Содержание к диссертации
Введение
1. Синтез и свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот 14
1.1. Методы получения серусодержащих фосфонкарбоновых кислот 14
1.1.1. Синтез серусодержащих фосфонкарбоновых кислот из их кислородных аналогов 16
1.1.2. Методы синтеза, основанные на присоединении серы к производным трехвалентного фосфора 17
1.1.3. Синтез тиофосфонкарбоновых кислот из серусодержащих полупродуктов 17
1.1.4. Синтез производных фосфонкарбоновых кислот, содержащих атом серы в метиленовом мостике 22
1.2. Химические свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот 23
1.2.1. Реакции гидролиза эфиров серусодержащих фосфонкарбоновых кислот 23
1.2.2. Этерификация 25
1.2.3. Реакции восстановления 26
1.2.4. Ал килирование 26
1.2.5. Расщепление фосфоруглеродной связи 28
1.3. Практическая значимость серусодержащих фосфонкарбоновых кислот 28
2. Фосфонтиокарбоновые кислоты 35
2.1. Синтез фосфонтиоуксусной кислоты 36
2.2. Производные фосфонтиомуравьиной кислоты 39
2.2.1. Синтез фосфонтиомуравьиной кислоты 39
2.2.2. Синтез амидов фосфонтиомуравьиной кислоты. Реакция функционализации хлорметильной группы при атоме фосфора 41
3. Синтез модифицированных нуклеотидов 44
3.1. Нуклеозидные производные фосфонтиоуксусной кислоты 44
3.1.1. Синтез карбоксиметилфосфоната ацикловира (конденсация фосфонуксусной кислоты с ацикловиром) 45
3.1.2. Синтез тиокарбоксиметилфосфоната ацикловира (коньюгат фосфонтиоуксусной кислоты с ацикловиром) 46
3.2. Синтез модифицированных нуклеотидов, как потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ 50
3.2.1. Синтез изостерных аналогов монофосфатов d4Tnd2T 51
3.2.2. Синтез модифицированных 5\5*- динуклеозидтетрафосфатов 54
3.2.2.1 Синтез изостерного аналога динуклеозидтетрафосфата 54
3.2.2.2. Синтез d4T динуклеозидтетрафосфата 55
3.2.3. Синтез изостерного d4T, изостерного d2T и d4T три фосфатов 56
3.3. Синтез биотинилированного аналога 2,-дезоксиуридин-5'трифосфата 57
4. Гидролиз модифицированных три- и тетрафосфатов впуповинной сыворотке крови человека 63
5. Биологическая активность синтезированных соединений 68
6. Экспериментальная часть 73
Выводы 96
- Химические свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот
- Производные фосфонтиомуравьиной кислоты
- Синтез модифицированных нуклеотидов, как потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
- Биологическая активность синтезированных соединений
Введение к работе
Актуальность темы: В ряду фосфорорганических соединений важное место занимают фосфорилированные карбоновые кислоты и их производные. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты были синтезированы Нилиным в 1924 г. Однако химия их интенсивно начала развиваться лишь в последние десятилетия. Интерес к этим соединениям вызван, прежде всего, их практической значимостью. Различные производные фосфонкарболовых кислот находят практическое применение в органическом синтезе. Эфиры и нитрилы фосфонуксусной кислоты широко используются в реакции Хорнера для синтеза эфиров и нитрилов ненасыщенных карбоновых кислот. В том числе арахидоновой кислоты и феромонов, нашедших практическое применение. Производные фосфонкарбоновых кислот представляют интерес также в качестве средств защиты растений, лекарственных препаратов, экстрагентов, антипиренов, активаторов отбеливателей в целлюлозной промышленности и в других целях. Так производные фосфонуксусной кислоты предложены к использованию в качестве гербицидов [1,2], фунгицидов [3,4] и бактерицидов [5], биоцидов [6] а также промышленных микробиоцидов [7] и лекарственных препаратов. Особенно большой интерес производные фосфонкарбоновых кислот представляют для изыскания новых лекарственных препаратов для терапии вирусных болезней человека и животных, а также для борьбы с вирусными болезнями растений. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты являются аналоговыми антиметаболитами пирофосфата [8,9]. Они ингибирует активность фермента DNK-полимеразы, ответственной за репликацию вирусов. Фосфонуксусная и фосфонмуравьиная кислоты и ряд их производных являются высокоактивными ингибиторами репликации многих вирусов, в том числе вирусов герпеса [10,11,12,13,14], вирусов гепатита, инфекционного энцефалита, иммунодефицита [15,16] и др. Фосфонуксусная кислота в основном активна в отношении ДНК-содержащих вирусов. В конц. 25 мкг/мл фосфонуксусная кислота полностью подавляла репликацию вируса простого герпеса. Но при конц. выше 500 мкг/мл оказывает раздражающее действия на кожу и вызывает образование долго незаживающих язв. Кроме того, к фосфонуксусной кислоте развивается резистентность вирусов. Она также ингибирует развитие иммунитета к вирусным болезням. Все это ограничивает возможности практического использования ее в терапевтических целях.
Более широким спектром противовирусной активности обладает фосфонмуравьиная кислота. Тринатривая соль фосфонмуравьиной кислоты, препарат «фоскарнет», находит широкое применение для терапии вирусных болезней, вызываемых вирусом герпеса. Фосфонмуравьиная кислота рекомендована для терапии ряда других вирусных болезней, в том числе больных иммунодефицитом. В отношении вируса простого герпеса и вируса гепатита фосфонмуравьиная кислота оказалась в 100 раз активнее фосфонуксусной кислоты. Фосфонмуравьиная кислота действует на резистентные к фосфонуксусной кислоте и к ацикловиру штаммы вирусов. Фосфонмуравьиная кислота проявляет также значительный синергический эффект с некоторыми известными антивирусными препаратами [17,18,19]. Необходимо также отметить, что фосфонмуравьиная кислота малотоксична по отношению к теплокровным и немутогенна [20].
Однако для терапии таких вирусных заболеваний как вирус иммунодефицита фосфомуравьиную кислоту применяют внутривенной инъекцией. При этом она оказывает вредное воздействие на почки и другие внутренние органы. Известные антивирусные фосфонкарбоновые кислоты так же отличаются нежелательной токсичностью, коротким периодом жизни в организме, действуют только на репликацию вирусов и не действуют на латентные вирусы. В связи с этим поиск новых менее токсичных биологически активных соединений в ряду производных фосфонкарбоновых кислот является важной и актуальной задачей. Для снижения токсичности и увеличения продолжительности противовирусного действия фосфонкарбоновых кислот проведены исследования по разработке пролекарств. С этой целью получены разнообразные 1 -О-алкил-1,3-пропандиолофосфонкарбоновые кислоты, являющиеся аналогами фосфолипидов [21]. Липидные пролекарства на основе фосфонмуравьиной кислоты оказались в 30 раз менее токсичны для теплокровных в сравнении с фоскарнетом [21]. Положительные результаты по пролонгированию действия и снижению токсичности были получены также при изучении конъюгатов фосфонуксусной и фосфонмуравьиной кислоте модифицированными нуклеозидами [22,23,24,25,26,27].
Одним из перспективных направлений в снижении токсичности противовирусных фосфонкарбоновых кислот и пролонгирования их терапевтического действия является введение атомов серы в молекулы этих соединений. Известно, что серусодержащие фосфорные соединения менее токсичны для теплокровных в сравнении с их кислородными аналогами. В ходе метаболизма тиофосфонатов происходит обмен серы на кислород и можно ожидать, что в организме серусодержащие фосфонкарбоновые кислоты постепенно будут превращаться в их противовирусные кислородные аналоги.
В связи с этим, исследования в ряду серусодержащих фосфонкарбоновых кислот и конденсация их с модифицированными нуклеозидами, на наш взгляд, являются весьма актуальными.
Известно, что все лекарства, разрешенные для лечения ВИЧ-инфекций в мире, являются ингибиторами либо обратной транскриптазы, либо протеазы ВИЧ. Однако ингибирование обратной транскриптазы имеет значительные преимущества, так как подавляет репродукцию ВИЧ на ранней стадии его репликации, до включения провирусной ДНК в состав генома клетки. Но все известные ингибиторы этого фермента нуклеозидно-нуклеотидной природы для проявления своего действия должны пройти каскад внутриклеточного фосфорилирования, что требует времени, а также резко снижает их активную концентрацию в инфицированных ВИЧ клетках.
Решить эту проблему могло бы создание фосфорилированных форм нуклеозидных ингибиторов, которые подавляли бы репродукцию ВИЧ сразу же, после диффузии его в клетку. Более того, такие соединения могли бы вообще предотвратить инфицирование крови человека ВИЧ и, таким образом, служить «химическими вакцинами».
Однако, эта задача еще не решена и главной проблемой здесь является низкая стабильность трифосфатного остатка модифицированных нуклеозидтр и фосфатов в крови.
В последние годы удалось найти две новые активности, присущие ДНК-полимеразам. Первая реакция в этом ряду обеспечивает укорочение новосинтезируемой цепи ДНК на один или несколько нуклеотидных остатков, в результате чего образуются 5\5'-ди-(2'-дезоксинуклеозид)-тетрафосфаты. Во второй реакции эти соединения при определенной концентрации служат субстратами элонгации биосинтеза ДНК [28,29,30]. Исходя из вышеизложенного, представляется весьма актуальным синтез модифицированных 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов, как субстратных ингибиторов вирусных ДНК-полимераз нового типа, изучение их противовирусных свойств и стабильности в крови человека.
Целью диссертационного исследования является поиск новых методов синтеза производных фосфонтиокарбоновых кислот, коденсация их с модифицированными нуклеозидами, а также синтез модифицированных нуклеотидов, а именно 5^,5^- динуклеозидтетрафосфатов, нуклеозид-5'-трифосфатов и нуклеозид-5'-монофосфатов модифицированных по нуклеозиду, фосфатному участку и нуклеиновому основанию, обладающих потенциальной противовирусной активностью.
Научная новизна и практическая ценность работы: В соответствии с поставленной задачей нами впервые была изучена реакция тиолирования хлорметил фос фон атов, приводящая к образованию фосфонтиоформамидов, а также применение карбонилдиимидазола для введения серы в производные фосфонуксусной кислоты. Разработаны новые простые методы введения атомов серы в карбоксильную группу фосфонкарбоновых кислот и получены новые соединения, обладающие противовирусной активностью. Синтезированы новые модифицированные 5\5'-динуклеозидтетрафосфаты, которые представляют собой новый тип ингибиторов синтеза провирусной ДНК, катализируемого обратной транскриптазой ВИЧ.
Апробация: Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1999 г.), на международном симпозиуме «Текущие проблемы молекулярной генетики и микробиологии» (Москва, 2000 г.) и на 13-й Международной конференции по химии соединений фосфора (ІССРС-ХШ) (Санкт-Петербург, 2002 г.)
Публикации: По теме диссертации опубликовано 3 статьи, 1 патент, 3 тезиса докладов.
Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, списка сокращений, шести глав, выводов, списка литературы и приложения.
Первая глава представляет собой литературный обзор, посвященный методам синтеза, химическим свойствам и практической значимости серусодержащих фосфонкарбоновых кислот.
Вторая глава посвящена разработке новых методов синтеза производных фосфонтиокарбоновых кислот.
В третьей главе обсуждены опыты по синтезу модифицированных нуклеотидов.
Четвертая глава посвящена гидролизу модифицированных ныклеотидов в пуповинной сыворотке крови человека.
В пятой главе рассмотрена биологическая активность синтезированных соединений.
В шестой главе приведены экспериментальные данные по синтезу производных фосфонтиокарбоновых кислот и модифицированных нуклеотидов и общая методика определения времени гидролиза половинного количества модифицированных и природных нуклеотидов.
На защиту выносятся следующие положения работы: 1. Синтез фосфонтиоуксусной кислоты, обладающей активностью против РНК-содержащих вирусов. 1. Реакция функционализации хлорметилзамещенных фосфорильных соединений серой в присутствии аминов
Синтез конъюгатов фосфонуксусной и фосфонтиоуксусной кислоты с ацикловиром. Применение карбонилдиимидазола для введения серы в производные фосфонуксусной кислоты.
Синтез модифицированных 5',5'-динуклеозидтетрафосфатов, как субстратных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ нового типа и их устойчивость в пуповинной сыворотке крови человека.
Диссертация выполнена в Группе синтеза биологически активных веществ, во Всероссийском НИИ фитопатологии РАСХН и в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток, в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Испытания синтезированных соединений на противовирусную активность проведены во Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (г. Покров), во Всеросийском НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург) и в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.
Химические свойства серусодержащих фосфонкарбоновых кислот
Реакции гидролиза эфиров серусодержащих фосфонкарбоновых кислот являются основным методом получения свободных кислот. Триметиловый эфир тиофосфон муравьиной кислоты гидролизуется щелочью до тиофосфонмуравьиной кислоты и частично фосфонмуравьиной кислоты. Аналогично могут деэтерифицироваться Эфиры и нитрилы тиофосфонуксусной кислоты обладают СН-кислотностью, металлирование по метиленовои группе эфиров тиофосфонуксусной кислоты подтверждено ЯМР спектрами [78]. По СН-кислотности они несколько превосходят их кислородные аналоги [79, 80], что позволяет алкилировать их по метиленовои группе. При этом не наблюдается избирательности в замещении обоих протонов и с дигалоидалкилами образуются тиофосфорилированные производные циклоалкан карбоновой кислоты [79]. Среди производных тифосфокарбоновых кислот выявлены вещества, обладающие инсектицидной и акарицидной активностями, [63,89]. Так, фениловый эфир диэтокситиофосфонилуксусной кислоты в конц. 0.01 % уничтожает паутинных клещей [63]. Еще более высокой инсектицидной активностью обладает этиловый эфир диэтоксифосфонилацетоуксусной кислоты [89]. Можно полагать, что в этих соединениях фосфоруглеродная связь настолько ослаблена, что они способны участвовать в реакции фосфор ил ирования и ингибрирования холинэстеразы. Большой интерес представляют серусодержащие фосфонкарбоновые кислоты и их производные в качестве противовирусных соединений [36]. Было установлено, что тиофосфонмуравьиная кислота ингибирует ДНК-полимеразу вируса простого герпеса — 1 не хуже чем фоскарнет, а тиофосфоиуксусная кислота ингибирует ДНК-пол им е разу вируса простого герпеса — 1 не хуже чем фосфонуксусная кислота, но в то же время значительно сильнее ингибирует РНК-пол и меразу вируса гриппа типа А/х49, по сравнению с фосфонуксусной кислотой [90]. В поисках противовирусных соединений синтезирована а-дихлортиофосфонуксусная кислота [91].
Большое внимание уделяется созданию пролекарств на основе тиофосфонкарбоновых кислот [21, 32]. В поисках противовирусных пролекарств были синтезированы разнообразные тиоаналоги фосфономуравьиной кислоты следующей общей формулы [32]: Где Rj, &2 R3 это- независимые друг от друга ал кил, арил, Н или катион, XI, Х2, ХЗ, Х4 и Х5 это О или S, но при условии, что хотя бы один изХ = 5 По мнению профессора МсКеппа С. [32] противовирусной активностью могут обладать аналогичные соединения, где R1 и R2 и(или) R3 - более сложные молекулы, чем простые алкил или арил производные ( или части простых молекул), например, Rl, R2 и R3 могут содержать одну или более эфирную или сложноэфирную связь. Катионом могут быть: физиологически приемлемые щелочные металлы ( например Li+, Na+ или К+) щелочно-земельные металлы (Са2+, Ва2+, Mg2+) высоковалентные катионы поликатионные ионы ( например полиаммонийные катионы) В этой же работе тиоаналоги фосфономуравьиной кислоты были сконденсировапны с производными глицерина по схемам 1 и 2 с целью создания пролекарств, которые, по мнению проф. Мс Кеппа С, будут способствовать проникновению через клеточную мембрану. В этой же работе проф. МсКеппа С. предлагают конденсировать тиофосфонмуравьиную кислоту с различными модифицированными нуклеозидами, обладающими антивирусной активностью в целях увеличения селективности действия тиофосфонмуравьиной кислоты, вследствии чего уменьшения ее (тиофосфонмуравьиной кислоты) токсичности а так же по ряду других причин, В работе [21] конденсацию с производными глицерина провели как с тиофосфонмуравьиной кислотой, так и с тиофосфонуксусной кислотой, причем последнюю получали по аналогии с предыдущей работой используя реактив Лоусона. Проф. МсКеппа С. Показал, что тиофосфонмуравьиная кислота эффективнее ингибирует репликацию цитомегаловируса, чем фоскарнет [92]. В работе [93] изучали метаболизм фосфонтиоуксусной кислоты с помощью ВЭЖХ на подопытных кошках и показали, что тиофосфонмуравьиная кислота превращается в фосфонмуравьиную кислоту, а время полужизни в крови составляет 42 мин. Серусодержащие фосфонкарбоновые кислоты представляют интерес и для технических целей. Так, дитиофосфорилуксусная кислота является сильным ингибитором коррозии металлов [94]. На основе литературных данных можно сделать вывод о том, что серусодержащие фосфонкарбоновые соединения представляют собой большой интерес, как биологически активные соединения, особенно, как противовирусные агенты.
Обзор литературы показал, что синтезировано довольно много производных фосфонкарбоновых кислот у которых атом серы находится при атоме фосфора и хорошо описаны химические и биологические свойства этих соединеий, однако тот случай, когда атом серы находится при карбонильном углероде освещен еще не достаточно, и именно этот случай явился объектом исследования для настоящей работы. Фосфонкарбоновые кислоты и их производные представляют интерес в качестве вирусстатических препаратов. Как было отмечено во введении, особенный интерес в ряду фосфонкарбоновых кислот представляют фосфонмуравьиная и фосфонуксусная кислоты. Гексагидрат три натриевой соли фосфон муравьиной кислоты (фоскарнет) в 1998 году утвержден Министерством здравоохранения России, как противовирусный медицинский препарат. На основе фоскарнета создан зарубежный медицинский препарат Foscavir (AstraZeneca), который применяется исключительно внутривенно в виде водного раствора фоскарнета. Foscavir применяется в основном для лечения герпес вирусов, включая цитомегаловирус. Этот препарат практически незаменим при терапии болезней, вызываемых вирусами герпеса, которые имеют дефицит тимидин киназы, вследствии чего, не поддаются лечению основными противогерпетическими препаратами нуклеозидного происхождения. Foscavir так же применяется для лечения больных, зараженных герпес вирусами, развивающимися у них на фоне ВИЧ — инфекции. Наряду с высокой антивирусной активностью фосфонмуравьиная кислота обладает и отрицательными качествами, главные из которых: подавление иммунных реакций организма и сильное местное раздражающее действие. Следует также отметить, что фосфонмуравьиная кислота нестабильна и разлагается при комнатной температуре, поэтому для увеличения стабильности ее получают в виде тринатриевой соли. Тиофосфонмуравьиная кислота, по всей видимости еще менее стабильна и, вероятно, поэтому была получена с довольно низкими выходами [36]. Фосфонуксусная кислота - это довольно стабильное соединение, она не разлагается при комнатной температуре. Несмотря на то, что ввиду большей токсичности фосфонуксусной кислоты по сравнению с фосфонмуравьиной кислотой, на основе фосфонуксусной кислоты до настоящего времени не создано медицинского препарата, но серусодержащее производное фосфонуксусной кислоты, а именно тиофосфонуксусная кислота, более эффективно ингибировала РНК-транскриптазу, чем ее предшественница [90]. Фосфонтиоуксусная кислота до настоящего времени не описана в литературе. Исходя из вышесказанного мы решили начать нашу работу с синтеза фосфонтиоуксусной кислоты. 2.1. Синтез фосфонтиоуксусной кислоты В литературе фосфонтиоуксусная кислота неизвестна, но можно предполагать, что замена атома кислорода на атом серы в карбонильной группе снизит раздражающее и токсическое действие фосфонкарбоновых кислот без потери их антивирусной активности.
Производные фосфонтиомуравьиной кислоты
Фосфонтиомуравьиная кислота известна только в виде эфиров. Нами изучались методы получения ее в виде соли. В качестве исходного соединения для синтеза фосфосфонтиомуравьиной кислоты использовали диэтиловый эфир фосфористой кислоты (6), который обрабатывали натрием, а затем карбон ил сульфидом. В результате после очистки получали белый порошок, который после исследования с помощью Н и J P ЯМР спектроскопии идентифицировали как фосфористую кислоту (8), из чего можно заключить, что целевой продукт разложился при гидролизе до фосфористой кислоты. Второй способ заключался в силилировании сложноэфирных групп с образованием промежуточного триметилсилилового эфира и дальнейшей реакцией с метилатом натрия, но и в этом случае основным продуктом являлась фосфористая кислота. Анализ этих данных позволяет сделать вывод, что целевой продукт возможно является нестабильным и быстро разлагается до фосфористой кислоты при комнатной температуре. Для создания более стабильных структур нами было решено синтезировать амиды эфиров фосфонтиомуравьиной кислоты. 2.2.2. Синтез амидов фосфонтиомуравьиной кислоты. Реакция функционализации хлорметильной группы при атоме фосфора. Известно [95, 96], что хлорметил ьная группа в соединениях четырехкоординированного фосфора малоактивна по сравнению с хлорметильной группой в соответствующих карбонильных соединениях. Нами впервые проведена функционализация хлорметильного фрагмента при атоме фосфора серой в присутствии аминов. В качестве модельного соединения был использован дифенилхлорметилфосфиноксид, поскольку наличие ароматических заместителей позволяло следить за ходом реакции по ТСХ и получать стабильные кристаллические тиоамиды. Исходный дифенилхлорметилфосфиноксид (И) был получен известным способом по следующей схеме: Оказалось, что для успешного протекания реакции функционализации необходимо предварительно приготовить раствор серы и соответствующего амина в диметилформамиде, и уже затем вводить в реакционную массу исходное хлорметильное соединение (11). Продукты (12-15) были получены с хорошими выходами. Таким образом, был предложен удобный препаративный метод синтеза амидов дифенилфосфинилтиомуравьиной кислоты.
Разработанный нами подход был использован для синтеза целевого морфолида диэтоксифосфорилтиомуравьиной кислоты (18). Исходный диэтилхлорметилфосфонат (17) синтезировали из дихл оран гидрида хлорметилфосфоновой кислоты (16), кипячением последней с трехкратным избытком этилового спирта в присутствии триэтиламина. Дихлорангидрид хлорметилфосфоновой кислоты (16) получали по модифицированной нами схеме с использованием в качестве катализатора трихлорида бора и процесс проводили при температуре 250 С. Представлялось целесообразным синтезировать конъюгаты фосфонтиокарбоновых и фосфонкарбоновых кислоте модифицированными нулеозидами, а также некоторые нуклеотиды, модифицированные, как по фосфатной, так и по углеводной части, как соединения потенциально превосходящие по противовирусной активности свои фосфонкарбоновые и нуклеозидные предшественники. 3.1. Яуклгозидные производные фосфоитиоуксусной кислоты. Фосфонтиоуксусная кислота является тиокарбокс нанял огом природных пирофосфатов. Для поиска противовирусных соединений представлялось интересным изучение нуклеотидиых производных фосфонтиоуксусной кислоты. Известно, что одним из широко и эффективно используемых медицинских препаратов против болезней, вызываемых вирусами герпеса, в ряду производных нуклеозидов, является ацикловир (9-[(2-гидроксиэтилокси)метил] гуанин). Однако по отношению к нему быстро развивается резистентность вирусов. Действие ацикловира основано на блокировании синтеза вирусной ДНК. Фосфонкарбоновые кислоты имеют другой механизм действия на вирус, который заключается, по всей видимости, в том, что они ингибируют ДНК полимеразу. Создание химического соединения способного действовать на вирус используя оба эти механизма, на наш взгляд, позволит замедлить развитие резистентности к этому вирусстатику. В соответствии с этим нами проведены исследования по синтезу гуанинового производного фосфонтиоуксусной кислоты.
Синтез нуклеотидных производных проводили в 2 стадии. На 1 стадии получили гуаниновое производное фосфонуксусной кислоты, а на второй произвели замену кислорода в карбоксильной группе на серу, с помощью предложенного нами диимидазолилкарбоксилатного метода. 3.1.1 Синтез карбоксиметилфосфоната ащікловира (конденсация фосфонуксусной кислоты с ацикяовиром), В качестве исходного соединения использовали триэтилфосфоноацетат (19). Его обрабатывали избытком триметилбромсилана с образованием промежуточного триметилен л илового эфира, который затем гидролизовали водным пиридином. Далее реакционную смесь 2 раза упаривали с пиридином, снова растворяли в пиридине и вовлекали в реакцию с ацикловиром (20) и 1.2 кратным избытком дициклогексилкарбодиимида (DCC). Смесь перемешивали при комнатной температуре и продукт очищали на колонке ДЕАЕ-Тоуореагі. Получили аммонийную соль этоксикарбонилметилфосфоната ацикловира (21) с выходом 76%. Далее щелочным гидролизом получили карбоксиметилфосфонат ацикловира (22), который после фильтрации через Dowex 50 (NHV-форма) превращался в соответствующую аммонийную соль. После лиофилизации выход составил 86%. 3.1.2. Синтез тиокарбоксиметшіфосфопата ацикловира (конъюгат фосфонтиоуксусной кислоты с а циклов иром). Это соединение, по всей видимости, можно синтезировать по аналогии с вышеописанным синтезом в разделе З.1.1., то есть конденсацией ацикловира с фосфонтиоуксусной кислотой. Однако эта схема в данном случае не является рациональной, поскольку тионильная группа не защищена и возможно образование побочных продуктов. С другой стороны защита и последующее деблокирование удлинит схему синтеза. Поэтому нами была разработана простая и удобная схема. В качестве исходного соединения использовали карбоксиметилфосфонат ацикловира (22). Была получена его трибутил аммоний пая соль, которую превратили в соответствующий имидозолид реакцией с карбонилдиимидазолом в диметилформамиде (10 минут, 20С) и после пропускания сухого сероводорода, получили целевой продукт (23) с выходом 84%, Строение полученных соединений подтверждены Н-, 3,Р ЯМР- И УФ-спектрами, а также элементным анализом. Анализ ЯМР спектров (см. Рис 3, 4) показывает, что замена атома кислорода в карбоксильной группе на серу приводит к изменению хим. сдвига метиленовой группы при фосфоре с 2,63 м.д. на 3.12 м.д. В то же время фосфорный сигнал сдвигается с 16,30 м.д. до 17,60 м.д. В целом эти изменения согласуются с ожидаемыми.
Синтез модифицированных нуклеотидов, как потенциальных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ
Известен ряд модифицированных нуклеозидов, ингибирующих обратную транскриптазу ВИЧ. Для проявления своего действия они фосфорилируются в клетке до соответствующих трифосфатов и, обманывая обратную транскриптазу, встраиваются в растущую цепь, терминируя дальнейшую элонгацию. Следует отметить, что фосфорилирование модифицированных нуклеозидов клеточными ферментами происходит значительно менее эффективно, чем природных 2 -дезоксинуклеозидов [97-98]. Чтобы достичь в клетках эффективной концентрации 5 -трифосфатов, приходится создавать высокие концентрации модифицированных нуклеозидов. Данный процесс сказывается на всем балансе нуклеозидов в клетке и приводит к нарушению нормальных метаболических процессов. Как было отмечено во введении, решить эту проблему могло бы создание фосфорилированных форм нуклеозидных ингибиторов, которые подавляли бы репродукцию ВИЧ сразу же после их диффузии в клетку. Однако, эта задача еще не решена и главной проблемой здесь является низкая стабильность трифосфатного остатка в крови модифицированных нуклеозидтрифосфатов. Таким образом, нуклеотидные ингибиторы ВИЧ должны удовлетворять следующим условиям. 1. Они должны быть активными и селективными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ. 2. Они должны быть достаточно стабильными по отношению к дефосфорилирующим ферментам крови. 3. Они должны быть достаточно гидрофобными для успешной диффузии в клетки. Сочетание этих свойств кажется трудно достижимым. Так, модифицированные по всем три фосфатным остаткам нуклеозидтрифосфаты, синтезированные и изученные в лаборатории профессора А.А. Краевского, хорошо удовлетворяя первому и в значительной степени второму требованиям, были слишком гидрофильны для интенсивной диффузии в клетки. Как было отмечено во введении, в последние годы удалось найти две новые активности присущие ДНК-пол им еразам. Первая реакция в этом ряду обеспечивает укорочение новосинтезируемой цепи ДНК на один или несколько нуклеотидных остатков, в результате чего образуются 5,5 -ди-(2 -дезоксинуклеозид)-тетрафосфаты.
Во второй реакции эти соединения при определенной концентрации служат субстратами элонгации биосинтеза ДНК [28-30]. Исходя из вышеизложенного, представляется весьма актуальным синтез модифицированных нуклеозид-5 -монофосфатов, нуклеозид-5 -трифосфатов, а также модифицированных по нуклеозиду и тетрафосфатному участку 5,5 -динуклеозидтетрафосфатных структур, как нового типа субстратных ингибиторов вирусных ДНК-полимераз. 3,2.1. Синтез изостерных аналогов монофосфатов U4T и d2T. Как было отмечено выше, нуклеотидиые ингибиторы ВИЧ должны быть достаточно стабильными по отношению к дефосфорилирующим ферментам крови и в то же время быть активными и селективными ингибиторами обратной транскриптазы ВИЧ. Этому требованию могут удовлетворять фосфонатные аналоги модифицированных нуклеозидов. Фосфонаты, по ряду параметров имитирующие нуклеотиды, не нуждаются в фосфорилировании нуклеозидкиназами. Кроме того, фосфонаты, как правило, более устойчивы к дефосфорилирующим ферментам, что позволяет в ряде случаев использовать их в качестве депо-форм. Вирусные обратные транскриптазы менее специфичны, чем ДНК-полимеразы животных и человека, и в ряде случаев не различают фосфонатные и фосфатные остатки. Синтез изостерного фосфонатного аналога d4T- монофосфата мы проводили руководствуясь ранее описанной в литературе схемой [99-101], однако условия реакций на каждой стадии нами были изменены. В работе [101] было показано, что изостерпый аналог фосфоната d4A значительно более стабилен в кислых условиях, чем d4A. Этот факт также послужил причиной выбора нами именно изостерного фосфоната d4T. Исходным соединением для синтеза служил тимидин (24) который окислили, используя хромат пиридиния в диметилформамиде, получив 5 - тимидиловую кислоту (25) с выходом 70%. Затем провели декарбоксилирование, используя динеопентилацеталь-М,гч[- диметилформамида, при этом тикаль (26) получен с выходом 90%. Следующую стадию осуществили используя диэтил(гидроксиметил)фосфонат и Шг и получили соответствующее 3 - иодо производное изостерного тимидин 5 -монофосфата (27). Затем, действием триметилбромсилана, получили соответствующий триметилсилиловый эфир, который, не выделяя, вводили в реакцию с диазабициклоундеценом (DBU), элиминировали НІ и гидролизовали триметилсилиловый эфир.
После очистки с помощью ионообменной хроматографии получили целевое вещество (28), которое в дальнейшем использовали для синтеза полифосфатов и синтеза изостерного d2T. Все промежуточные и конечное соединение охарактеризовали с помощью Н и ЗІР ЯМР и УФ спектроскопии. Впервые удалось восстановить изостерный с!4Т-фосфонат (28) до изостерного 12Т-фосфоната (29). Гидрирование проводили водородом в водном спирте в присутствии 10% Pd/C. Строение было подтверждено Н, Р ЯМР и УФ спектроскопией. В частности, превращение двойной связи при 2\3 положении в одинарную подтверждается исчезновением в Н-ЯМР спектре сигналов при 6,11 и 6,31 м.д. (суммарная интенсивность - 2Н), и появлением группы сигналов при 2,03 — 2,33 м.д. (интеграл - 4Н). Синтезированный изостерный аналог 2 ,3 -дидезокси, 2\3 -дидегидротимидинмонофосфата был использован для получения новых модифицированных б -динуклеозидтетрафосфатов и модифицированных нуклеозид-5 -трифосфатов. Как было отмечено выше, для изучения нового типа субстратных ингибиторов вирусных ДНК-пол им ераз, были синтезированы модифицированные 5\5 -динуклеозидтетрафосфаты. В качестве исходных соединений для синтеза использовали d4T и изостерный аналог его монофосфата. 3.2.2.1 Синтез изостерного аналога динуклеозидтетрафосфата. Синтез проводили в две стадии. Исходный изостерный фосфонат (28) в виде пиридиниевой соли, активированный карбонилдиимидозолом, конденсировали с трибутиламмониевой солью ортофосфорной кислоты и получили изостерный аналог дифосфата (30). Затем дифосфат (30) разделили на 2 равные части и первую часть активировали карбонилдиимидозолом, и полученный при этом имидазолид конденсировали со свободным дифосфатом (30). После очистки с помощью ионообменной хроматографии получили динуклеозидтетрафосфорное производное (31) с выходом 40%. Промежуточное и конечное соединение охарактеризовали с помощью Н, ЗІР ЯМР и УФ спектроскопии. Синтез трифосфатов (35-36) проводился по единой методике. Исходные модифицированные монофосфаты активировали карбонилдиимидозолом и затем вовлекали в реакцию с трибутиламмониевой солью пирофосфата, получая соответствующие трифосфаты.
Биологическая активность синтезированных соединений
В ГНУ ВНИИ ветеренарной вирусологии и микробиологии РАСХН (г. Покров) и ВНИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург) было изучено вирусстатическое (ингибирующее репликацию) и вирулицидное (инактивирующее) действие фосфонтиоуксусной кислоты (Ф-1224) (5) в культуре клеток Vero. Испытания проводили в отношении человеческого коронавируса, выделенного в НИИ гриппа РАМН от ребенка в марте 2003 г. Исследуемое соединение было охарактеризовано по следующим параметрам: 50 %-ная тканевая цитопатическая доза (ТЦДзо) — концентрация вещества, вызывающая деструкцию 50% клеток в культуре; максимально переносимая доза (МПД) — половинаТЦД5о для культуры клеток; минимальная эффективная доза (МЭД) - минимальная концентрация вещества, вызывающая подавление репродукции вируса в культуре; химиотерапевтический индекс (ХТИ) - отношение МПД к МЭД. При определении вирусстатического действия культуру клеток Vero заражали вирусом в дозе 0,0001 — 0,001 ТЦЦ5о на клетку. После заражения культуру клеток инкубировали в термостате при 37,5 С в течение 1-1,5 часов (период адсорбции вируса), после чего в культуру клеток вносили соединение в различных концентрациях и инкубировали в термостате до четкого проявления цитопатогенного действия (ЦПД) в контрольных пробирках. Контролями служили: культура клеток, зараженная вирусом (позитивный контроль) и интактная культура клеток в которую вместо раствора химического вещества вносили поддерживающую среду (негативный контроль). После проявления ЦПД в контроле вируса опытные и контрольные образцы титровали в культуре клеток. Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вируса в опыте и контроле, которую выражали в lg ТЦД о- Эксперименты в бесклеточных системах. ДНК фага МІЗмрІО (плюс-цепь) выделяли из культуральной жидкости Е. соН XL-I. Использовали следующие ферменты: ОТ ВИЧ (любезно предоставленную Т. А. Розовской, ВКНЦ РАМН), ДНК-полимеразу а из плаценты человека [109], ДНК-полимеразу Р из тимуса теленка [110], фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I из Е. сої і фирмы Amersham (UK). Тетрадекадезоксинуклеотид (синтезированный Б.К. Черновым, ИМБ РАН) метили по 5-положению изотопом 32Р и гибридизовали с матрицей как описано в [111]. Реакции элонгации праймера, катализируемые перечисленными ферментами, проводили в условиях [112].
Продукты реакции анализировали электрофорезом в 20% ПААГ. Полученные результаты суммированы в таблице 3 (данные с.н.с. Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток ИМБ РАН к.б.н. Викторовой Л. С): данным Д. Ю. Мозжерина (Department of Pharmacological Sciences, University Medical Center, State University of New York) , биотинилированный аналог 2 -дезоксиуридин-5 -трифосфата (46) является селективным субстратом ДНК-полимераз а и 5 из плаценты человека в реакциях синтеза ДНК, катализируемых ими. В системе с праймер- матричным- комплексом, состоящим из 30-членного дезоксиолигонуклеотида (матрица) и 20-членного дезоксиолигонуклеотида, меченного по 5 -концу [ Р] (праймер), наблюдается включение соединения (46) в цепь праймера, в положениях, комплиментарных адениновым остаткам в последовательности матричного олигопуклеотида, когда в реакционной цепи присутствуют только 3 dNTP (dATP, dGTP и dCTP), а вместо dTTP добавлен исследуемый биотинилированный аналог (см. Треки 4-6 и 7-9; положение 22-членного олигонуклеотида с остатком соединения (46) на 3 -конце указано стрелкой слева). Следует заметить, что при разделении продуктов реакции удлинение праймера электрофорезом в полиакриламидном геле, олигонуклеотиды, не содержащие модифицированных остатков, имеют обычную электрофоретическую подвижность, в то время как подвижность олигонуклеотидов с биотинилированным аналогом существенно меньше вследствие большей гидрофобности модифицированной молекулы. При 25-кратном избытке соединения (46) над dTTP не наблюдается его конкуренции с природным субстратом (ср. треки 3 и 10). (Рис. 11). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках "Silufbr, (Kavalier, ЧСФР) и на пластинках Kieselgel 60F254 ("Merck", ФРГ) в системах (объем на объем): хлороформ-метанол (9:1) - А изопропанол-аммиак-вода (7:1:2) — Б диоксан-аммиак (8:2) - В ацетонитрил-аммиак-вода (9:1:1) - Г диоксан-аммиак-вода (6:1:4) - Д хлороформ-метанол (20:1) - Е диоксан-аммиак-изопропанол-вода (3:2:2:4) - Ж ацетон-хлороформ (1:3) - 3 Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле "Kieselgel 60" (60-100 мкм) фирмы "Merck" (ФРГ), на ионообменных смолах: "Toyopearl 650 М DEAE" ("Toyo Soda", Япония) и на "Dowex 50 (гҐ) ("Sigma", США), дополнительную очистку проводили на обращенно-фазовом силикагеле " LiChroprep RP-18" (25-40 мкм) фирмы "Merck" (ФРГ). УФ спектры снимали на спектрометре Specord М40 ("Carl Zeiss Jena", ГДР): для нуклеозидов в метаноле, для нуклеотидов в воде. НЯМР-спектры регистрировали на спектрометре "Bruker WM-250" (250 МГц). Масс-спектры записывали на приборе "Kraton MS-30" с непосредственным вводом образца в источник, ионизирующее излучение 70 эВ. Т,и определяли на столике "Boetius" и не корректировали (скорость нагрева 4С в мин.) В эксперименах касающихся синтеза конъюгатов производных фосфонкарбоновых кислот с ацикловиром использовали: Dowex-50 и триэтилфосфоноацетат (Fluka); DCC (Aldrich). ACV был предоставлен компанией «Ассоциация АЗТ» (Москва). ЯМР - спектры регистрировали на спектрометре АМХ Ш-400 (Bruker) с рабочей частотой 400 МГц для Н-ЯМР и 162 МГц для Р-ЯМР (с подавлением фосфор - протонного взаимодействия, внешний стандарт — 85% фосфорная кислота). УФ - спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-2401PC (Япония). В работе были также использованы CDI, N-метилимидазол, триэтиламин, триметилбромсилан, 80% суспензия NaH в минеральном масле фирмы "Fluka" (ФРГ), 2 -дезоксиуридин фирмы "Sigma", DMF и пиридин фирмы "Alldrich". dTp4dT (контроль для сравнения) был любезно предоставлен аспирантом Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток ИМБ РАН Скобловым А.Ю.
Этиловый эфир иодметилфосфоновой кислоты и d4T были любезно предоставлены научным сотрудником Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и клеток ИМБ РАН Ясько М.В. Использованные реактивы очищали по стандартным методикам. Диэтилфосфонуксусная кислота. (2). Затем отгоняли на роторном испарителе воду и этиловый спирт, остаток растворяли в І50 мл воды и экстрагировали 150 мл хлороформа. Органический слой отделяли, сушили сульфатом натрия и отгоняли растворитель. Водный слой подкисляли концентрированной соляной кислотой до значения рН=2-3. Затем водный слой экстрагировали хлороформом (2x150 мл), сушили сульфатом натрия и отгоняли растворитель до постоянного веса. Получали подвижный, маслообразный продукт. Выход : 51,5 г (65%), nD20=l ,4460. Хлорангидрид диэтилфосфонуксусной кислоты. (3) В трехгорлую колбу помещали 26 г диэтилфосфонуксуной кислоты (2) в 150 мл сухого четыреххлористого углерода и медленно прикапывали 20,5 г хлористого тионила. После добавления хлористого тионила реакционную смесь нагревали в течение 3 часов в интервале температур 50-55С. Затем отгоняли четыреххлористый углерод и избыток хлористого тионила в вакууме водоструйного насоса и получали продукт. Выход: 24 г (86,2%), nD20=l,4575. Диэтоксифосфорил тиоуксусная кислота. (4) Через 24 часа в хлорангидрид диэтилфосфонуксусной кислоты (3), растворенный в 100 мл сухого дихлорэтана пропускали сероводород в течение 40 минут. При этом происходило выделение хлороводорода (контроль-смоченная в аммиаке вата). Затем небольшими порциями добавляли 8,9 г пиридина, растворенного в 25 мл сухого дихлорэтана, при этом охлаждая реакционную массу до 0С. Продолжали пропускать сероводород в течение 2,5 часов, после чего реакционную массу оставляли на 10 часов.
