Содержание к диссертации
Введение
1. Создание структурно-функциональных моделей каталитических центров природных нуклеаз (обзор литературы) 7
1.1. Конструирование искусственных нуклеаз 7
111 Механизм гидролитического расщепления РНК 8
112 Механизм гидролитического расщепления ДНК 9
113 Основные структурные элементы активных центров нуклеаз 9
114 Создание аналогов каталитических центров металлонезависимых ферментов и 114 1 Моделирование каталитических центров нуклеаз (искусственные нуклеазы на основе аминокислот и пептидов) . 12
1.1.4.2. Создание моделей нуклеаз (объединение в одной молекуле связывающего и каталитического центров) . 18
2 1. Химические нуклеазы с интеркалятором в качестве связывающего домена 18
2 2 Химические нуклеазы, содержащие поликатионные рнк-связывающие фрагменты 23
115 Моделирование каталитических центров металлозависимых ферментов 29
115 1 Механизмы активации фосфатной группы ионами металлов 29
1.1 5 2 Химические нуклеазы на основе моноядерные металлокомплексов . 31
115 3 Химические нуклеазы на основе биядерных комплексов . 37
115 4 Химические нуклеазы на основе трехядерных металлокомплексов .. 40
1 2 Методы изучения каталитической активности соединений, гидролизующих р-0 связи в различных субстратах ... . 43
121 Качественные методы детекции расщепления р-0 связей 43
12 2 Спектрофотометрический анализ в изучении активности химических нуклеаз 45
12 3 Изучение нукпеазной активности с использованием флуоресцентно-меченых субстратов 50
12 4 Хроматографические методы анализа в изучении нуклеазной активности 54
12 5 Исследования нуклеазной активности с помощью метода 3,р ямр 58
12 6 Испочъзование радиоактивно-меченых субстратов в изучении нуклеазной активности 59
Глава 2. Результаты и их обсуждение 62
2 1 Влияние длины гидрофобного радикала на эфф1 ктивность искусственной рибонуклеазы . 62
2 2 Конструирование структурно-функциональных аналогов каталитических цтнтров природных рибонуклеаз 67
221 Конструирование и синтез тетрапептидов, на основе аминокислот, формирующих каталитический центр 69
2 2 2 Гидролитическая активность рнказомиметиков серий f, к, r 73
2 2 3 Синтез симметричных пептидов, содержащих внутри структуры протяженный линкер 76
22 4 Рибонуклеазная активность пептидоподобных соединений серий i/ и l2 79
2 31 Синтез производных пептидов r- и к-серий, содержащих остаток 1,4-
диазабицикло[2 2 2]октана . $2
2 3 2 Рибонуклеазная активность производных пептидов r- и к-серий, содержащих остаток dabco 83
2 3 3 Синтез антрацен-пептидных конъюгатов 84
2 3 4 Рибонуклеазная активность антрацен пептидных конъюгатов 85
2 4. Сравнение рибонуклеазной активности соединений различных серий 86
2 5. Влияние структурных параметров рнк-мишени на специфичность
связей в присутствии низкомолекулярных рнказомиметиков.. 90
2.6 Взаимосвязь "структура - каталитическая акіивность" в рядах различных искусственных рибонуклеаз . . . 95
Глава 3. Экспериментальная часть 102
3 2 Методы . 102
Выводы 121
Благодарности 123
Список литературы
- Механизм гидролитического расщепления РНК
- Изучение нукпеазной активности с использованием флуоресцентно-меченых субстратов
- Конструирование и синтез тетрапептидов, на основе аминокислот, формирующих каталитический центр
- Сравнение рибонуклеазной активности соединений различных серий
Введение к работе
Молекулы РНК обеспечивают функционирование любого живого организма, выполняя множество разнообразных функций от переноса генетической информации до катализа биохимических реакций. Реагенты, избирательно взаимодействующие с определенными видами РНК, могут служить в качестве регуляторов экспрессии генов, а также противовирусными агентами, инактивирующими РНК-содержащие вирусы
Известен широкий спектр реакционноспособных соединений, вызывающих расщепление РНК в физиологических условиях [1]. Для этой цели используются ионы металлов и металлокомплексы [2, 3], аминосоединения [4, 5] и органические соединения, содержащие остатки имидазола [6, 7], а также конструкции на основе пептидов [8, 9] Несмотря на обилие сообщений о синтезе химических рибонуклеаз до настоящего времени не удалось получить конструкций, обладающих активностью близкой к активности природных ферментов. Зачастую эффективными оказались реагенты, обладающие высокой токсичностью, что делает применение таких соединений в биологических системах малоперспективным.
Одной из наиболее перспективных стратегий создания искусственных рибонуклеаз является конструирование низкомолекулярных синтетических катализаторов, функционально моделирующих каталитические центры или имитирующих процессы, протекающие в активных центрах природных ферментов, которые расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК
Структурный анализ активных центров природных ферментов [10] приводит к обнадеживающему выводу. Ферменты бесконечно вариабельны по структурам аффинных центров, но в значительной степени консервативны по структурам каталитических центров Опираясь на знания по строению каталитических центров ферментов и механизмам их функционирования, при использовании современного арсеншіа органической химии можно создавать высокоэффективные синтетические катализаторы расщепления РНК.
Целью настоящей работы являлось создание низкомолекулярных синтетических конструкций на основе коротких пептидов, функционально имитирующих каталитический центр рибонуклеазы ТІ.
В ходе исследования решались следующие задачи: • конструирование и синтез органических соединений, содержащих аминокислоты, функциональные группы боковых радикалов которых входят в состав каталитического центра рибонуклеазы ТІ;
• конструирование и синтез конструкций, объединяющих в своей структуре каталитический и РНК-связывающий фрагменты;
• установление взаимосвязи "структура - рибонуклеазная активность" в ряду различных искусственных рибонуклеаз.
Механизм гидролитического расщепления РНК
Перспективным подходом к созданию химических нуклеаз является дизайн функциональных аналогов природных ферментов, расщепляющих фосфодиэфирные связи в нуклеиновых кислотах. Для конструирования таких нуклеазомиметиков требуются данные, как о строении каталитических центров ферментов, так и о механизмах их функционирования. Строение природных белковых катализаторов определяется кодируемыми аминокислотами, функциональные группы боковых радикалов которых и формируют каталитические центры. Вследствие этого, наиболее очевидный путь создания искусственных нуклеаз - конструирование структурно-функциональных аналогов каталитических центров природных ферментов на основе коротких пептидов или пептидоподобных молекул. В тоже время современная органическая химия располагает гораздо более разнообразным набором реакционноспособных групп, обладающих химическими свойствами того или иного аминокислотного остатка, что позволяет создавать функциональные аналоги каталитических центров нуклеаз по строению имеющих мало общего с их природными аналогами
При конструировании второго важного структурного элемента искусственных нуклеаз - субстрат-связывающего домена используются два основных подхода С одной стороны, это применение природных соединений, обладающих сродством к определенным структурным элементам нуклеиновых кислот (олигонуклеотиды, аргинин богатые пептиды или некоторые антибиотики), либо неприродные соединения с аналогичными свойствами (интеркаляторы, поликатионы различной структуры, неприродные аналоги олигонуклеотидов).
Другим подходом к поиску катализаторов гидролиза фосфодиэфирных связей является синтез комбинаторных библиотек потенциальных нуклеазомиметиков Несмотря на то, что приемы и методы комбинаторной химии широко используются при поиске различных физиологически активных веществ [11, 12], данный подход при создании искусственных нуклеаз пока не получил широкого распространения. В основном поиск ведется среди комбинаторных библиотек коротких пептидов и пептидоподобных молекул на основе неприродных (некодируемых) аминокислот и их комплексов с различными ионами металлов [13-15]. Серьезной проблемой при использовании комбинаторного подхода является изучение большого числа соединений на требуемую активность, что делает практически невозможным использование для этих целей природных субстратов
В настоящем обзоре основное внимание уделено двум аспектам создания искусственных нуклеаз - конструированию активных центров нуклеазомиметиков и поиску удобных субстратов для изучения их каталитической активности
Механизм гидролитического расщепления РНК Наличие в структуре РНК 2 -гидроксильных групп приводит к тому, что гидролитическое расщепление этих биополимеров в основном протекает по механизму внутримолекулярной переэтерификации. Расщепление РНК по этому механизму распространено в природе, например в реакциях, катализируемых рибонуклеазами и рибозимами [16]
Наиболее детально изученными металлонезависимыми рибонуклеазами являются рибонуклеаза А и рибонуклеаза ТІ. Установлено, что оба фермента расщепляют фосфодиэфирные связи в РНК по механизму внутримолекулярной переэтерификации, в основе которой лежит кислотно-основной катализ. Схема «классического» двухступенчатого механизма [17] гидролиза фосфодиэфирных связей в рибонуклеиновых кислотах РНКазой А с участием кислотно-основного катализа приведена на рис. 1. н-в н-в н-чі н
В отличие от РНК, для гидролиза ДНК необходимо наличие внешнего нуклеофила В качестве последнего могут выступать молекула воды, гидроксид анион или нуклеофильный центр каталитического сайта ДНК-гидролизующего фермента (R-OH, R SH). На рис. 2 представлена схема гидролиза ДНК под действием гидроксид аниона. Общепринятый механизм гидролиза ДНК заключается в нуклеофильной атаке атома фосфора с образованием пятикоординированного переходного состояния [18,19].
Прогресс, достигнутый в области установления строения и изучения механизмов действия природных ферментов, гидролизующих Р-0 связи в различных субстратах, нашел отражение в серии обзоров, опубликованных в последние годы [20-23] Структурный анализ активных центров показал [24], что ферменты бесконечно вариабельны по структурам аффинных центров, но в значительной степени консервативны по структурам каталитических центров.
В результате взаимодействия между функциональными группами боковых радикалов аминокислот в белковых катализаторах формируются сложные третичные структуры, определяющие строение различных функциональных доменов ферментов Наиболее часто в каталитических центрах нуклеаз встречаются гистидин, лизин, аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислота, а также гидроксилсодержащие аминокислоты. Каталитические центры ферментов в большинстве случаев содержат различное число ионов металлов. Значительно реже встречаются ферменты, как правило, рибонуклеазы, активные центры которых не содержат ионов металлов.
В таблице 1 представлены статистические данные об участии некоторых аминокислот в каталитических центрах различных ферментов [25].
На основе анализа аминокислотных остатков, входящих в активные центры гидролаз, были выявлены четыре типа доменов, ответственных за активацию молекулы воды (или гидроксильной группы) и четыре типа доменов, ответственных за повышение электрофильности атома фосфора.
Считается [10], что в каталитических центрах гидролаз активаторами нуклеофильной частицы являются: имидазол (часто сопряженная пара имидазол-карбоксилат) карбоксильная группа в депротонированной форме электронейтральные комплексы ионов металлов (Mg2+, Мп2+) положительно заряженные комплексы ионов Zn2+, Ni2+ и Со2+. При ферментативном гидролизе нуклеиновых кислот повышение электрофильности атома фосфора обусловлено снижением электронной плотности на атомах кислорода фосфатной группы, что достигается:
Изучение нукпеазной активности с использованием флуоресцентно-меченых субстратов
Гидролиз динуклеотидов с последующим разделением продуктов реакции с помощью ВЭЖХ широко используемый метод для изучения активности рибонуклеаз [168-170] Так в работе [171] изучался гидролиз динуклеотидов Ар А и GpA цитотоксичным белком u-сарцин Гидролиз 3 -5 фосфодиэфирной связи этих субстратов приводит к 2 -3 -циклофосфатмононуклеотиду, этот интермедиат превращается в соответствующее З -монофосфатное производное - конечный продукт реакции. Рассчитаны константы Михаэлиса, Arcat и kcJKm Используя динуклеотидные модельные субстраты, авторы показали, что а-сарцин действует по двухступенчатому механизму с образованием циклического интермедиата аналогично механизму РНКазы А.
В работе [172] авторы предположили, что аминогликозидный антибиотик неомицин В может ускорять гидролиз фосфодиэфирных связей аналогично простым аминам В качестве субстрата выбран динуклеотид АрА Гидролиз АрА в присутствии неомицина В, 1,3-диаминопропана и З-аминопропанола-1 исследовали обращенно-фазовой ВЭЖХ, измеряя скорость накопления аденозина Реакцию гидролиза рассматривали как реакцию псевдопервого порядка и константу скорости рассчитывали исходя из этого условия Неомицин В ускоряет фосфодиэфирный гидролиз более эффективно, чем простой неструктурированный диамин - 1,3-диаминопропан Помимо кинетических измерений, в данной работе изучены продукты гидролиза Показано, что реакция протекает через образование аденозин-2 ,3 -цикломонофосфата и его последующей деградации до аденозин-2 -фосфата и аденозин-З -фосфата.
В работе [173] изучали гидролитическую активность рибозосодержащих полимеров В качестве субстрата помимо ENPP (рис 42) использовали dApdA Если в случае нитрофенилового субстрата определяли скорость гидролиза, то с помощью расщепления динуклеотида изучали механизм процесса. Исследование реакционной смеси обращенно-фазовой ВЭЖХ позволяет установить продукты гидролиза Динуклеотид dApdA гидролизуется, давая 2 -дезоксиаденозин (dA), 2 -дезоксиаденозин-3 -фосфат (dAp) и 2 -дезоксиаденозин-5 -фосфат (pdA)
В работе [174] изучали гидролиз ТрТ комплексом Zr4+ с ЭДТА Этот динуклеотидный субстрат расщепляется до двух эквивалентов тимидина и фосфата; при этом детектируются только следы интермедиатов тимидин-З -фосфата и тимидин-5 -фосфата, что говорит о быстром гидролизе моноэфиров
В работе [72] исследовали гидролиз динуклеозидмонофосфата СрА синтетическими РНКазами и РНКазой А За протеканием гидролиза следили с помощью обращенно-фазовой ион-парной ВЭЖХ На начальной стадии во всех реакциях наблюдали образование аденозина и 2 ,3 -циклофосфата цитидина В случае РНКазы А одновременно с образованием циклофосфата происходит его дальнейший гидролиз до цитидин-3 -фосфата В случае химических рибонуклеаз происходит лишь незначительное накопление цитидин-З -фосфата Вероятно, в отличии от РНКазы А, синтетические аналоги не могут с высокой эффективностью связываться с 2 ,3 -циклофосфатом цитидина и реакция гидролиза останавливается на этой стадии.
Конструкции, содержащие в своем составе и расщепляемую связь, и каталитически активные группы, интересны для изучения, поскольку в этом случае исключается первая стадия процесса - образование комплекса между катализатором и субстратом Таким образом, можно исследовать непосредственно каталитический процесс и корректнее сравнивать эффективность катализаторов
В работе [175] синтезированы динуклеотиды, содержащие имидазол и этилендиамин в своей структуре (рис 56), и изучен внутримолекулярный катализ гидролиза Р-0 связей в присутствии ионов Zn"1"
Ион Zn2+ катализирует саморасщепление только конъюгата 127 Остальные структуры оказались неактивны Скорость гидролиза в случае активного конъюгата в 10-15 раз превышает скорость гидролиза немодифицированного динуклеотида. Гидролиз 127 протекает по механизму, аналогичному ферментативной реакции гидролиза. Zn"+ выполняет роль имидазолия (His 119) в РНКазе А, а присоединенный имидазол - роль His 12. Первичным продуктом химической реакции, как и в случае рибонуклеазы, является циклический фосфодиэфир Вторая стадия гидролиза с образованием 2 - и 3 -уридинмонофосфатов протекает значительно медленнее стадии трансфосфорилирования
Хроматографический анализ не является распространенным методом в изучении нуклеазной активности Однако, в случае небольших субстратов хроматографический анализ реакционных смесей является удобным методом, позволяющий не только оценивать скорость гидролиза, но и устанавливать продукты реакции.
Исследования нуклеазной активности с помощью метода 31Р ЯМР ИспользованиеJ Р-ЯМР спектроскопии позволяет получить обширную информацию о протекании реакции гидролиза. Так в работе [ 176] наблюдали образование аденозина, 2 - и 3 -монофосфатов и А р в случае гидролиза АрА в присутствии этилендиамина
В работе [177] метод был использован для изучения реакции бис(гуанидиний)диола 135 с циклическим фосфодиэфиром 134 и установления механизма внутримолекулярно катализируемого гидролиза соединения 136 (рис. 58). В процессе реакции протекают несколько этапов трансфосфорилирования. В частности, изучена стадия образования циклофосфата. Показано, что соединение 139 (оно является конечным продуктом реакции) образуется преимущественно циклизацией соединения 137 Наблюдаемая константа скорости реакции псевдопервого порядка этого процесса 1 3 10г мин Использование 3 Р-меченых олигонуклеотидов в качестве субстратов - сложная процедура, требующая больших временных затрат и наличие определенной техники Этот подход включает в себя синтез радиоактивно меченых субстратов, электрофоретическое разделение продуктов реакции и дальнейший анализ полученных радиоавтографов.
Тем не менее, использование радиоактивно меченых субстратов по-прежнему наиболее востребованный метод в изучении расщепления РНК и ДНК. Этот метод позволяет изучать гидролиз сложных объектов, определять специфичность расщепления природных субстратов Зачастую к нему обращаются на завершающем этапе скрининга
Для изучения каталитической активности различных полиаминов (спермин, сиермидин, путресцин и др) в работе [178] были выбраны радиоактивно меченые семизвенный олигонуклеотид UCGUAA pCp и 5 -32Р-тРНКМе1 из Escheiiclua colt. С использованием олигорибонуклеотида были определены кинетические параметры расщепления в присутствии различных полиаминов Кроме того, изучена зависимость скорости расщепления от концентрации аминов Показано, что для эффективного расщепления требуется наличие по-крайней мере двух аминогрупп, поскольку под действием аминоспиртов расщепление фосфодиэфирных связей не наблюдалось Расщепление в олигонуклеотиде происходило по UpA связи. Эксперименты по расщеплению тРНКМе позволили определить специфичность гидролиза полиаминами. Специфический гидролиз фосфодиэфирных связей наблюдается предпочтительно в UpA и СрА последовательностях одноцепочечных участков
Конструирование и синтез тетрапептидов, на основе аминокислот, формирующих каталитический центр
В данной работе синтезирована серия коротких пептидов, содержащих следующие аминокислоты в различных комбинациях Arg, Glu, Ser, Thr, Lys и Phe (серия F , химическая структура всех соединений представлена в приложении) Аминокислотный состав каталитических центров РНКазомиметиков был выбран таким образом, чтобы при нейтральных значениях рН каждая из аминокислот могла с высокой долей вероятности выполнять одну определенную функцию Поскольку гидроксильная группа тирозина может играть роль кислотно-основного катализатора, тирозин был заменен серином и схожим с ним по строению, но существенно отличающийся по функциям в каталитических центрах, треонином (табл 9) В качестве С-концевой аминокислоты синтезируемых тетрапептидов был выбран фенилаланин, входящий в состав каталитического центра РНКазы ТІ Кроме того, фенилаланин является гидрофобной аминокислотой, что существенно облегчает выделение промежуточных ди- и трипептидов На первом этапе были синтезированы шесть тетрапептидов, содержащих, помимо фенилаланина, функционально значимые аминокислоты в различных комбинациях
Для выявления роли отдельных аминокислотных остатков были синтезированы две серии РНКазомиметиков, содержащих в структуре два аминокислотных остатка, несущих разнозаряженные каталитически активные группы (карбоксильная, амино- или гуанидиниевая), расстояние между которыми изменяли путем введения в качестве линкера каталитически инертных аминокислот (X). Каждая серия содержала по 5
Серии синтезированных соединений названы по аминокислоте, присутствующей в структуре всех пептидов данной серии F - фенилаланин, К- лизин, R-аргинин пептидоподобных соединений (структуры всех синтезированных в данной работе РНКазомиметиков представлены в приложении). Glu - X - Arg - Gly - ОС10Н21 (пептиды 12-16) Серия R Glu - X - Lys - Gly - OC10H21 (пептиды 17-21) Серия К где X - Gly (12, 17), (3-Ala (13, 18), 4-аминобутановая кислота (GABA, 14, 19), 6-аминогексановая кислота (AHA, 15, 20), л-аминобензойная кислота (ABA, 16, 21)
С-концевая аминокислота синтезированных пептидов присутствовала в виде октилового (или децилового) эфира Ранее было показано [74], что введение гидрофобного алкильного остатка существенно увеличивает активность искусственных РНКаз Природа этого явления до конца не выяснена, однако было показано, что это не связано с мицеллярным катализом, поскольку эффективный катализ расщепления РНК наблюдался при концентрациях много меньших, чем требуется для мицеллообразования [186]
Для получения соединений, имитирующих каталитические центры природных рибонуклеаз, нами был синтезирован ряд активированных /V-гидроксисукцинимидных эфиров защищенных аминокислот Исключением являлся бензиловый эфир iV-Boc-L-глутаминовой кислоты, активированный УУ-гидроксисукцинимидный эфир которой не удалось выделить в чистом виде В связи с этим для введения в пептид глутаминовой кислоты синтезировали я-нитрофениловый активированный эфир или использовали N-гидроксисукцинимидный эфир в реакции конденсации без дополнительной очистки (не выделяя его в индивидуальном состоянии) Синтез активированных эфиров проводили по стандартной методике [187], используя в качестве конденсирующего реагента дициклогексилкарбодиимид
Синтез тетрапептидов проводили в растворе с использованием Вое-стратегии С-концевую аминокислоту (Phe или Gly) алкилировали 1-бромоктаном или 1-бромдеканом. Введение такой гидрофобной защиты значительно облегчает процедуру выделения и очистки продукта реакции на каждой стадии Общая схема синтеза представлена на рис 66
Защитные группы для боковых радикалов аминокислот выбирали таким образом, чтобы деблокирование конечного продукта можно было осуществить в одну стадию. Удаление Л нитро- и 0-бензильной защитных групп с функциональных групп боковых цепей аминокислот в тетрапептидах проводили путем каталитического гидрогенолиза. Основные характеристики полученных соединений приведены в главе 3 Чистоту промежуточных продуктов и полноту протекания реакций контролировали с помощью ТСХ Строение целевых соединений было подтверждено методами спектроскопии ЯМР Н На рис 67-69 приведен пример интерпретации Н ЯМР спектров начального и промежуточных продуктов в синтезе пептида серии К (GIu-PAIa-Lys-Gly-OCioH2i)
В ряде случаев для корректного отнесения сигналов в спектрах ЯМР Н применяли метод двумерной (COSY) спектроскопии (данные не приведены) Для всех пептидов до и после деблокирования функциональных групп получены корректные MALDIOF масс-спектры (глава 3) Тетрапептиды, по-видимому, образуют прочные комплексы со щелочными металлами, поскольку в масс-спектрах, помимо сигналов молекулярных ионов, наблюдаются интенсивные сигналы комплексов тетрапептидов с ионами Na+, Li+
Гидролитическая активность синтезированных искусственных рибонуклеаз была исследована в Лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН. Эксперименты проводились Н В. Тамковичем и Н А Ковалевым под руководством д б н. М А Зенковой В качестве субстрата были использованы [5 -32Р]-меченый 96-звенный фрагмент РНК HIV-I, полученный реакцией транскрипции in vitro (рис 70А) и 21-звенный синтетический олигорибонуклеотид (рис. 70В) Вторичная структура этого олигонуклеотида представляет собой шпильку, стебель которой идентичен аминоакцепторному стеблю дрожжевой тРНКРЬе, а последовательность петли UCCACAG представляет собой фрагмент 59-65 той же тРНК, особенно чувствительный к расщеплению природными и химическими рибонуклеазами [188]
Сравнение рибонуклеазной активности соединений различных серий
К настоящему моменту предложено большое количество искусственных рибонуклеаз различного строения. Однако прямое сравнение активности РНКазомиметиков по ряду причин невозможно Исследователями проводились отдельные попытки установления взаимосвязи структура - активность, но только в пределах одной серии химических нуклеаз [74] В рамках данной работы нами предпринята попытка провести корреляции структура - свойства на примере РНКазомиметиков различной природы, синтезированных в лаборатории органического синтеза ИХБФМ СО РАН
Для работы были отобраны следующие серии искусственных рибонуклеаз Структурно-функциональные аналоги каталитического центра рибонуклеазы А [47, 52] ди- и трипептиды, содержащие в своем составе гистидин или гистамин, а также положительно заряженные аминокислоты (Lys и Arg)
Структурно-функциональные аналоги каталитического центра рибонуклеазы ТІ, предложенные в настоящей работе (глава 2.2.1). 1. Короткие пептиды, содержащие в различных комбинациях следующие аминокислоты Arg, Glu, Ser, Thr, Lys, Phe.
Тетрапептиды, содержащие отрицательно заряженную (Glu) и положительно заряженные (Lys/Arg) аминокислоты, разделенные линкерами различной длины РНКазомиметики, состоящие из четырех функциональных доменов каталитического и РНК-связывающего центров, соединенных между собой линкерной группой, а также протяженного алифатического фрагмента [69, 70, 74] Часть соединений синтезированы в данной работе (глава 2 2.4).
Связанные различными линкерами два остатка кватернизованного 1,4-диазабицикло[2 2 2]октана с алкильными заместителями различной длины [193] Данная серия предполагает принципиально другой механизм расщепления РНК, основанный на ускорении ее самопроизвольного гидролиза вследствие искажения структуры под воздействием поликатионных молекул [193].
Каталитическая активность большинства РНКазомиметиков исследовалась на примере взаимодействия с тРНК различной природы (TPHKASP [74], TPHKLys [47, 74], тРНКРЬс [69, 194]). С целью установления влияния строения РНК-субстратов на эффективность гидролиза фосфодиэфирных связей в качестве мишеней также использовались синтетические (ди- [48, 73] и олигорибонуклеотиды [48, 73, 195] различной длины) и природные рибонуклеиновые кислоты (96-звенный фрагмент РНК HIV I (Глава 2.2 2), фрагмент мРНК белка М2 вируса гриппа [195], тРНК-подобный фрагмент РНК вируса желтой мозаики турнепса [47])
Разнообразие РНК-субстратов и условий тестирования каталитической активности делает невозможным прямое сопоставление между собой всех синтезированных искусственных рибонуклеаз, что, в сочетании с разнообразием структур исследованных соединений, затрудняет установление общих закономерностей "структура каталитическая активность"
В настоящей работе предприняты первые попытки определения молекулярных структурных характеристик, ответственных за гидролитическую активность изученных РНКазомиметиков В качестве основного инструмента для исследования связи структура-активность был использован QSAR подход на основе симплексного представления молекулярной структуры [196, 197] Математические расчеты были проведены кхн Муратовым Е Н. при консультациях кхн Артеменко А Г в лаборатории теоретической химии Физико-химического института им А.В Богатского НАН Украины (г Одесса) под руководством д.х н. Кузьмина В Е
Всего в работе было рассмотрено 107 структур, из них в обучающие выборки вошло 64 соединения показавших гидролитическую активность по отношению к одному или нескольким основным РНК-субстратам.
В примененном методе для описания молекулярной структуры используются симплексные дескрипторы, отражающие количество четырехатомных фраї ментов (симплексов) фиксированной структуры, симметрии и хиральности В рамках данного представления возможен учет не только природы атома, но и ряда других характеристик (например, заряд, липофильность), важных для проявления биологической активности соединения (рис 94)
Важными преимуществами симплексного метода являются: - возможность анализа в пределах одной выборки молекул, которые значительно отличаются по структуре; - возможность выявления в ряду исследуемых молекул общих фрагментов структуры (комбинаций симплексов) как способствующих, так и препятствующих проявлению активности.
Для построения статистических зависимостей мы использовали метод частичных наименьших квадратов (PLS) [198]. Наряду с симплексными дескрипторами использовался ряд интегральных параметров, описывающих свойства молекулы в целом [199]. В частности, были задействованы вероятности проявления разных видов биологической активности, рассчитанные с помощью программы PASS .
Качество полученных статистических моделей, полученных PLS-методом вполне удовлетворительное (таблица 11).
В результате анализа данных QSAR моделирования (на выборке из 64 соединений) определены молекулярные фрагменты структуры, способствующие и препятствующие появлению требуемой активности (табл 12).
Вклад молекулярных фрагментов в активность искусственных рибонуклеаз зависит от структуры субстрата, используемого в тестировании Как видно из таблицы 12 в случае 21-звенного олигонуклеотида и TPHKASP определенные участки молекулы вносят заметный вклад в проявление рибонуклеазной активности В случае 96-звенного фрагмента РНК HIV I для проявления активности важно не столько наличие или отсутствие определенных структурных фрагментов, сколько структура молекулы в целом
Эти расчетные данные согласуются с результатами, полученными экспериментально Было показано [73], что в случае коротких РНК эффективность расщепления фосфодиэфирных связей искусственными рибонуклеазами невелика, тогда как на более длинных субстратах те же соединения оказались в десятки раз активнее
На примере 21-звенного олигонуклеотида видно, что влияние функциональных групп, формирующих каталитические центры природных ферментов (гуанидиниевая (1), гидроксильная (6 и 25) группы), а также амидного фрагмента (21) оказалось отрицательным. Кроме того, неоднозначное влияние на каталитическую активность оказывает и имидазольныи фрагмент Ароматические фрагменты 18-20 также понижают активность исследуемых соединений по отношению к 21-звенному олигонуклеотиду
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")