Введение к работе
Актуальность проблзш. Защита от віфусшх ин$вкцкй с
поиояьй вакцинации является одтш из наиболее эффективных
иетодоз борьба с заболавашіяш вирусной природы как человека
так и штотгак. Однако традиционная вакцинация не ыояет решить
всех проблей контроля над инфэквдонныш болезнями, поскольку
существукцио вакцины, приготовленные на основе
шактивіфовашюго вируса, ншв? существенные недостатки, связаныэ с наличиец пршасей, с остаточной инфвкционностыэ, трудкостязш производства и хранения, а такяа ншуностиыуляцией изгелатальных процессов. Kpoua того, для шгогих заболеваний вирусной природа ко существует эффективных традиционных вакцин.
Достижения в иммунологии, молекулярной биологии и
биоорганичаскоЯ хішии явились основой для реализации другого,
более перспективного подхода к создания противовирусных вакцин,
гаклачагзщегося в индукции эффективного иныунитета с помощью
"неинфокциопныг" иолэкул, получаемых негодами пептидного
синтеза. Прзішущзства папгндшл вакщш по сравнении с
традиционными вэкпинаци, пояученннш на основе
шіактивирсззнкого вируса, заключаются з их химической гоногешгастЕс, неиифвкпношостк, строгой направленности шшунного ответа и отсутствии ПОбОЧІШХ ЭффвКТОВ. Выгодно отличает пептидные вакцшш то, что их производство не связано с переработкой внруссодерзввдп отходоз.
Синтез пептидов, соответствующих участкам полипоптидной цепи вирусных белков, связывающихся с вируснейтрализукцими антителаыи, осуществлен для ряда возбудителей инфекциошшх
Принятые сокращения: dco - дищпиіогвксилкарбодиишід, новт -І-оксибензотриазол, кілі - геноцланіш улитки, ПАФ - полный адьювант фрейвда, НА - неполный адъювант Фрейнда, ИФА -иішуноферменткнй анализ, ИДзд - ішфекциоішая доза вируса, вызывающая заболевание 50й зшвотных, ГЦД50 ~ тканевая цитотоксическая доза вируса, вызывающая 50Х-иый цитотоксический эффект, ТПА - титр противопептидных антител (-iog10), ТВА -титр вируснейтрализувдих антител (-log,).
заболеваний: вирусов гриппа, гепатита В, полиоииелита и др. Для создания на основе пептидов гашуногенных препаратов, способных защищать экспериментальных нивотных от заболевания, в большинстве случаев использует конъюгаты этих пептидов с белковый» носите ляшс. Однако применение белковых конъюгатов осложнено нехселатедьной спшудяцгшй шшунного отвэта на саи белковый носитель, сохраненной Т-клеточной пашіти после иммунизации конъпгатои лишь на чугеродные Т-эпитош белка-носителя и химической неоднородностью коньюгато.
Новый и значительно более перспективный подход к созданию ишуногенных пептидов связан с использованием Т-хелперных эпитопов вирусных белков и с получавши сравнительно небольшое пептидов, содераащих одновременно шрусспецифические В- и Т-элитош. Такие пептидные вакцины являются химически индивидуальными препаратами, они способны без конъюгации с белковый носителей шцццирозать строго направленный противовирусный ишунитет, стимулировать как В-клеточную, так и Т-клеточную противовирусную память и обеспечивать долговременную защиту от заболевания. Однако реализация такого подхода требует решения целого комплекса проблем'; связанных с получением детальной информации о распологении тшуноактившх участков в последовательности вирусных белков и с выявлениеи иммунодоминантных противовирусных В- и Т-эпитопов, с изучениеи механизмов противопептидного иммунитета и связи его с противовирусный иммунным ответом, и, в конечном счете, с установлением последовательности пептидов, несущих все ишуноактивные участки вирусного белка, необходимые для стимуляции защиты от заболевания.
В настоящее время в ряде стран ведутся исследования, целью которых является создание чисто пептидных вакцин для вирусных инфекций, но до сих пор нэ получено результатов, позволяющих использовать синтетические вакцина в. практике.
Данное исследование посвящено разработке теоретических и практических подходов к созданию чисто пептидной противовирусной вакцины на примере вируса ящура.
в ряду различных вирусов, моделирование антигенных и протективных участков которых пытались реализовать с помощь» синтетических пептидов, особое место занимает вирус ящура. Простота антигенной структуры и наличие доступной естественно
восприимчивой к вирусу шшотасЗ модели позволили накопить сукествоинуэ информацию о структуре я пэханизмах функционирования вируса. Однако, несмотря на значительное число работ, посвященных изучению антигенной структуры вируса ящура, данные различных исследователей о расположении В-эпнтопов и вирусных белках весьма разноречивы* Нет сведений о вирусспещтфическнх Т-эпитопах в структуре белков, а также о проявлении свободный» пептидными фрагментами собственной инмуногашіости, без коньвгзцші с белковым носителей и без введения в последовательность чуаеродшх остатков аминокислот. Описанные к настоящему времени синтетические пептидные фрагаентн белка вируса ящура не удовлетворяют требование, предъявляемы}! к чисто пептидны» вакцинам, полноценный противовирусный иннуногенаи, н не обеспечивает стабильной защиты пріфодковоспршшчивих к ящуру животных от заболевания.
В связи с этим актуальной представляется проблема получения пептидного препарата, способного в свободном виде, без коньвгацш с белковым носитзлаи, обеспечивать устойчивый протшояиурныА иммунитет у естественно восприимчивых к вирусу ящура внвотшх.
Цели и задачи работы. Настоящее исследование посвящено разработке йа пр'шерэ вируса ящура комплексного подхода, позволяющего с пешщьш синтетических пептидов локализовать высокошшуногешше фрагменты вирусных белков, содержащие ииыуноактивные участки, необходимые для индукции противовирусного иммунитета, а именно влрусспецифическио В- и Т-эпитопы, и выявить пептиды, способные в свободном виде, без конъюгации с балкон-носителем, обеспечивать защиту от заболевания при заражении вирусом и пригодные для создания на их основе синтетических противовирусных вакцин.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
-
Осуществить выбор на основе теоретических методов анализа и данных литературы потенциальных имыуноактивных участков белка vpx вируса ящура. Синтезировать выбранные участки белка и их перекрывающиеся фрагменты.
-
Изучить способность свободных пептидов и их коныогатов с белком-носителем индуцировать образование противопептидных и вируснейтрализующих антител у лабораторных животных - мышей различных линий, кроликов и морских свинок, а также вызывать
защиту морских свивок от заболевания ящуром,
-
Локализовать противопептидше и противовирусные В-зпитош, а также противопептидше Т-зпктопы в последовательности иммуногенных пептидов.
-
Определить среда иммуногенных белковых фрагментов пептиды, способные индуцировать вирусспепифаческий Т-хелперный клеточный ответ.
-
На основе полученных результатов выявить пептид оптимальной структуры, включающий все иммуноактквные участки, необходимые для индукции противопептидного и противовирусного иммунного ответа и обладающий наибольший защитным эффектом на лабораторных животных.
-
Изучить способность выявленного синтетического пептида индуцировать образование противопептидвых и вируснейтрализующих антител, а также протективный иммунитет у природновоспршшчивых . к ящуру тавотных. Выбрать вид животных, для которых синтетический пептид проявляет максимальный протективный эффект. Изучить различные адъювантные системы для иммунизации животных синтетическим пептидом, выбрать адъгаант, пригодный для использования с синтетической вакциной в ветеринарии.
-
Осуществить химическую модификацию выбранного пептида, позволяющую улучшить его протектившэ . свойства. Изучить свойства модифицированного пептида на лабораторных и пріфодновоспршшчивиі к ящуру животных. Провести контрольные испытания ящурной вакцины, полученной на основе синтетического пептида в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ящурным вакцинам в ветеринарии.
Предложенные подхода были апробированы на белке vpx вируса ящура лабораторного штамма 0ХК, антигенные свойства которого наиболее подробно изучены и описаны в литературе. Затеи, на основе результатов работы по вирусу штамма 0гК, были предприняты более широкие исследования для вируса штамма А22> вакцинация против которого необходима во многих районах СНГ.
Научная новизна работы. В настоящем исследовании разработан подход к выявлению пептидных фрагментов вирусных белков, обеспечивающих протективный противовирусный иммунитет. Впервые локализованы и синтезированы пептиды последовательности иммунодошщантного района белка vPj вируса ящура штаммов 0аК и А22> способные в свободном виде, без конъюгации с белковым
носителем, индуцировать протеитивнай протевояаурный иммунитет. В последовательности іпшунодошшантного района беп"; vpt вируса штаммов OjK и А22 определены В- и Т-эпитопы. Установлена завиошость между способностью пептидов индуцировать пропшопептидшв ентитода, наличием в последовательности пептидов функционально важных участков - В- и Т- эпитопов и протективной активностью пептидов на лабораторных животных. Показано, что участок связывания антител, индуцируемых шсокоимиуноганнын пептидом, зависит от вида ишунизируешх животных, а также различается внутри одного вида. Выявлены и синтезированы ранее неизвестные фрагменты Салка vpl, не входящие в шшуводошшантныЭ район, обладающие способностью в свободной виде, без конъюгации с белковый носителей, индуцЕфовать образование противопептидных антител. Впервые опрадеяеїш участки белка vp^ вктивирущие Т-хелперные клетки, распознаваекыа вирусом. Проведенные исследования позволили синтезировать ранее не описанный высокоактивный пептвд, пригодный для создания па ого основе синтетической противоящурной вакцины.
Практическая значимость работы. На основе лщтофильного синтетического пептида - фрагмента белка vp1 вируса ящура штамма A22t совместно с Всесоюзным иаучно-исследовательсюш ящурным институтом (г.Владимир) разработан противоящуркый вакцинирующий препарат, не уступающий по эффективности действия традиционной противоящурной вакцине и пригодный для защиты овец от заболевания ящуром (вирус штамма А22). В настоящее вреия подготовлена нормативно-техническая документация на синтетическую противоящурную вакцину и препарат проходит контрольные испытания для получения разрешения на его использование в ветеринарии. Внедрение синтетической вакцины в сельское хозяйство явится первым в мировой практике примером практического использования искусственной вакцины, полученной на основе синтетического пептида.
Определенный в работе участок vpx, не входящий в основной иммуногенный район, способный' активировать вирусспецифические Т-хелперные клетки, может быть использован как "Г-клеточный" носитель протективных В-эпитопов для протиБОядурных вакцин следующего поколения. Включение этого участка в состав вакцин, получаемых как методами рекомбинантной ДНК-технологии, так и
пептидного синтеза, позволит повысить шшуногенную II протективную активность вакцин нового поколения и обеспечить индукцию вирусспецифических Т-клэтоЕ памяти, распознаваемых различными серотипами вируса ящура.
Разработанные в данной работе и апробированные для вируса ящура пути выявления высокоинмуЕОгеншх пептидов иогут быть использованы для локализации ишуноактившх участков и изучения антигенной структуры различных вирусов, содержащих последовательные В-эпитош, а ташш для внявленияния пептидов, обладающих защитный противовируснш эффектов.
Апробация полученных данных. Результаты настоящего исследования были дологены на" vi, yir, vni Всесоюзных симпозиумах "Химия пептидов н белков" (Pica, 1983, Таллин, 1987, Рига, 1990), ва 16-ой Конференции Седерацин европейских биохимических обществ (Москва, 1934), на х Американской пептидном симпозиуме (Сент-Луис, IS37), на 6-оы, 7-ои и 8-оа Советско-Западногерманских сиыпозиуыах по хшшп пептидов и белков (Гамбург, 1987; Днлиаан, 1989, Дсхен, 1991), на симпозиуме "Структура, биосинтез а функции колекуллрнах элементов иммунной системы" (Пущко, ISO1?), на Рішскод научном международном сишозиуие "Иммунологическая диагностика и имиунопрофалактика вирусов швотеых" (Грайфсвальд, 1989), на ucla симпозиуме "Технологические досткгешш в разработке вакцин" (Парк-Сити, 1988), ва 20-он и 21-ои Европейских пептидных симпозиумах (Тюбинген, 1988} Платна дчдро, 1990), на I Всесоюзном съезде иммунологов (Дагоїшс, 1989), на xiv Менделеевском съезда по обідай и прикладной химии (Ташкент, 1989) на 1-ом Израильско-Советском семинаре по пептиден к белкам (Реховот, 1990), на исіл сішпозиута "Синтетические пептида" (Ориско, 1990), на Г?-оіл iupac симпозиуме "Химия природных соединений" (Ныс-Дели, 1990).
Публикации. По ыатериалац диссертации опубликовано 37 печатных работ, в тон числе имеются 2 авторских свидетельства, I авторская заявка и два обобщающих обзора (Журнал всесоазного химического общества им. Д.И.Шнделаева, 1988; Bioaedicai
Science, 1990).
