Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 13
1. Биофармацевтическая промышленность: базис и надсройка 13
2. Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках 2.1. Образование тел включения 23
2.2. Ренатурация и рефолдинг 3. Особенности биосинтеза рекомбинантных белков в клетках млекопитающих 52
4. Выделение и очистка генно-инженерных белков 4.1. Очистка белков от бактериальных эндотоксинов 68
4.2. Очистка от фрагментов нуклеиновых кислот 79
4.3. Очистка от вирусов 80
4.4. Очистка от родственных белков 81
4.5. Валидация процессов выделения и очистки 83
5. Примеры выделения и очистки значимых биофармацевтических белков .86
5.1. Производные инсулина 87
5.1.1. Стадии технологического процесса 89
5.1.2. Технология получения рекомбинантного инсулина гларгина 90 5.2. Интерферон-гамма 92
5.2.1. Процесс «upstream» 93
5.2.2. Этапы “downstream" процесса 94
5.3. Фоллитропин 95
5.3.1. Вектор экспрессии рекомбинантного фоллитропина 96
5.3.2. Очистка рекомбинантного ФСГ 97
Результаты и обсуждение 102
1. Создание промышленной технологии выделения и очистки человеческого
инсулина в производстве препарата-биодженерика 103
1.1. Разработка внутрипроизводственного контроля содержания мономера РП в растворах 104
1.2. Растворение ТВ и денатурация РП . 115
1.3. Рефолдинг РП. 117
1.4. Валидация внутрипроизводственного контроля чистоты мономера РП в растворах методом ПААГЭ. 119
1.5. Очистка РП. 131
1.6. Ферментативный гидролиз РП. 133
1.7. Очистка ГИЧ и получение АФС. 136
2. Создание промышленной технологии выделения и очистки инсулина-глар гина в производстве препарата-биодженерика. 141
2.1. Растворение ТВ и денатурация РП. 142
2.2. Рефолдинг РП. 144
2.3. Очистка РП. 152
2.4. Создание метода внутрипроизводственного контроля ИГ. 155
2.5. Ферментативный гидролиз РП. 156
2.6. Очистка ИГ и получение АФС 159
2.7. Подтверждение эквивалентности. 164
3. Создание промышленной технологии выделения и очистки N,N-бисметио нилгистона Н1.3 в производстве оригинального препарата «Онкохист» 168
3.1. Валидация методов внутрипроизводственного контроля. 172
3.2. Выделение БМГ из клеток . 180
3.3. Предочистка и концентрирование БМГ. 182
3.4. Основная очистка БМГ и получение АФС. 187
4. Создание промышленной технологии выделения и очистки интерферона гамма в производстве препарата-биодженерика . 205
4.1. Выделение из клеток ТВ, денатурация Инт-Г. 205
4.2. Ренатурация Инт-Г. 208
4.3. Очистка Инт-Г и получение АФС. 210
5. Создание промышленной технологии выделения и очистки фолликулости мулирующего гормона в производстве препарата-биодженерика . 215
5.1. Контроль метаболизма клеточной линии 218
5.2. Внешняя перфузия белковой фракции из культуральной жидкости .221
5.3. Вирусная инактивация и предочистка ФСГ 224
5.4. Основная очистка ФСГ методами аффинной и гидрофобной хроматографии. 228
5.5. Финишная очистка и получение АФС. 231
5.6. Подтверждение эквивалентности. 234
6. Алгоритм разработки технологий выделения и очистки генно-инженерных
белков 236
Материалы, приборы и методы 240
1. Материалы 240
1.1. Реактивы 240
1.2. Хроматографические сорбенты и колонны 241
2. Приборы 243
2.1. Хроматографические системы 243
2.2. Оборудование 244 3. Методы 244
3.1. Контроль производства ГИЧ методом ВЭЖХ 244
3.2. Контроль производства ИГ методом UPLC 245
3.3. Контроль ГИЧ, ИГ, БМГ и Инт-Г методом SEC 246
3.4. Контроль производства БМГ методом ОФ ВЭЖХ 247
3.5. SDS-PAGE 249
3.6. Контроль лактатов методом ВЭЖХ 249
3.7. Масс-спектрометрия ИГ 249
3.8. Пептидное картирование ИГ 249
3.9. Получение ГИЧ 2 3.10. Получение ИГ 254
3.11. Получение БМГ 258
3.12. Получение Инт-Г 260
3.13. Получение ФСГ 262
Выводы 265
Список опубликованных работ 267
Благодарности 275
Библиография
- Выделение и очистка генно-инженерных белков 4.1. Очистка белков от бактериальных эндотоксинов
- Растворение ТВ и денатурация РП
- Выделение БМГ из клеток
- Хроматографические системы
Выделение и очистка генно-инженерных белков 4.1. Очистка белков от бактериальных эндотоксинов
Общая стратегия развития современной молекулярной биологии, биохимии, микробиологии обеспечивает создание новых векторов для переноса генетической информации, разработку штаммов усовершенствованных прокарио-тических клеток, дрожжей, способов поддержания перевиваемых культур клеток млекопитающих, эффективных схем очистки рекомбинантных белков и методов промышленной биотехнологии с использованием крупномасштабных биореакторов. На сегодняшнем этапе развития медицинской биотехнологии резервы использования прокариотических клеток-хозяев практически исчерпаны. Новые, наиболее востребованные продукты, такие как гликопро-теины большой молекулярной массы, трудно производить в E. coli в био-технологически оправданных количествах. Для обеспечения своей функциональной активности они требуют адекватной посттрансляционной модификации. В этой связи на повестку дня поставлен вопрос использования эукари-отических клеток млекопитающих. В частности, это относится к терапевтическим антителам, факторам свертывания крови, молекулам адгезии. Переход от микроорганизмов к культурам животных клеток удорожает производство белковых продуктов на порядки. Однако все промышленно-развитые страны мира активно включились в эту биотехнологическую гонку, и пошли по пути создания национальных и транснациональных исследовательских и промышленных центров [10].
Пожалуй, самой большой трудностью работы с генно-инженерными белками и продвижения их фармацевтический рынок является вопрос биологической безопасности. Белковая молекула, произведенная в чужеродном продуценте, может быть выделена с примесями, в том числе с фрагментами ДНК клетки-хозяина, ее белками, полисахаридами и эндотоксинами, а также вирусами. Применение препаратов с подобными контаминациями чревато серьезными осложнениями [11].
Таким образом, промышленные технологии производства терапевтических ЛС на основе генно-инженерных белков должны включать не только этапы наработки вещества продуцентом и последующие механизмы извлечения из них, но и стадии избавления от примесей. Организации выделения и очистки – это две разные и сложные задачи. С одной стороны, необходимо осознать и четко представлять те примеси, которые являются сопутствующими целевому белку в технологии, а также те максимально допустимые уровни этих примесей, которые могут быть в финальных АФС и ГЛС. С другой стороны, крайне важно разрабатывать максимально эффективные технологии очистки от этих примесей.
Таким образом, можно выделить три основных базиса, на которых покоится современная методология биофармацевтической промышленности: (1). Реализация стратегии производства и создание спецификации на конечный продукт, включающей параметры качества, которым должен соответствовать конечный продукт.
(2). Выращивание клеток продуцента, инициирование (индукция) биосинтеза целевого генно-инженерного белка. Это так называемый этап «upstream» процесса.
(3). Многостадийная очистка с целью максимально эффективного снижения уровня примесей – «downstream» процесс.
(4). Организация системы обеспечения качества продукции, которая начинается с создания регламента, включающего не только подробное описание этапов «upstream» и «downstream» процессов, но и методики внутрипроизводственного контроля и контроля качества полупродуктов и конечного продукта.
Наиболее полно механизм создания спецификации на продукт биологической и биотехнологической природы описан Международной Конференцией по Гармонизации [12].
Примеси биофармацевтических объектов могут быть процессуальными (возникшими в ходе процессов биосинтеза, выделения и очистки) или родственными (возникшими в ходе химических и биохимических превращений, в ходе хранения – продукты деградации). Процессуальные примеси могут быть трех типов: (1). Производные клеточного субстрата: остаточные нецелевые белки продуцента, балластные молекулы ДНК или ее фрагменты, компоненты клеточных стенок. (2). Производные клеточных культур: индукторы, антибиотики, плазма, компоненты питательных сред. (3). Производные «downstream» процесса: ферменты, химические и биохимические реагенты, неорганические соли, растворители, носители, смытые с хроматографических колонн лиганды.
В свою очередь, родственные примеси также могут быть трех типов: (1). Продукты ферментативной или химической деградации. (2). Модифицированные формы целевой молекулы: дезамидированные, изо-меризованные, окисленные формы, формы с некорректно замкнутыми ди-сульфидными связями, формы с некорректными конъюгированными остатками (гликозилирование, фосфорилирование). (3). Агрегаты целевого белка.
Таким образом, при разработке процессов выделения и очистки белка необходимо придерживаться двух граничных условий:
(1) способы избавления от примесей той или иной природы должны быть оптимальны с учетом должного качества продукта;
(2) способы избавления от примесей должны проводиться так, чтобы исключить (или, по крайней мере, минимизировать) деградацию продукта. Основная часть процессуальных примесей берет свое начало на этапе «upstream» процесса. Очевидно, что спектр таких примесей определяется в первую очередь выбором того или иного продуцента. В такой выбор возможен при учете свойств производимого объекта – генно-инженерного белка. Таких свойств два: 1. уникальный аминокислотная последовательность терапевтического белка, 2. наличие (и их значимость для конечной лекарственной формы) посттрансляционных модификаций, главным из которых является гликозилирование. Первое свойство включает такие параметры, как молекулярная масса белка, удельная гидрофобность, значение изоэлектрической точки (рассчиты 20 ваемое по количеству основных и кислотных а.о.), присутствие цистеиновых а.о. либо в свободной форме, либо замкнутых в дисульфидные связи, а также наличие ароматических а.о.
Второе свойство – посттрансляционные модификации – обосновывает необходимость выбора того или иного продуцента на этапе «upstream» процесса. Очевидный пример – необходимая степень и вид гликозилирования может быть причиной выбора эукариотического штамма, в то время как отсутствие гликозилирования у изучаемого белка позволяет говорить о выборе прокари-отического продуцента.
Совокупность преимуществ и недостатков того или иного продуцента заставляет выбирать ту или иную систему биосинтеза целевого белка. Как правило, компромиссным решением является выбор дрожжевых клеток; чаще всего – метилотрофов. Остальные случаи определяются свойствами объекта исследований. Наиболее типичные примеры следующие. Инсулин является достаточно маленьким белком (молекулярная масса 5807 Да) и лишенным профиля гликозилирования. В таком случае приоритетом при постановке задачи выбора продуцента является производительность биосинтеза, и, в конечном счете, – рентабельности продукта. Поэтому наиболее предпочтительными продуцентами являются E.coli и S.cerevisiae [13,14]. С другой стороны, сложные и большие белковые молекулы, такие как субъединичные и гликозилированные антитела или фолликулостимулирующий гормон, очевидно, лучше всего производить в клетках животных, наиболее известными из которых являются СНО[15,16].
Растворение ТВ и денатурация РП
Очистка гетеродимера ФСГ, состоящего из - и -субъединиц, может быть осуществлена из монослоя или суспензионной культуры клеток СНО-К1 рядом методов. Указанным ниже способом очистки можно получить рекомби-нантный ФСГ максимально высокой чистоты, который может быть представлен в готовом лекарственном средстве, например, Гонал-Ф (Serono-Merck, Германия, Швейцария). Этот метод имеет преимущество обеспечивать высокую степень чистоты без использования иммуноаффинной хроматографии [317].
Антиоксидант присутствует в любом из буферов, используемых для очистки и / или концентрации и / или фильтровании ФСГ. Антиоксидант предотвращает окисление ФСГ во время обработки. Предпочтительным антиоксидантом является L-метионин, который предпочтительно использовать в концентрации 10-100 мМ. Также в качестве антиоксидантов может быть использован трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-бис(1,1-диметилэтил)-4-метилфенол, би-метабисульфит натрия или калия, бисульфит натрия. Примерами свободных аминокислот и дипептидов с антиоксидантным эффектом являются гистидин, таурин, глицин, аланин, карнозин, 1-метилгистидин или их комбинации [318]. Как правило, исходный материал очищают, а затем, по возможности, концентрируют, например, ультрафильтрацией и диафильтрацией. На стадии очистки применяют аффинную хроматографию с использованием красителя голубого (например, Blue Dye Sepharose, GE Healthcare, Швеция), хроматографию гидрофобных взаимодействий (ХГВ) и ОФ ВЭЖХ. Первым этапом является аффинная хроматография с использованием красителя. В данном случае она осуществляется с помощью матрицы, имеющей в качестве иммобилизованных лигандов широко известное красящее соединение, Cibacron Синий F3G-A.
Хроматография также может быть выполнена с альтернативными видами матриц, имеющими аналогичные характеристики. Примерами альтернативных матриц являются: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh, Япония), Toyopearl SuperButyl 550 (Tosoh), Toyopearl Phenyl 650 (Tosoh), синий Cellthru BigBead (Sterogene, США), SwellGel Blue (Pierce, США), Cibachrome Blue3GA-агарозы 100 (Sigma, Германия), Affi-Gel Blue (Bio-Rad, США), Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Blue sepharose HP (GE Healthcare), Cibacron Синий 3GA (Sigma).
Культуру клеток, содержащую ФСГ, наносят непосредственно на матрицу. После нанесения сорбент промывают уравновешивающим буфером, а затем элюируют фосфатным буфером, предпочтительнее фосфатом натрия; рН элюента поддерживают 6,0- 8,0. Буфер для элюирования должен содержать соли, предпочтительно NaCl, для увеличения проводимости, а также антиоксидант, например L-метионин. Первый этап очистки осуществляется при 2-8С.
Второй шаг – ХГВ. В предпочтительном варианте ХГВ осуществляют на сорбенте бутил Toyopearl 650M (Tosoh) при комнатной температуре. Также могут быть использованы альтернативные типы матриц, имеющие аналогичные характеристики: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow; Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Source 15PHE (GE Healthcare). Связывание в ХГВ проводят в буфере с высокой проводимостью (высокой концентрацией NaCl, (NH4)2SO4 или Na2SO4). Элюируют на этапе ХГВ преимущественно за счет снижения проводимости подвижной фазы (снижения концентрации солей) буфером с рН 6-8, причем наиболее предпочтительно значение для рН около 7,0. В качестве буфера используют фосфат натрия или сульфат аммония, также буфер должен содержать антиоксидант, например L-метионин.
Заключительным этапом является ОФ ВЭЖХ, которую предпочтительно проводить на сорбенте SOURCE 30 RPC (GE Healthcare) при комнатной температуре с использованием слегка щелочной мобильной буферной фазы, например ацетата аммонния, рН 7,0-8,5. Буферный раствор на данном этапе очистки содержит органические модификаторы, концентрация которых изменяется для различных этапов хроматографии (уравновешивание колонки, нанесение образца, элюирование и регенерация). В качестве органических модификаторов используют водорастворимые органические растворители, например спирты (метанол, этанол и др.), чаще всего изопропанол. Дополнительно также проводят очистку методом анионообменной хроматографии, где в качестве сорбента используют Q Sepharose FF (GE Healthcare). Ионообменную хроматографию предпочтительно проводить с использованием буфера с умеренно щелочной средой (рН около 8,5). Подходящими буферами являются, например, боратный буфер, триэтаноламин / трис, ацетат аммония, бицин, TES, HEPES. Наиболее предпочтительным является боратный буфер, рН 8,5. Элюирование достигается за счет увеличения электропроводности подвижной фазы (добавления соли NaCl).
До шага ионообменной хроматографии, может быть проведена ультрафильтрация (или диафильтрация), которую предпочтительно проводить с использованием мембран с пределом отсечения 8 кДа при 2-8С. Дополнительно проводят еще одну очистку - второй этап анионообменной хроматографии.
В качестве полимера используют Fractogel EMD TMAE HICAP (Merck, Германия). Кроме того, второй этап анионообменной хроматографии может быть осуществлен на Q Sepharose FF. Дополнительным этапом выделения является ультрафильтрация/диафильтра-ция [319]. В одном из методов очистки после любой из ступеней хроматографии (особенно после ОФ ВЭЖХ) образец ФСГ подвергают концентрированию предпочтительно ультрафильтрацией, проводимой с использованием мембран с пределом отсечения 5 кДа.
Ультрафильтрация (мембрана с пределом отсечения 5 кДа). Для удаления вирусов, снижения риска загрязнения ФСГ вирусами из клеточной культуры необходимо проводить нанофильтрацию. Ее можно сделать на любой стадии процесса очистки при 2-8C, однако логичнее всего после 2-го этапа ионообменной хроматографии или после ОФ ВЭЖХ [67]. Очищенные фракции ФСГ замораживают и лиофилизируют для получения полноценной АФС [320].
Выделение БМГ из клеток
Указанные свойства могут быть использованы для разработки высокоэффективного процесса очистки БМГ.
Первое, с чего мы вынуждены были начать при разработке технологии - создать и квалифицировать метод внутрипроизводственного контроля. В случае БМГ нам понадобилось иметь в арсенале три метода: уже существующий и хорошо известный метод Лэммли, а также два новых метода - ОФ ВЭЖХ и SEC.
Метод SEC, описанный выше в разделе 1.1 секции Результаты и обсуждение, должен быть применим и в случае анализа БМГ, т.к. молекулярная масса последнего вполне укладывается в калибровочный диапазон. ОФ ВЭЖХ, который мы взяли за основу, - это метод, используемый компанией Symbiotec, но слегка модифицированный [339]. В соответствии с требованиями GMP были выбраны следующие критерии для оценки результатов проведенной валида-ции методов SEC и ОФ ВЭЖХ для контроля содержания и чистоты БМГ в препаратах: линейность, воспроизводимость, сходимость, специфичность и устойчивость. Также был найден предел обнаружения методов. В качестве контрольного образца использовался препарат Oncohist (предоставлен компанией Symbiotec).
Суть данного критерия заключается в том, что оцениваемый результат анализа (площадь пика) должен быть пропорционален концентрации аналита в образце. Как в случае ОФ ВЭЖХ, так и в случае SEC линейность оценивали в диапазоне 0,5-1,5 мг/мл.
В соответствии с нормативными требованиями, диапазон выбирали с запасом не менее 20% от планируемых значений. Поэтому мы выбрали диапазон концентраций БМГ от 0,4 до 1,8 мг/мл.
Для эксперимента были приготовлены 5 образцов с концентрациями аналита 0,4; 0,7; 1,0; 1,4; 1,8 мг/мл. Каждый образец был проанализирован пять раз, площади хроматографических пиков определяли автоматически, полученные значения использовали для построения регрессионной линии методом наименьших квадратов.
При использовании ОФ ВЭЖХ для анализа содержания исследуемого белка было показано, что линейность сохраняется в диапазоне от 0,4 до 1,4 мг/мл, в этом случае коэффициент детерминации R равен 0,9941 для общего числа измерений п=25.
Воспроизводимость и правильность методики оценивали в течение двух дней на трех образцах с концентрациями 0,4; 1,0 и 1,8 мг/мл для SEC и 0,7; 1,0 и 1,4 мг/мл для ОФ ВЭЖХ (каждый день готовили новые образцы). Анализ образцов каждой концентрации проводили по пять раз. Полученные результаты представлены ниже (Таблица 22). Как можно видеть из представленных результатов, значения коэффициентов вариации и относительных стандартных отклонений не превышают установленного рекомендациями GMP предела в 15%, следовательно, можно считать данные хроматографические методы контроля концентрации БМГ воспроизводимыми и точными. Таблица 22. Результаты оценки устойчивости методики определения концентрации рекомбинантного БМГ. НоминальнаяконцентрацияБМГ, мг/мл SEC ОФ ВЭЖХ НоминальнаяконцентрацияБМГ, мг/мл
Предел обнаружения методики составил 0,11 мг/мл для SEC и 0,01 мг/мл для ОФ ВЭЖХ. Нижний предел количественной оценки для SEC равен 0,35 мг/ мл, а для ОФ ВЭЖХ - 0,04 мг/мл. В качестве верхнего предела количественной оценки можно считать верхний предел линейности методики, т.е. максимальную концентрацию аналита в образце, при которой выполняется критерий линейности. Верхний предел для SEC равен 1,8 мг/мл, для ОФ ВЭЖХ -1,4 мг/мл.
В случае SEC была смоделирована ситуация, которая может возникнуть при несоблюдении условий хранения или при длительном хранении препарата. При нарушении температурных условий часто наблюдается разложение действующего компонента с образованием низкомолекулярных примесей. Для моделирования данной ситуации мы провели ферментативный гидролиз контрольного образца трипсином; полученными в ходе трипсинолиза низкомолекулярными соединениями мы искусственно загрязняли контрольные образцы. Для оценки специфичности мы использовали рабочие растворы БМГ, содержащие соответственно 0,4, 1,0 и 1,8 мг/мл и низкомолекулярные примеси (получение которых было описано выше). Каждый из трех растворов анализировали по пять раз (Рисунок 67).
В случае ОФ ВЭЖХ была смоделирована ситуация, которая может возникнуть при некачественной постадийной очистке белка (в ходе «downstream» процесса). Для определения специфичности методики ОФ ВЭЖХ использовали контрольный раствор БМГ, к которому добавляли культуральную жидкость неиндуцированной клеточной культуры Е. coli, не содержащую исследуемый белок, в количестве, необходимом для получения конечной концентрации чистого гистона в образцах 0,7; 1,0 и 1,4 мг/мл. Появление описываемого спектра примесей возможно при выделении рекомбинантного БМГ из культуральной жидкости (Рисунок 68).
Хроматографические системы
В работе использовали: система для ВЭЖХ Agilent 1100, снабженная двухплунжерным насосом производительностью до 10 мл/мин, термостатом колонок, инжектором с дозирующей петлей 20 мкл, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором HP Chem (Agilent Technologies, США); система для ВЭЖХ Agilent 1200, снабженная двухплунжерным насосом производительностью до 10 мл/мин, термостатом колонок, инжектором с дозирующей петлей 20 мкл, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором HP Chem (Agilent Technologies, США); система для ВЭЖХ, снабженная двухплунжерным насосом System Gold производительностью до 10 мл/мин (Beckman, США), инжектором с дозирующими петлями от 2 до 2000 мкл (Rheodyne, Швеция), УФ-детектором Lambda-Max с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм (Waters, США) и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором System Gold (Beckman, США); система для ВЭЖХ, снабженная изократическим насосом Applied Biosystems производительностью до 9,9 мл/мин (Applied Biosystems, США), инжектором с дозирующей петлей 10 мкл (Rheodyne, Швеция), УФ-детектором Applied Biosystems с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм (Applied Biosystems, США) и компьютером с программным комплексом обработки данных МультиХром (Ampersand, РФ);
система для ЖХ Akta Basic 100, снабженная четырехплунжерным насосом производительностью до 100 мл/мин, инжектором с дозирующими петлями от 500 до 2000 мл, проточным кондуктометром, проточным рН-метром, УФ 244
детектором с тремя вариабельными длинами волн от 190 до 300 нм и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором Unicorn (GE Healthcare, Швеция);
система для препаративной ВЭЖХ Knauer, снабженная изократическим насосом производительностью до 250 мл/мин, градиентным задатчиком на линии всасывания, УФ-детектором с вариабельной длиной волны от 190 до 300 нм (Knauer, Германия);
система для препаративной ВЭЖХ YMC, снабженная трехплунжерным насосом производительностью 500 мл/мин (Armen, Франция), УФ-детектором с набором длин волн 200, 220, 254, 280 нм (Knauer, Германия), коллектором фракций HSW (Kronlab, YMC Со, Германия) и компьютером с программным комплексом обработки данных и управления прибором PrepCon (SCPA, Германия).
В работе использовали: спектрофотометр с вариабельной длиной волны от 190 до 700 нм (Uvicord, США); рН-метр МР220 (Mettler Toledo, США); мешалка магнитная (VWR, Германия); система для фильтрации на базе перистальтического насоса (Waters, США); центрифуга до 10000 g (Heraeus Sepatech, Германия); система для тангенциальной фильтрации Pelicon (Millipore, США); система для тангенциальной фильтрации Biocon (Millipore, США).
Внутрипроизводственный контроль осуществляли с помощью градиентного элюирования через колонну для ВЭЖХ YMC-ODS-A, термостатированную при 40С. Для этого использовали градиентную аналитическую систему
Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Детектирование проводили при 214 нм. Элюирование проводили со скоростью потока подвижной фазы 1,5 мл/мин. Подвижная фаза «А»: 10%-ый раствор ацетонитрила в воде, содержащий 0,1 М сульфата натрия, 0,02 М ортофосфорной кислоты и 0,25 мл/л триэта-ноламина. Подвижная фаза «В»: 50%-ый ацетонитрил в воде. Для приготовления растворов использовали апирогенную воду. Растворы фильтровали под вакуумом через 0,22 мкм, затем дегазировали гелием в течение 5 мин. Элюирование проводили в градиенте фазы «В». Использовали следующую программу градиента концентрации подвижных фаз:
Внутрипроизводственный контроль осуществляли с помощью градиентного элюирования через колонну для ВЭЖХ YMC-Hydrosphere, термостатированную при 400С. Для этого использовали градиентную аналитическую систему Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Детектирование проводили при 214 нм.
Элюирование проводили со скоростью потока подвижной фазы 1,0 мл/мин. Подвижная фаза «А»: 10%-ый раствор ацетонитрила в воде, содержащий 0,1 М сульфата натрия, 0,02 М ортофосфорной кислоты и 0,25 мл/л триэта-ноламина. Подвижная фаза «В»: 50%-ый ацетонитрил в воде. Для приготовления растворов использовали апирогенную воду. Растворы фильтровали под вакуумом через 0,22 мкм, затем дегазировали гелием в течение 5 мин. Элюирование проводили в градиенте фазы «В». Использовали следующую программу градиента концентрации подвижных фаз:
Для определения специфичности во время валидации метода анализа в контрольный раствор были искусственно привнесены примеси: - в случае БМГ использовали низкомолекулярные примеси, полученные ферментативным расщеплением контрольного образца трипсином. К контрольному образцу БМГ с концентрацией 10 г/л добавляли 2 мл трипсина (концентрация трипсина 250 000 МЕ/мл) и перемешивали 2 ч на магнитной мешалке при комнатной температуре. Полученные в ходе трипсинолиза низкомолекулярные соединения искусственно добавляли в контрольные образцы БМГ. - в случае ИГ использовали 3 раствора очищенного РП с концентрациями 6.00, 7.00 и 12.00 мг/мл. Три аликвоты этих растворов смещивали 1:1 с тремя аликвотами растворов, содержащих мультимерные формы РБ в концентрации 2.14, 3.12 и 4.26 мг/мл. Полученные растворы с различными концентрациями ренатурированного мономера РБ 3.00, 4.50 и 6.00 мг/мл анализировали в течение одного дня в пяти повторах.
Для определения специфичности во время валидации метода анализа в контрольный раствор были искусственно привнесены примеси: использовали культуральную жидкость неиндуцированной клеточной культуры Е. coli, не содержащую целевой белок. Для получения примесной добавки в процессе культивирования штама-продуцента Е. coli Bl21(DE3)/pEGTl/H1.3S до добавления индуктора было отобрано 5 л неиндуцированной клеточной культуры. Последующая гомогенизация (гомогенизатор APV-1000, APV Gaulin, Голландия), центрифугирование (скорость 7 000 об/мин, время центрифугирования 10 мин, центрифуга Heraeus Sepatech, США), а также экстракция 2,5 % пер-хлорной кислотой позволили получить культуральную жидкость, не содержащую целевой гистон, но обладающую полным спектром характерных примесей белковой природы.
Анализ динамики роста клеток СНО (huFSH/IK, получена из клеточной линии СНО К1 DXB11 (dhfr-)) проводили на хроматографической системе Agilent 1200 (Agilent Technologies, США), снабженной хроматографической колонкой YMC Triart СІ8 3 мкм, 150 х 4,6мм (YMC, Германия), УФ детектором (длина волны 214 нм) и системой дозированного ввода пробы (объем пробы 20 мкл). Подвижная фаза «А» состояла из 10% ортофосфорной кислоты, воды для инъекций (рН 0,8), фаза «В» состояла из 50% ацетонитрила, воды для инъекций. Элюирование проводили в режиме градиента концентрации ацетонитрила (от 0 до 50 % об.). Скорость потока 1 мл/мин. Время анализа 12 мин.
