Введение к работе
Актуальность ^пюСлемы. В настоящее время в медицинской диагностике вирусных и наследственных заболеваний человека гивотных и растений все более широкое применение находят новые экспрессные высокочувствительные методы нерадиоактив-ного габридизационного анализа (ГА) нуклеиновых кислот (НК). Существующие метода нерадиоактивного гкбридизационного анализа НК достаточно многочисленны, однако, методы прямой регистрации обладают низкой чувствительностью, а большинство методов опосредованной регистрации требуют использования дорогих реагентов и сложной детектирующей аппаратуры, хотя и обеспечивают довольно высокую чувствительность.
В нашей стране в области клинической диагностики до сих пор преимущественно используется опасный, и неудобный для эксплуатации метод радиоактивного ГА, т.к. использование нерадиоактивных диагностических систем зарубежных фирм требует значительных валютных затрат. Аналогичных конкурентно-способных систем ГА отечественного производства пока но существует. Следует отметить, что ведутся отдельные работы по совершенствованию методов детекции, ко особо остро стоит проблема создания материалов пригодных для использования в ГА и отработки дагностических систем на их основе.
Целью данной диссертационной работы является разработка экспрессных методов нерадиоактивного ГА ШС при использовании новых полимерных материалов отечественного производства, таких как полиакролеиновне латексн п лавсановые мембраны, для создания высокочувствительных диагностических систем удобных в клинической и лабораторной практике.
Научная новизна. Впервые рэзрзботпн новый способ нера-диоактивного ГА НК, основанный на применении флуоресцентных латексних частиц для опосредованной детекции гнбридазоцвоп-шго сигнала. Метод не уступает по чувствительности широко примевявдимся методам ГА, использущш фзрмзнтные ковъвгаты; отличается зкспрессностьо, т.к. детекция проводится непосредственно в одну стадию, н простотой з оперирования: Впервые разработаны эффективные метода иммобилизации, гибридизации и детекции ДНК в дот- варианта для лзвсаноюй мембраны отечественного производства. Отработаны способы
детекции гиОридизационного сигнала как ферментным, так и латексным коныогатом со стрептавидином и показано, что латексшй гибридизационный анализ (ЛГА> на лавсане не уступает по чувствительности методам ГА, использующим ферментные конъюгаты и стандартные импортные мембраны. С цель» использования высоко аффинной полимерной подложки в сэндвич-гибридизационном анализе для детекции РНК вируса клещевого энцефалита (БКЭ) разработан способ ковалентной иммобилизации фрагментов НК на лавсановую .подложку с сохранением ими способности образовывать прочные комплементарные комплексы.
Практическая ценность работы. Разработанный метод ЛГА отличается высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой оперирования и может эффективно использоваться в дот-варианте для диагностики некоторых вирусных заболеваний человека, животных и растений в клинических условиях. Лавсановая мембрана может заменить стандартные импортные мембраны для проведения ГА как при ферментном проявлении, так и при использовании флуоресцентного латексного . конъюгата. Более того, лавсан нашел'применение не только в дот-, по и в сэндвич-гибридизационном анализе при создании реального нерадиоактивного диагностикума на РНК БКЭ.'
Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано II работ и получены положительные решения по 2 заявкам на изобретение. Результаты'докладывались на 6-ой Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии /Чехословакия, Бехин, 1989/; 20-ой конференции ФЕЮ /Венгрия, Будапешт, 1990/; Международном симпозиуме по проблемам и перспективам применения синтетических олигонуклеотидов /Москва, 1991/.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы» включающего ІЗЄработ. Работа .изложена ъ&Ш1~ страницах, содержите рисунков и 12 таблиц.
