Введение к работе
Актуальность проблемы. Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК и выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. Этот метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний основан на доставке терапевтических нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с целью направленного устранения генетических дефектов или придания клеткам новых функций. Важными условиями успешной коррекции генетического отклонения являются эффективная доставка нуклеиновых кислот (НК) и создание условий для их длительного функционирования.
В настоящее время наиболее эффективными системами доставки НК служат вирусные векторы, однако они имеют ряд серьезных недостатков. Это стимулирует разработку альтернативных невирусных подходов к трансфекции клеток, одним из которых является липофекция — метод доставки НК в составе комплексов с катионными липосомами. К преимуществам катионных липосом следует отнести безопасность и неиммуногенность, способность переносить НК любого размера, а также стабильность при хранении и экономическую доступность. Однако для известных на сегодняшний день липосом характерна низкая эффективность доставки НК, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липосомальный комплекс (липоплекс), прежде чем НК осуществит терапевтическое воздействие. К таким барьерам относят компоненты крови и белки иммунной системы, которые дестабилизируют липоплекс и вызывают преждевременное высвобождение и разрушение НК, а также клеточную, эндосомальную и ядерную мембраны.
Липосомы для доставки НК создаются на основе катионных амфифилов (КА), структура которых является одним из важных факторов, определяющих эффективность липофекции. Молекула КА представляет собой комбинацию двух основных структурных доменов - гидрофобного и гидрофильного катионного, которые соединяются спейсерными группами с помощью химической связи (линкера) определенного типа. На сегодняшний день накоплено большое количество данных по синтезу КА, однако для направленного поиска новых амфифилов необходимо выработать структурные требования, которые должны базироваться на понимании клеточных механизмов генного транспорта и определении лимитирующих стадий процесса липофекции. От этого также зависит разработка рациональных подходов к синтезу КА и созданию липосомальных систем доставки, и проверка гипотез, связанных с клеточными и молекулярными механизмами протекания трансфекции.
В настоящее время для трансфекции эукариотических клеток in vitro используются несколько зарубежных коммерчески доступных липосомальных систем доставки НК. Их применение in vivo ограничено высокой токсичностью, либо потерей активности в присутствии сыворотки крови или ее компонентов. Кроме того, высокая стоимость данных систем доставки
НК и отсутствие отечественных аналогов сдерживает развитие и интенсивное использование как самого метода липофекции, так и генной терапии в российских научно-исследовательских организациях и биотехнологических компаниях.
Таким образом, создание отечественных липосомальных систем доставки НК становится актуальной междисциплинарной задачей, лежащей на стыке биоорганической, биологической химии и молекулярной биологии. Поиск таких систем представляет собой комплексное исследование, которое включает разработку и оптимизацию подходов к синтезу новых КА, получение на их основе липосом и комплексов с НК, изучение физико-химических характеристик комплексов, установление зависимости эффективности трансфекции от структуры КА.
Основной целью работы является создание эффективных и безопасных липосомальных систем доставки, способных переносить терапевтические НК в клетки млекопитающих, для лечения наследственных и приобретенных заболеваний. Для достижения поставленной цели, в первую очередь, было необходимо предложить дизайн и разработать современные подходы к синтезу малотоксичных положительно заряженных амфифильных молекул - основных компонентов липосом - с различной компоновкой структурных доменов, после чего изучить физико-химические и биологические свойства супрамолекулярных структур, образуемых катионными амфифилами с НК. На основании результатов биологических исследований требовалось установить связь между структурой КА и его активностью, выработать требования к молекуле КА как эффективному трансфектанту и предложить липосомальную транспортную систему, способную переносить различные НК в условиях in vitro и in vivo.
Научная новизна. В данной работе сформировано новое междисциплинарное направление по конструированию липосомальных систем доставки НК, которое включает разработку синтетических подходов к получению КА с различной компоновкой структурных доменов, создание на их основе катионных липосом и установление связи между структурой амфифила и его биологическими свойствами:
Предложен дизайн новых моно- и поликатионных амфифилов и разработаны новые подходы и стратегии синтеза амфифилов с различной компоновкой структурных доменов и способом их связывания. Синтезированы амфифилы с линкерными группами, способными разрушаться под действием внутриклеточных стимулов. Совокупность всех разработанных подходов представляет собой общую технологическую платформу, которая позволяет на основе унифицированных блоков в короткие сроки получать КА, отличающиеся типами структурных элементов и способом их компоновки.
Впервые предложены новые эффективные подходы к получению углеводсодержащих КА с линейной и разветвленной компоновкой структурных доменов, а также амфифилов, содержащих в качестве спейсерной группы остаток D-глюкозы, связанный с гидрофобным доменом с помощью биодеградируемой гликозидной связи.
Для создания многокомпонентных транспортных систем, в которых функции связывания НК и ее доставки в клетки-мишени разделены между двумя амфифильными компонентами, получены нейтральные амфифилы с адресными лигандами на основе галактозы и фолиевой кислоты.
- Сформирована библиотека микроэлектронных фотографий, полученных с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, для 33 образцов комплексов катионных липосом с НК (более 500 изображений). Анализ изображений позволил выявить общие закономерности образования комплексов и показал, что вне зависимости от структуры КА и формы липосом при взаимодействии с НК формируются комплексы с ламеллярной структурой.
Установлена связь между структурой КА и трансфицирующей активностью, что позволило впервые сформулировать требования к структуре амфифила, которые должны учитываться при создании новых эффективных трансфицирующих реагентов. Показано, что важными элементами структуры, которые позволяют достичь высокой эффективности трансфекции, являются два гидрофобных домена, гексаметиленовый спейсер и линкер карбамоильного типа.
Впервые с помощью разработанных липосомальных систем осуществлена доставка мРНК, кодирующей опухоль-ассоциированные антигены, в трудно трансфицируемые дендритные клетки.
Практическая значимость работы. Липосомальные системы доставки НК находят широкое применение в научно-исследовательских организациях и коммерческих компаниях, работающих в области биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, а также генной терапии. В настоящее время потребности научных учреждений и компаний России в таких реагентах удовлетворяются исключительно за счет импортных препаратов, которые, наряду со своей высокой стоимостью, проявляют значительную токсичность, а их применение ограничено типом переносимой НК. Это делает использование данных препаратов невыгодным как с терапевтической, так и с коммерческой точки зрения. В настоящей диссертационной работе, используя синтезированные катионные амфифилы, впервые получены отечественные высокоэффективные липосомальные системы доставки НК, не уступающие по своим характеристикам зарубежным коммерческим препаратам, и показана принципиальная возможность создания на их основе онковакцин нового поколения. Результаты исследований in vitro и in vivo, позволяют рассматривать разработанные липосомальные системы доставки НК в качестве перспективных отечественных трансфицирующих препаратов для нужд молекулярной и клеточной биологии, генной терапии, биотехнологии и медицины. По результатам исследований получено 3 патента на изобретение.
