких мономеров был получен 5 Ps -аналог пентатими-дилата со средним выходом на стадию 30%. Низкий выход продукта был получен из-за неполного протекания реакции алкилирования и сильной деградации продуктов при их очистке ионообменной хроматографией на промежуточных стадиях. Пуринсодержащие производные получаются этим методом с еще более низким выходом.
Таким образом, несмотря на ряд несомненных достоинств метода Нэгивари с сотр.(высокая селективность реакции алкилирования, необязательность защиты ОН Н и Р-групп, отсутствие конденсирующих реагентов и слабая чувствительность к небольшим количествам влаги), данной группе исследователей не удалось разработать эффективный общий метод синтеза 5-аналогов Ж. Основной причиной этого были неудачный выбор тозильной группы в качестве уходящей в мономерах (I) и (III) ж отсутствие данных о механизме реакции алкилирования. Выход Р8-аналога (v) составил 18$, а побочно образующегося Т-Т - 33#[ЗЇ]. Такой низкий выход целевого продукта Экштейн объяснил двойственной природой тиофосфатной группы [33] , способной атаковать ТР как В - , так и 0-атомом. Нужный продукт при этом образуется только во втором случае, а в первом случае образующийся смешанный ангидрид распадается с отщеплением атома серы от тиофосфата. Ps-аналоги три- и дшуклеотидов были получены этим методом со средним выходом на стадию 40-60$. Позднее Бюргере и Экштейн[37] получили $ -аналог Ktf-A) аналогичным методом, разделив стереоизомеры на уровне триэфира. Недостатком этого метода является лабильность пианэтильной грушш в процессе синтеза и хроматографии, а также значительная десульфуризапия продукта на стадии удаления пианэтильной защитной грушш вследствие прямой атаки Н0 -аниона на атом фосфора. Более удачными в этом смысле являются методы синтеза Р$ -аналогов НК, основанные на введении атома серы( а также и селена [23]) в готовые фосфитные или фосфоанилидные производные олигонуклеотидов. В первом случае это достигается окислением фосфиттриэфирных групп серой в пиридине [_38,39, 2 (схема 10 Позднее такой же аналог был получен Летсингером и Мунгалом 44] аналогичным методом, но с другим набором защитных групп. Выход деблокированного продукта составил 70$. При этом длительность стадии фосфорилирования составляла 48ч, а стадии конденсации -30 мин., что свидетельствовало о высокой селективности метода вследствие гораздо большей нуклеофильности аминогрупп по сравнению с оксигруппами. Поэтому отпадает небходимость защиты 2(0Н-групп в аминокомпоненте. Выхода-аналога дитимидилата составил 61-66$, тритимидилата -48$.
Механизм реакции фосфитазидного сочетания, по данным авторов, заключается в промежуточном образовании дйэфирного фосфитимина с элиминацией молекулы азота и последующим превращением его в фосфамид по механизму, аналогичному перегруппировке Арбузова [33]. Добавление LiXI ускоряет отщепление этокси-грушш из промежуточного фосфитимина и подавляет побочные реакции. Преимуществами метода авторы считают его селективность, отсутствие конденсирующих агентов, возможность проведения синтеза без применения защитных групп для амино- и оксифункций и высокую скорость реакции. 1.3.2. Синтез Зч?юсФамидных(3 Р аналогов НК. Исследования в этой области были начаты сравнительно недавно. В 1978 г. Ажаев с сотр. синтезировали первые представители 3-аналогов НК[48,49] . Для образования фосфамидной связи авторы применили реакцию переамидирования рибонуклеозид-бЦюсфоимидазолидов j З -аминонуклеозидами в ДША. (схема 17): Удобный метод активации Р-компонента предложили недавно Шабарова с сотр. [52]. Дяя этой цели они применили превращение нуклеотидов в смешанные ангидриды с мезитиленкарбоновой кислотой. Реакцией таких ангидридов с З-дезокси-3-аминонуклеозидом в водной среде в присутствии N чиетилимидазола были получены З Р -аналоги динуклеозидмонофосфатов с выходом 82-95$. 1.3.3.Синтез амидо$осФатных(Р\?) аналогов Ж. Первоначально интерес к аналогам этой группы был вызван стремлением получить соединения, моделирующие взаимодействия НК - белок. С этой целью Шабарова с сотр. в 1966 г. синтезировали аминокислотные и пептидные производные олигонуклеотидов, содержащие связь между о А/Н -группами аминокислот и Р-атомом межнуклеотидного фосфата [53,54] (схема 19): Достоинством этого метода является возможность проведения активирования фосфатных групп в мягких условиях без защиты Шг -и ОН-групп олигонуклеотидов. Позднее эти же авторы показали, что реакция образования смешанного ангидрида (VII ) проходит не за 2ч , как полагали ранее[53,54] , а практически мгновенно( менее 2 мин.) [55]. Обработка такого ангидрида избытком диаминов дает P/v-аналоги НК, содержащие свободные аминогруппы с выходом 50-60$. Такие соединения могут быть использованы для введения фотоаффинных груш или для иммобилизации олигонуклеотидов на полимере. Юодка и Смрт получили ряд Р -аналогов олигонуклеотидов, применив для активации последних более активный реагент - бис-(п-нитрофенил)хлорфосфат [56]. Аналогичный метод был применен также Томашем и Симонсит-сом[57] для синтеза дитимидинмонофосфамида. Соответствующий аналог r(U-U) в этих условиях не образовывался, что авторы объяснили влиянием цис-2 0Н-грушш. Аналогичный эффект наблюдали и Шабарова с сотр. [55v58].
Фосфонатные аналоги НК
Как уже отмечалось во введении, соединения этой группы обычно получают при помощи методов олигонуклеотидного синтеза. В этом случае замену атомов 0(5 или З ) на группу СН2 проводят в мономере и используют далее модифицированный Р-компонент в реакции конденсации. Джонс и др. [64] получили 2(РС и 5ІРс-аналоги олигонуклеоти- дов при помощи диэфирного метода (схема 24): Схема 24. Выход аналогов достигал 50-78$. 1.4.2.Синтез Sfe-ФооФонатных ( fa) аналогов НК. Впервые ЙР -аналоги НК были получены Голы с сотр. [65] для исследования влияния строения олигонуклеотида на его матричную активность. Синтез проводили диэфирным методом(схема 25): Схема 25. R=-CH1OC2LH5 Раммлер с сотр. [66] получили Й -аналоги олиготимидилатов (рТ) (п=2,3) полимеризацией соответствующего аналога рТ. Такие мономеры гораздо более доступные соединения, чем ЙРс-аналоги мононуклеотидов. Общим методом их получения является реакция алкилирования триалкилфосфитов 5-дезокси-5-иоднуклеозидами с последующей перегруппировкой типа реакции Арбузова [67]. 1.4.3.Синтез 5к)-метилФосфонатных(51Рс ) аналогов НК. Аналоги этого вида были впервые получены Голы [68] с целью изучения влияния 5Ь-атома на ингибиторную активность фосфонат-ных производных Ж по отношению к 5-нуклеотидазам. Синтез проводили, используя диэфирный метод (схема 26): 1.4.4,Синтез ФосФонометильных(Р0) аналогов НК. Фосфонометилыше аналоги НК были получены в 1979 г. почти одновременно двумя группами исследователей[69,70]. Синтез был осуществлен по сходным схемам, представляющим собой различные варианты триэфирного метода. Агарвал и Рифтина [69] применили комбинированный триэфирный метод (схема 27): D, В Схема 27. Tri = -NJ J B=Thj, Ade, Cyt, G LLQ , R=Dmtr} BST -бензолсульфотетразолид Выход аналогов составил 60-70%, их диастереомеры были разделены ТСХ на силикагеле. Этим же методом, применив в качестве исходного п-хлорфениловый эфир Т-Т, те же авторы получили Рс-аналог тетратимидилата с чередующимися фосфотриэфирными и фосфономе-тильными связями. Миллер и сотр. [70) использовали для этой же цели другой вариант триэфирного метода - синтез в присутствии конденсирующего агента(схема 28): В =ТЦ, Ade.; R=Mmtr,Dmtr,- MsT-мезитшгенсульфотетразолид Как следует из схемы, в данном случае авторы применили распространенную стратегию синтеза фосфотриэфиров Катлина-Крамера-Наранга[71,72] , использовав в качестве стабильной Р-защитной группы в мономерах (XIV) вместо 0(С1РИп)»грушшровки СНд-группу.
Такая замена,как отмечают авторы, приводит к значительному уменьшению скорости и выхода реакции конденсации. Аналогичный эффект наблюдали также Крашевски и др. [73] при замене 0(CIPhn)- 0(Alk) в фосфодиэфирах. Эти данные объясняются с позиций известного механизма реакций конденсации с участием фосфодиэфиров [74] уменьшением реакционной способности промежуточно .Образующегося тетра-замещенного пирофосфата вследствие замены в нем электроноакцеп-торных заместителей CIPhn на электронодонорные CHq или AlfeO-грушш. Используя в качестве универсального блока динуклеотид (XV) и разделяя на каждой стадии диастереомеры, Миллер с сотр. І75] получили тем же методом Рс-аналоги тетра-, окта- и декатимиди-латов с чередующимися фосфонометильными и фосфотриэфирными связями. Выход аналогов составил,соответственно,65, 66-80 и 34-56$. Позднее эти же авторы получили Рс-аналоги октатимидилата:и ряда других коротких олигонуклеотидов [76). Выход -аналогов достигал 40-55$, но в случае G- -производных он; был. аномально низким (16-22$). Такой же эффект отмечали и другие исследователи при синтезе олигонуклеотидов [77] . Снижение выхода в данном случае происходит в результате побочной реакции сульфонирования 0 (6) -атома гуанина и может быть предотвращено введением дополнительной защитной группы в это положение [77] . Немер и 0гилви[23]ддя синтеза Рс-аналогов Ж использовали реакцию алкилирования фосфиттриэфирных аналогов олигонуклеотидов алкилгалогенидами (схема 29): Выход защищенного аналога (XVI) был количественным. Но в случае других олигонуклеотидов существует, на наш взгляд, опасності алкилирования их оснований. Известно, что обработка, например, аденина эквивалентом CHgl при 30 в течение 168 ч приводит к алкилированию атомов /\/9и N на 63$ (78] .
Получает распространение и твердофазный метод синтеза Рс аналогов НК. Кестер с сотр. І79] использовал для этой цели фосфи-тный метод(схема 30), а Миллер с сотр. - триэфирный метод в присутствии конденсирующего агента [80]. В первом случае выход Рс-аналогов ди-тетрануклеотидов был. 76-93$, а во втором - ок-тамеры были получены со средним выходом на стадию 82$. Схема 30. B=Thy,Ade,G-utf; ллгф- полимерный носитель 1.5. Синтез фосфотриэсвитжых(Рй) аналогов НК. Фосфотриэфирные аналоги Ж получали многие исследователи в качестве промежуточных продуктов при синтезе олигонуклеотидов триэфирным методом [24] , например, соединения ( XVI! ): (XVII) OR R =H,0H Но для физико-химических и биохимических исследований находят применение в основном наиболее простые производные, а именно, метиловые и этиловые фосфотриэфиры олигонуклеотидов5-89}. Такие PR-аналоги отличаются повышенной устойчивостью к химическому и ферментативному гидролизу, в достаточной степени раст- воряются в воде, а небольшие по размеру СНд и С -груплы вносят минимальные искажения в конформацию НК[85]. Впервые метиловые и этиловые Pft-аналоги НК были получены Миллером с сотр. [89] при помощи одного из ранних вариантов три-эфирного метода с последующим превращением р -пианэтило-вых эфиров в метиловые или этиловые производные (схема 31): ы о» п Схема 31. -он полученных этим способом, был низким.Еще более низкий выход был получен при использовании в качестве Р-компонента этилового фосфоэфира рТ(Ас)[8б1. Это побудило Миллера с сотр. отказаться от триэфирного метода при синтезе PR -аналогов НК. Неэффективность алкиловых фосфоэфиров Р-компонен-тов в реакциях конденсащи отмечалась и другими авторами[70,73] и была обсуждена нами в разделе 1.4.4. Больших успехов удалось достигнуть, применив комбинированный метод Смрта[90], в котором сочетается диэфирный метод образования межнуклеотидной связи с последующим переходом к триэ-фирному продукту в результате этерификапии межнуклеотидных фосфатных групп. По такой схеме были получены PR. -аналоги ди-тетра- нуклеотидов [91,92, 86] (схема 32):
Синтез электронейтральных мономеров INpgR
выборе структуры целевых мономеров мы взяли за основу известные аналогичные соединения - 2/,5-дидезокси-5 -иоднуклео-зид-З -О- -Л-Сл/ ,л/ -дифенил)карбшоилэтил}тиофосфата .[ПО]. .Идя нейтрализации их отрицательного заряда в состав карбамоил-этильной защитной группировки вводили четвертичную аммониевую группу. Такой подход к конструированию мономеров позволил нам осуществить их синтез при помощи известного метода ІІІ9]. В основе этого метода лежат две последовательно проводимые реакции: алкилирование исходных N p5 по 3 Ps -группе N-производными 2-бромпропионамида в ДОФА и иодирование продукта трифеноксиметил-фоефоний йодидом для замещения бЬн-группы на атом иода. Принимая во внимание вышеизложенное, нами была выбрана следующая структура и схема синтеза целевых мономеров (схема 38): Реакцию проводили в воде, используя эквивалентные соотношения реагентов и пиридин для нейтрализации выделяющейся HGI. После добавления реакционную смесь соды амид (XXII) кристаллизуется из воды. Его метилировали избытком CHgl, получая после кристаллизации из этанола целевой продукт с выходом 68$. Структуру и гомогенность (Or) Г" подтверждали данными ТСХ, УФ- и %- ЯМР-спектроскопии(табл.6, рис.6,7). Определено после удаления -защитной группы в щелочи(см. раздел 3.5). 2к. Значение Rf в системе Г. ЗЙ. Данные для (R+Br)CI Y Данные TGX свидетельствуют о высокой полярности продукта, УФ-спектр после замены противоанионов 1 — С1"ионообменной хроматографией характерен для ароматических соединений(рис.6). Отнесение сигналовв спектре %-ЯМР (К Ъг)1 было проведено на ос-вании анализа их тонкой структуры, учета дез экранирующего вли-яния функциональных груші, убывающего в ряду N Br C(0)/VH 2(33., и экспериментов по двойному резонансу (табл.7, рис.7). Эти данные в сочетании с высокой алкилирущей способностью (К+6г)1 , как будет показано ниже, подтверждают его структуру.
Определение Kj путем расчета тангенса угла наклона анаморфозы кинетической кривой(рис.8 =2,5 10 0 , tj/2=30c) показало, что она в 17 раз превышает кт реакции незаряженного аналогич-ного алкшгсромвда - 2-ором-(М ,N-дифен щюшонамцда о Tps в тех же условиях(кІ=І,4 І0""3е , tj/2=507с). Ввиду сходйости строения этих соединений большую реакционную способности R+Br) Г логично объяснить наличием у него положительного заряда. Взаимодействие Tps с (К "8г)I- включает, по-видимому, стадию образования ионной пары (Tps) ( Or) ,в пределах которой реакция алкилирования протекает как мономолекулярный процесс. Это и может быть причиной ее ускорения. Влияние заряда алкилгалогенида на скорость его реакции с Tps в да$А свидетельствует о наличии сильных электростатических взаимодействий в применяемых условиях и служит еще одним подтверждением предложенного нами механизма реакции алкилирования /і+-соли Tps. Структура продукта алкилирования TpjR4" была установлена на основании хроматографичеоких и УФ-спектральных данных (табл. 6) При ионообменной хроматографии TpsR+ не сорбируется ни катионо-, ни анионообменными смолами, что говорит о его электронейтральности. Он не восстанавливает І2 , но после обработки IM LlOH в течение 30 мин. образует Тр с количественным выходом в результате отщепления Я+-защитной группы ( Kj=2,I#I0" c , tj/2=5,5 мин.), о чем свидетельствуют данные иодометрии и ТСХ (табл.6). Препаративный синтез N psR проводили путем обработки 0,3-0,5 М растворов 1-ісолей Tps 1,2-кратным избытком (R+Br)I в «ВДФА в течение"2 мин.(табл.8). Ход реакции контролировали иодометрическим)методом и ТСХ в системе Б. Выход продуктов Np?R+, тестируемый этими методами, был близок к количественному, поэтому их без очистки использовали на следующей стадии в реакции иодирования. 2.2.4. Реакция иодирования NPsR" " . Для замещения 5Ьн-групп в NpsR+Ha атом иода мы применили метод Верхейдена-Моффата [118] , разработанный ими для иодирования нуклеозидов. Метод заключается в обработке нуклеозидов в JP A мощным иодирующим агентом - трифеноксиметилфосфоний йодидом. Ранее нами было показано, что этот метод применим и для иодирования различных производных нуклеотидов [119] , при этом не наблюдалось побочной реакции расщепления фосфодиэфирных и фосфотиоэфирных связей, характерной для активирования фос-фодиэфиров другими подобными реагентами [L2I] .
Ввиду отсутствия адекватного метода контроля хода реакции иодирования мы проводили ее строго в условиях, применяемых при синтезе известных аналогичных соединений[118,119] .Гарантией полного ее прохождения служили высокая реакционная способность иодида (XXI) [118] и тщательное высушивание реагентов и растворителя ввиду чрезвычайно высокой лабильности реагента (XXI) в водном да&А[П8]. Эффективным способом высушивания соединений NpsR оказалось упаривание их растворов в «ЩШ. с пиридином. Вместе с водой при этом удалялся и «ЩШ. в мягких условиях. Следы пиридина, оставшиеся в смеси после высушивания, служили для нейтрализации HI, образующейся при разложении иодида (XXI) следами влаги, что предотвращало реакцию апурини-зации получаемого продукта. Выделение мономеров INp5R проводили в два этапа. Заряженные примеси сорбировали,пропуская водно-спиртовые растворы продуктов через колонку, содержащую смесь дауэкса КНСОр и дауэкса 50(Nfb,). Далее их очищали при помощи гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-15 (рис.9). Такая очистка необходима для достижения так называемой "кинетической" чистоты продуктов, то есть такой чистоты, которая обеспечивала бы максимальну!) скорость их реакции с Tps . Присутствие даже небольших количеств примесей, не тестируемых методом ТСХ и являющихся,вероятно, продуктами разложения иодида(ХХІ), значительно уменьшало скорость реакции INp$R+ с Тр (рис.10). Вследствие меньшей гидро-фобности такие примеси элюируютоя раньше основного продукта, так как более поздние фракции пиков были кинетически более чистыми, чем их ранние фракции (рис.10). Целевые продукты были выделены в виде бесцветных порошков после осаждения из метанола в эфир с выходом 76-82$. Они были гомогенны при ТСХ (табл. 6), их УФ-спектры в воде близки к расчетным спектрам, полученным в результате суммирования спектров Np$ и (R+Br)CI (pnc.II).Данные %-ЯМР-спектроскопии также подтверждают их структуру(рис. 13-16, табл.7). Отнесение сигналов в .Н-ЯМР-спектрах INj R проведено на основании сопоставления их со спектрами (R" Br)I и 1Т(рис.7 и 12,соответственно,и в работе [118]), а также со спектрами нуклеотидов [122]. Способность lNpsR+ в разбавленных растворах в ,ЩФА после удаления R-зашитной группы образовывав с высоким выходом N ps (по данным ТСХ,иодометрии и УФ-спектро-скопии &03) свидетельствует о наличии в их структуре 1-й Ps -групп (табл.6).
Синтез5'Рз-аналога гексадекадезоксирибонуклеотида(ХШ.
Структура аналога (XXW) соответствует одному из фрагмен тов гена гормона человека ангиотензина I, синтезированного на- ми ранее23, 124]. Такой выбор объекта синтеза давал возмож ность исследования биохимических свойств аналогйС XXW) в срав нении с природным прототипом. Синтез со(динения( XX.W) проводили аналогично описанному выше (раздел 2.4.1) синтезу гексатиотимидилата (XXIII), введя в методику его проведения рассмотренные в этом разделе изменения . Условия синтеза представлены„в табл.И. Для более полного протекания реакции алкнлирования применяли 1,2-1,5-кратный избыток 1-компонеита. Как и при проведении модель-ного синтеза аналога (XXIII) скорость реакции алкилирования и растворимость Ви -солей Ps -компонентов оставались постоянными на всех стадиях синтеза. Средние затраты времени на проведение одной стадии синтеза составили 1,3ч, при этом основную их часть составляли затраты времени на деблокирование & -групп(0,5ч) и высушивание Ps-компонента(0,3ч). После проведения 15 стадий синтеза аналог ( XXIV ) выделяли ионообменной хроматографией на колонке с аминохромом с последующей очисткой при помощи обращенно-фазовой и гель-хроматографии(рис.20). Выход продукта после ионообменной хроматографии составил 242 ( (15,9$) в Oh. . пересчете на исходный мономер Cps , или 88,5% на одну стадию. После обращенно-фазовой хроматографии получено 182 0E2gQ (12$) гомогенного при МКХ на аминохроме аналога (XXIV) (рис.20). Гидрофобные примеси, имеющие одинаковый заряд с целевым аналогом, но выходящие при обращенно-фазовой хроматографии позднее его, представляют собой,вероятно, производные продукта, в которых не полностью прошло деблокирование оснований. Расчет коэффициента экотинкции аналога (XXIV) проводили суммированием коэффициентов экотинкции составляющих его нуклеотидов [125] без поправки на гипохромный эффект. УФ-спектр аналога (рис.19) характерен для пиримидиновых олигонуклеотидов(А j =265нм). Анализ нуклеотидной последовательности соединения (XXIV ) проводили модифицированным методом [126], используя измененные условия ферментативного 5 осфорилирования и гидролиза фосфотио-диэфирных связей, а также гомохроматографии [21]. Нуклеотидная карта аналога (XXIV) полностью подтверждает его структуру и свидетельствует о достаточной чистоте (рис.21). Анализ выполнен В.Н.Рыбаковым.
Таким образом, применение данного метода синтеза 5Ps-аналогов олигодезоксирибонуклеотидов показало следующие его пре- имущества. перед наиболее эффективным известным методом [21]; I.Скорость реакции алкилирования повышена в среднем в 100 раз,достигнута ее независимость от длины и заряда Р5-компонента. 2.Затраты времени на проведение одной стадии синтеза снижены в среднем более чем в 10 раз. 3.Растворимость Ps-компонента существенно увеличена за счет применения его Ви /У-солей, она остается постоянной на всех стадиях синтеза и не зависит от длины Р -компонента. Поэтому становится ненужным перемешивание гетерофазных реакционных смесей, как в способе [21], что значительно ускоряет процесс синтеза и упрощает его, а также снимает ограничение длины синтезируемого продукта, существовавшее в методе (211 вследствие плохой растворимости Ps -компонента в «ЩШ.. Данная работа является частью генно-инженерной программы, направленной на синтез структурной части гена гормона человека ангиотензина I, состоящего как из олигонуклеотидов с природным типом межнуклеотидных связей, так и из их 5Ps-аналогов, с целью исследования свойств последних не только in vitro, но и in vivo путем встраивания такого комбинированного гена в геном E.coli . Синтез других фрагментов названного гена был осуществлен нами ранее [21,1231. Изучение биохимических свойств аналога (XXIV) показало, что он проявляет матричные свойства в процессе его репарирующей репликации ДНК-полимеразой I E.coli в присутствии "кислородной" затравки. Скорость репликации была значительно ниже, чем в случае природного прототипа [15] (исследование выполнено В. А. Потаповым). Аналог (ХУЛУ) сшивается псшшуклеотидлигазой фага Т4 на комплементарной матрице как с"серным", так и с "кислородным" олигонуклеотидами также с меньшей скоростью,чем в случае природного прототипа(исследование выполнено В.Н.Рыбаковым). В работе использовали 2-дезоксирибонуклеозиды и PSDh (Merck, ФРГ), сефадексы G--I5 и (5--25(Pharmacia , Швеция), ионообменные смолы ЪотхЬОМ х2 и Do ex 1x2 (Dow-Chemical, 0ША),СКе1ех 100 ( BLO - Rad ,США), сорбенты аминохром АС-80 и Ме35і-силикагель предоставлены, соответственно, В.П.Зфмаревым и В.В.Гуяевичем, п-N ,N -диэтилфенилендиамин, хлоргидрат(Реахим). Соединения N ps синтезировали методом, описанным в работе [20] , IT и иодид (XXI) - методом [118], IGLb- по [20] ,ITpsCNt и 2-бром-(М ,N -дифенил)пропионамид - noUI9], хлорангидрид 2-бромпропионовой кислоты - по [J28]. 3.2. Основные методы -работы. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках силу-фол (Kctvalier, ЧССР) в системах: (А) - хлороформ-метанол-Ш ацетат натрия(рН 6,5),(10:20:5); (Б)- бутанол-уксусная кислота-вода(4:1:5); (В)- изопропанол-конц.аммиак-вода(7:0,5:2,5); (D-хлороформ-метанол(4:1). УФ-поглощающие вещества на хроматограм-мах обнаруживали при помощи ультрахемископа Брумберга, производные дезоксирибозы - реактивом Дише(0,5% раствор хлоргидрата пистеина в Зн Н2$04), 1 -производные - парами иода. Значения R$ приведены в. табл.6. Запись УФ-опектров и измерение оптической плотности выполняли на регистрирующем спектрофотометре "Specorcl "(ГДР) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути I см. Н-ЯМР-спектры записывали на спектрометре WP -200(Bruker ФРГ) на частоте 200,13 МГц в Б О при 70. В качестве внутреннего стандарта использовали Me3Si(CH2h$0iNa (химический сдвиг 0,015 относительно Ме 9і). Термостатирование реакционных смесей проводили при по- мощи термостата U-I в выносной кювете. Измерение рН -растворов и определение рКТРс выполняли на рН-метре рН-121. Определение pKTps проводили потенциометрическиь методом ЇІ293, титруя 0,0Ш раствор его литиевой соли в воде (10 мл) ЇМ HCI (20x10 мкл.) при 22. Значения рКа, рассчитанные как среднее из 8 измерений каждое, составили: рК = 2,1 0,1, рк=5,0±0,06. Взвешивание иодида (XXI). хранящегося под слоем абс. этил-ацетата в темноте, проводили в вакуумированной колбе с краном после удаления растворителя на пористом стеклянном фильтре и промывки абс.этилацетатом до слабо-желтого цвета осадка. Высушивание веществ осуществляли в вакууме над Р205 при А 20 в течение 15 мин.
