Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы: «определение структуры т-хелперных эпитопов и создание синтетических пептидных конструкций, содержащих эпитопы в-клеток и т-хелперных клеток»
1.1. Развитие иммунного ответа на введение пептидного фрагмента 7
1.2. Определение структуры Т-хелперных эпитопов. 9
1.2.1. Определение структуры Т-эпитопов с помощью рентгеноструктурного анализа.
1.2.2. Изучение связывания природных и синтетических пептидов с молекулой МНС II для определения структуры Т-эпитопов .
1.2.3. Теоретические методы предсказания потенциальных Т-эпитопов. 24
1.3. Синтетические пептидные конструкции, включающие в себя эпитопы В-клеток и Т-хелперных клеток
1.3.1. Введение Т-хелперных эпитопов в состав линейных пептидов. 31
1.3.2. Мультиантигенные пептидные комплексы, содержащие Т-хелперные эпитопы
1.3.3. Липопептидные конструкции, содержащие Т-хелперные эпитопы. 42
2. Результаты и обсуждение 46
2.1. Разработка метода предсказания аминокислотной 47
последовательности пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей.
2.1.1. Анализ данных литературы о структуре Т-хелперных эпитопов и выявление общих закономерностей .
2.1.2. Применение условия 1-9 для анализа базы данных МНСРЕР 49 Т-хелперных эпитопов.
2.1.3. Применение условия 1-9 для анализа структуры ранее описанных пептидов.
2.2. Выбор иммуногенных пептидов в последовательностях белков ОраВ и NspA Nesseria meningitidis и белков Е и NS1 вируса клещевого энцефалита.
2.3. Моделирование иммуногенных пептидов из неактивных белковых последовательностей с использованием условия 1-9.
2.3.1. Создание высокоиммуногенных пептидов на основе неактивного фрагмента 223-242 и низкоактивного фрагмента 233-252 белка РогА Nesseria meningitidis.
2.3.2. Создание высокоиммуногенного пептида на основе низко активного фрагмента 346-363 белка РогА Nesseria meningitidis.
2.3.3. Создание иммуногенного пептида на основе неактивного фрагмента 178-199 белка РогА Nesseria meningitidis.
2.3 А. Создание иммуногенных пептидов на основе неактивного фрагмента 197-213 белка VPi вируса ящура
2.3.5. Исследование активности укороченного фрагмента 130-143 белка РогА Nesseria meningitidis, содержащего участок 1-9.
2.3.6, Создание иммуногенных пептидов на основе неактивного фрагмента 273-292 белка РогА Nesseria meningitidis.
2.4. Создание пептидных конструкций на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура
2.5. Иммуногенные и протективные свойства синтетических пептидных конструкций.
2.5.1. Способность пептидных конструкций индуцировать образование антител у мышей.
2.5.2. Сравнение иммуногенных и протективных свойств пептидных конструкций на морских свинках.
2.5.3. Изучение протективной активности пептидной конструкции III на свиньях.
2.5.4. Изучение иммуногенных и протективных свойств синтетической пептидной конструкции IV.
3. Экспериментальная часть 89
3.1. Химические реагенты и биологические препараты 89
3.2. Оборудование 90
3.3. Животные 91
3.4. Приготовление растворов пептидов для иммунизации 91
3.5. Получение сывороток крови 91
3.6. Иммунизация животных 92
3.7. Твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой метод) 95
3.8. Антигензависимая пролиферация клеток периферических лимфоузлов мышей, праймированных конструкцией IV.
3.9. Определение титра вируснейтрализующих антител 101
3.10. Исследование протективной активности. 101
3.11. Определение величины ПДы конструкции IV. 103
4. Выводы 104
5. Список литературы
- Изучение связывания природных и синтетических пептидов с молекулой МНС II для определения структуры Т-эпитопов
- Анализ данных литературы о структуре Т-хелперных эпитопов и выявление общих закономерностей
- Создание пептидных конструкций на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура
- Твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой метод)
Введение к работе
Способность пептидных фрагментов белков в свободном виде индуцировать образование антител имеет большое значение для создания пептидных противовирусных и антибактериальных вакцин, разработки диагностических тест-систем, а также получения противобелковых антител для научных исследований [1-4]. Обычно используемый для индукции противопептидных антител метод конъюгации пептидов с белком или другим высокомолекулярным носителем сопровождается рядом нежелательных процессов, таких как высокий уровень образования антител к носителю и индукция долговременной Т-клеточной памяти на чужеродный белок-носитель [5]. В связи с этим особый интерес вызывают пептидные последовательности, способные вызывать образование антител in vivo без конъюгации с белковым носителем.
В соответствии с представлениями современной иммунологии необходимым условием образования противопептидных антител является наличие в пептидной последовательности белкового антигена Т-хелперного эпитопа. Т-хелперный эпитоп участвует в образовании тройного комплекса с молекулой МНС IIі и Т-клеточным рецептором, что приводит к активации Т-хелперных клеток и к стимуляции продукции антител В-клетками. Существующие на данный момент способы теоретического предсказания расположения Т-хелперных эпитопов в белковых последовательностях основаны на результатах опытов in vitro, а в опытах in vivo не всегда обладают достаточной эффективностью и достоверностью. Поэтому одним из наиболее важных подходов к моделированию иммуногенных пептидов, способных в свободном виде индуцировать образование антител, является разработка простых и доступных методов предсказания расположения Т-хелперных эпитопов в молекуле белка, которые позволили бы быстро и эффективно выявлять в последовательности иммуногенные
МНС II - молекула главного комплекса гистосовместимости класса II. участки, а также открыли бы возможности повышения иммуногенных свойств пептидов путем точечных изменений в их структуре.
Другим подходом к моделированию иммуногенных пептидов является создание пептидных конструкций, включающих известные В-клеточные и Т-хелперные эпитопы белка, с помощью которых можно имитировать развитие протективного иммунитета к различным патогенам. Для применения этого подхода необходимы знания о локализации иммуноактивных участков в аминокислотных последовательностях белков изучаемого патогена и сравнительный анализ свойств различных вариантов конструкций для выбора соединений, наиболее эффективно имитирующих развитие протективного иммунитета.
Настоящее исследование посвящено моделированию иммуногенных пептидов, заключающемуся в разработке эффективного метода предсказания последовательности пептидов, способных индуцировать выработку противопептидных антител у мышей без конъюгации с белком-носителем; применению разработанного метода для выбора иммуногенных фрагментов в последовательностях белков различных возбудителей и моделированию иммуноактивных пептидов на основе неактивных. Целью исследования также являлась разработка конструкций на основе иммуноактивных пептидных фрагментов белка VPj вируса ящура, обеспечивающих эффективный противовирусный иммунитет.
В обзоре литературы рассмотрены данные о современном состоянии методов идентификации участков последовательностей белковых молекул, способных взаимодействовать с молекулами МНС II и активировать Т-хелперные лимфоциты. Также рассмотрены описанные в литературе основные подходы к созданию иммуногенных пептидных конструкций, содержащих В- и Т-хелперные эпитопы.
Изучение связывания природных и синтетических пептидов с молекулой МНС II для определения структуры Т-эпитопов
Общая схема развития иммунного ответа на введение синтетического пептида выглядит следующим образом. Синтетический пептид через специфический к нему рецептор проникает внутрь антигенпредставляющей клетки — АПК (макрофага, дендритной клетки, В-лимфоцита и др.) [б, 7]. В случае пептида роль АПК чаще всего играют В лимфоциты, которые связывают его своим антигенраспознающим рецептором [8, 9]. После эндоцитоза пептидный фрагмент взаимодействует с ту молекулой МНС П. Молекулы МНС II человека кодируются генами HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP, а молекулы МНС II мыши кодируются генами Н-2Б и Н-2А. Молекула МНС II состоит из полипептидных цепей аир, которые имеют сходный размер [10]. Полипептидные цепи а и Р образуют антигенпредставляющую полость [11]. С целю предотвращения преждевременного связывания антигенпредставляющей полости МНС с пептидом инвариантная цепь К взаимодействует с МНС II фрагментом 106-120 (Class II associated invariant chain peptide, CLIP) [12]. Антигенпредставляющая полость открыта с обоих концов, при этом пептид заякорен в нескольких местах вдоль всей полости и прилежит к ее дну. При связывании пептидного фрагмента с молекулой
МНС II блокируется его последующий протеолиз [13]. Кроме того, у молекулы МНС II имеется участок повышенного сродства к вспомогательной молекуле С04+Т-хелпера, участвующей в стабилизации тройного комплекса, способствующей представлению антигенных пептидов Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов [14].
Образовав с молекулой МНС П устойчивый комплекс, пептид экспрессируется на поверхности АПК, а затем этот комплекс распознается рецепторами специфических клонов Т-хелперных лимфоцитов. Участок пептидной последовательности, связывающийся с МНС П, называется агретопом, или МНС-лигандом, а участок, взаимодействующий с рецептором Т-лимфоцита - Т-хелперным эпитопом. В дальнейшем, термины «Т-хелперный эпитоп» и «МНС-лиганд» будут использованы в тех случаях, когда говорится конкретно о связывании пептидов с Т-хелпером или с молекулой МНС. В остальных случаях, поскольку Т-эпитоп и МНС-лиганд всегда расположены в одном и том же участке пептидной последовательности, то в соответствии с общепризнанной терминологией будет применяться общее название «Т-эпитоп». лимфоцит при участии вспомогательной молекулы CD4+ распознает своим специфическим рецептором соответствующий Т-эпитоп в комплексе пептида с МНС П и образует тройной комплекс с пептидом и молекулой МНС II [10]. В результате этого взаимодействия, а также под влиянием костимулирующих факторов, Т-хелперный лимфоцит дифференцируется в субпопуляцию Т-хелперов, выделяющую комплекс различных цитокинов. В лимфоцит, под действием Т-клеток, пройдя ряд превращений, дифференцируется в плазматическую клетку, способную синтезировать большое количество антител, направленных к В-эпитопу антигена [15, 16]. В-эпитопы - это участки белковой поверхности, взаимодействующие с антителами, при этом происходит связывание и нейтрализация чужеродного антигена.
Однако для выработки специфических антител В-лимфоциту необходимо получить разрешающий сигнал от Т-хелперного лимфоцита [17]. При этом Т-лимфоцит взаимодействует своим рецептором с Т-эпитопом в пептидной последовательности антигена в комплексе МНС II с пептидом, а костимулирующая молекула CD4+ - с участком на поверхности МНС II [10]. Поэтому, полноценные иммуногены, способные активировать Т-хелперные лимфоциты и вызывать образование специфических антител, должны содержать и В-, и Т-эпитопы, причем последние должны связываться с молекулами МНС различных гаплотипов для преодоления генетической рестрикции.
Существует большое число экспериментальных и теоретических методов, с помощью которых можно идентифицировать В-эпитопы [18-23]. Однако определение в последовательности белков пептидных фрагментов, содержащих Т-эпитопы, является более сложной задачей. Подходы к идентификации Т-эпитопов в белках вирусов и бактерий будут рассмотрены в следующей главе обзора литературы.
В последнее время разработано большое количесство эмпирических и теоретических методов идентификации Т-эпитопов. К эмпирическим методам относятся рентгеноструктурный анализ, изучение связывания природных и синтетических пептидных фрагментов с молекулами МНС II in vitro и дальнейшая проверка их способности активировать Т-лимфоциты. Теоретические способы предсказания потенциальных Т-эпитопов основаны на выявлении закономерностей в последовательностях уже известных Т-хелперных эпитопов и МНС-лигандов. Выявленные закономерности могут быть применены для локализации Т-эпитопов в еще не исследованных белковых последовательностях.
Анализ данных литературы о структуре Т-хелперных эпитопов и выявление общих закономерностей
При анализе структуры Т-клеточных эпитопов различных белков вируса гриппа была обнаружена следующая закономерность: в эпитопных последовательностях после заряженного аминокислотного остатка или остатка Gly следуют два гидрофобных остатка [49]. В дальнейшем авторы уточнили эту закономерность: в состав Т-эпитопа входят или тетрамер (Rothbard-4), в котором после заряженного остатка или остатка Gly следуют два гидрофобных остатка, затем располагается полярный остаток или Gly; или пентамер (Rothbard-5), в котором после заряженного остатка или Gly следуют два гидрофобных остатка, затем снова гидрофобный или Pro, потом располагаются полярный остаток или Gly. С помощью этих алгоритмов были предсказаны структуры известных 8 хелперных и 3 цитотоксических эпитопов нуклеопротеина вируса гриппа, матричного белка вируса гриппа, 65 кДа белка М. tuberculosis и основного белка миелина крысы [50].
С целью предсказания потенциальных Т-эпитопов был разработан метод SOHHA (strip-of-helix hydrophobic algorithm) [51]. При исследовании молекулы Ii, ассоциированной с молекулой МНС II, авторами было выяснено, что она обладает амфипатической, сс-спиральной структурой. На основании этого вывода был предложен следующий алгоритм для предсказания пептидов, связывающихся с МНС II: гидрофобные аминокислоты располагаются в положении п, п + 4, п + 7, п + 11,п+14и п + 18 для пяти циклов ос-спирали. Кроме того, пептиды, распознающиеся Т-клеточным рецептором, имеют следующие закономерности структуры: во-первых, пептидная последовательность состоит из 12-19 аминокислотных остатков, что соответствует 4-6 виткам спирали; во-вторых, в ней имеется участок, состоящий из гидрофобных остатков; в-третьих, к этому участку пептидной последовательности примыкают гидрофильные остатки; в-четвертых, последовательность не должен содержать остатков Pro. Этот метод позволил предсказать 10 из 12 известных Т-эпитопов из семи хорошо изученных белков.
Для предсказания участков белков, способных образовывать тройной комплекс с Т-хелперным лимфоцитом и молекулой МНС II, был предложен метод, основанный на предположении, что а-спиральные участки белковой последовательности не подвержены протеолизу [52]. Предлагая этот подход, авторы исходили из эмпирических данных по коротким участкам последовательности, расщепляемых и нерасщепляемых определенными протеолитическими ферментами. Эффективность предложенного алгоритма была проверена на литературных данных о структуре Т-эпитопов из 12 белков. Из предсказанных с помощью этого алгоритма 52 Т-эпитопов (в общей сложности покрывающих 38% белковых последовательностей), 17 совпали с известными ранее.
Для предсказания Т-эпитопов был предложен метод EpiMer, определяющий МНС-лиганды и Т-хелперные эпитопы для различных гаплотипов молекулы МНС П в белковых последовательностях. Этот метод основан на литературных данных о закономерностях в структуре известных Т-эпитопов [53]. Были определены предполагаемые Т-эпитопы из четырех белков вируса иммунодефицита человека. Для определения эффективности этого алгоритма полученные данные сравнивали со структурой известных Т-эпитопов. Кроме того, метод EpiMer сравнивали со стандартным методом идентификации Т-клеточных эпитопов - изучением способности коротких перекрывающихся пептидных фрагментов образовывать тройной комплекс [40] и с алгоритмом, определяющим предполагаемые Т-эпитопы по наличию амфипатических а-спиралей (AMPHI) [45, 48, 54]. Было показано, что отношение правильных предсказаний структуры Т-эпитопов к общему числу предсказаний у метода EpiMer составило 63%, что превышает такое же отношение у алгоритма AMPHI (52%) и метода перекрывающихся пептидов (48%). Предсказанные с помощью метода EpiMer Т-эпитопы содержали участки связывания с молекулами МНС различных гаплотипов, что позволяет использовать этот метод для идентификации Т-эпитопов у особей с генетически различными молекулами МНС.
Другой алгоритм предсказаний потенциальных Т-эпитопов, Optimer, опирается на известные закономерности для лигандов МНС II [55]. Метод OptiMer основан на данных литературы о локализации амфипатических фрагментов в белковых антигенах и участках структуры известных МНС-лигандов в белковых последовательностях. При сравнении этого алгоритма с методом EpiMer была установлена их приблизительно одинаковая эффективность. Было описано использование этих алгоритмов для предсказания потенциальных Т-эпитопов в пяти белках Mycobacterium tuberculosis и трех белках вируса иммунодефицита человека.
Создание пептидных конструкций на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура
Таким образом, в таблицах 3 и 4 приведены результаты изучения иммуногенной активности 28 пептидов, удовлетворяющих требованию 1-9. Из них 23 пептида вызывали образование антител у мышей двух или трех линий, три пептида были способны индуцировать образование антител у одной линии мышей. И лишь два пептида из 28 не проявляли иммуногенной активности. В целом, 93% предсказанных пептидов проявили иммуноактивные свойства хотя бы на одной линии мышей, и только 7% оказались неиммуногенными.
Для приведенных в таблице 4 пептидов был проведен расчет вероятности проявления ими Т-хелперной активности с использованием описанной в литературе программы [59]. В таблице 4 в столбце "балл" приведена расчетная величина, отражающая вероятность проявления пептидом Т-хелперной активности у животных, несущих молекулы Н-2Ек и Н-2Ак. Сопоставление рассчитанных баллов с экспериментально полученными титрами антител у мышей CBA/J (Н-2к-гаплотип) показывают их невысокую корреляцию. Из 14 пептидов, индуцирующих образование антител у СВАЛ мышей (№№2-11, 13, 15, 18, 19), только 6 (№№ 3, 6, 7, 14, 15, 16) имели высокие расчетные баллы для молекул Н-2Ек ( 20) и/или Н-2Ак ( 16).
К сожалению, расчет вероятности содержания Т-хелперных эпитопов в пептидах для проявления активности у животных гаплотипов Н-2Ь и H-2d в программе [59] пока недоступен, поэтому оценка эффективности данного подхода для мышей Balb/c (H-2d гаплотип) и C57BI/6 (Н-2Ь гаплотип) невозможна.
Таким образом, на примере результатов проведенных исследований показана высокая эффективность предложенного метода предсказания при выборе иммуногенных фрагментов в последовательности белков ОраВ и NspA N. meningitidis, белков Е и NS1 вируса клещевого энцефалита.
Следующий этап проверки предложенного метода заключался в конструировании пептидов, способных вызывать образование антител, на основе неактивных белковых последовательностей. Фрагмент D белка РогА менингококка не способен индуцировать образование антител у мышей (табл. 2 № 9). Аминокислотная последовательность пептида 223-242 не содержит участка, удовлетворяющего условию 1-9. Однако природная последовательность 221-229 белка РогА менингококка удовлетворяет условию 1-9, поэтому для получения антител на фрагмент 223-242 был выбран для синтеза фрагмент 2 белка РогА, содержащий участок 1-9 (выделен жирным шрифтом). Способность исходного и полученного пептидных фрагментов индуцировать выработку противопептидных антител была изучена на мышах. Мыши трех линий были иммунизированы свободными пептидами в ПАФ в дозе 100 мкг на животное. Вторая иммунизация проводилась на 44 день в НАФ. Через 10 дней определяли титр противопептидных антител. В табл. 5 приведены аминокислотные последовательности синтетических аналогов, в которых выделены участки 1-9, и результаты изучения их способности инициировать образование антител у мышей различных линий.
Полученные результаты показывают, что синтетический пептид 219-242 белка РогА менингококка способен индуцировать образование высокого уровня противопептидных антител на мышах всех трех линий. Полученные противопептидные антитела связывались как с исходным пептидом последовательности 219-242, так и с неиммуногенным фрагментом 223-242.
С помощью введения дополнительного фрагмента 1-9 удалось добиться усиления иммунного ответа на фрагмент белка РогА менингококка (таб. 2 № 10). Этот пептид, содержащий в своей последовательности участок, отвечающий требованию 1-9, был иммуногенен на мышах линий Balb/c и С57ВІ/6 , но не вызывал выработку противопептидных антител на мышах линии CBA/J. С помощью предложенного метода для синтеза, который включал в себя два участка белковой последовательности, соответствующие требованию 1-9. Иммуногенные свойства фрагментов 233-252 и 219-252 были изучены как описано выше. Результаты, представленные в таблице 5, продемонстрировали значительное усиление иммунного ответа на пептид 219-252 по сравнению с фрагментами 233-252 и 219-242. При этом полученные противопептидные антитела перекрестно связывались с фрагментом 233-252.
Твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой метод)
Результаты исследования продемонстрировали рост уровня противопептидных антител в течение 25 дней после иммунизации конструкцией IV у животных обеих групп. При этом уровень антител, направленных к содержащему В-эпитоп фрагменту 135-159 был несколько выше, чем уровень антител против фрагмента 170-189. Количество вируснейтрализующих антител также возрастало к 25 дню после иммунизации. Однако прирост вируснейтрализующих антител зависел от иммунизирующей дозы: у животных №№1-3, иммунизированных конструкцией IV в дозе 3,5 мг, титр вируснейтрализующих антител был выше, чем у животных второй группы (№№4-6), иммунизированных в дозе 1 мг. Протективный эффект пептидной конструкции IV коррелировал с уровнем вируснейтрализующих антител: животные №№1-3 из первой группы и №4 из второй группы имели высокий титр вируснейтрализующих антител и были защищены от заболевания при заражении вирусом ящура.
Никто из животных первой группы, иммунизированных конструкцией IV в большей дозе, при последующем заражении в 10000 ЦЦ50 (доза вируса, вызывающая заболевание 50% зараженных животных) вирусом ящура не заболел. Расчетная величина Д#5о конструкции IV в эксперименте на крупном рогатом скоте составила 1.24 мг на животное. Следует отметить, что в отличие от конструкции IV, пептидный фрагмент Palni2135-159 не обеспечивал защиту крупного рогатого скота от заболевания при заражении вирусом ящура [150].
Таким образом, по сравнению с пептидом Ра1тг135-159, синтезированная конструкция IV, включающая в себя иммунодоминантный В-эпитоп и вирусспецифический Т-эпитоп, обладала более высокой иммуногенной активностью и обеспечивала более эффективную защиту лабораторных и природновосприимчивых животных от заболевания при заражении вирусом ящура.
В результате проделанной работы показано, что все полученные синтетические пептидные конструкции проявили себя как иммуноактивные соединения. Наиболее эффективной из трех конструкций, не содержащих липофильный остаток, была конструкция III, индуцирующая образование противопептидных и вируснейтрализующих антител с более высокими титрами по сравнению с конструкциями I и П. Кроме того, конструкция III обладала наиболее высокой протективной активностью и эффективнее защищала лабораторных и природновосприимчивых животных от заболевания ящуром. Далее, в процессе проведенных исследований, были изучены иммуногенные и протективные свойства выбранной ранее пептидной конструкции, содержащей остаток пальмитиновой кислоты и включающей в себя вируснейтрализующий В-эпитоп 135-158 и фрагмент 170-188, обладающий Т-хелперной активностью (конструкция IV). Было обнаружено, что эта конструкция способна индуцировать образование противопептидных антител, направленных к В-эпитопному фрагменту 135-159 и обладающих вируснейтрализующей активностью. Пептидная конструкция IV защищала лабораторных и природновосприимчивых животных от заболевания при заражении вирусом ящура.
Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что конструкция IV относится к числу наиболее активных противоящурных конструкций и обеспечивает эффективную защиту от заболевания при заражении вирусом ящура. Такая конструкция моделирует развитие противовирусного иммунитета, и также как и вирус ящура индуцирует у животных при помощи Т-хелперного участка 170-188 вируснеитрализующие антитела, направленные к иммунодоминантному участку 135-159.
Таким образом, в результате проделанной работы предложены следующие подходы к созданию иммуногенных пептидов: 1. Выбор для синтеза фрагментов белковой последовательности, отвечающих условию 1-9. 2. Искусственное формирование фрагментов, отвечающих условию 1-9 в У последовательности неактивных пептидов 3. Создание на основе известных В-эпитопов и Т-хелперных эпитопов вируса ящура пептидных конструкций, эффективно моделирующих противовирусный иммунитет. 3. Экспериментальная часть
Химические реагенты и биологические препараты
В работе были использованы реактивы следующих фирм: Полный и неполный адъюванты Фрейнда, о-фенилендиамин, конканавалин А, антитела козы против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена; антитела козы против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена; антитела козы против IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена - Sigma, США.
Антитела кролика против IgG овцы, конъюгированные с пероксидазой хрена; антитела козы против IgG крупного рогатого скота, конъюгированные с пероксидазой хрена - НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.
Среда RPMI 1640, фосфатно-солевой буфер, не содержащий ионов кальция и магния, фетальная сыворотка коровы, гентамицин, L-глутамин, пенициллин, стрептомицин - Flow laboratories, Великобритания. 3Н-тимидин - Amersham, США; Карбонат натрия одно- и двузамещенный, хлорид натрия, хлорид калия -«Реахим», Россия. Фосфат натрия одно- и двузамещенный, лимонная кислота, тетраборат натрия -Fluka, Швейцария 2-меркаптоэтанол, HEPES, твин-20 - Calbiochem, США Очищенный инактивированный вирус ящура штамм А22 — Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных, г. Владимир
![Дифференцированный подход к назначению синтетических иммунорегуляторных пептидов в составе комплексной терапии хронического рецидивирующего фурункулеза [Электронный ресурс]](/i/i/4347/200546.png "Дифференцированный подход к назначению синтетических иммунорегуляторных пептидов в составе комплексной терапии хронического рецидивирующего фурункулеза [Электронный ресурс] Манько Кирилл Сергеевич")
