Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Литературный обзор Введение 7
2.1. Карбораниллорфирины на основе природных порфиринов 12
2.2. Карбораниллорфирины на основе синтетических порфиринов 23
2.3. Карборанилфталоцианины 43
2.4. Заключение 46
3. Обсуждение результатов
3.1. Синтез карборанил- и монокарборанилпорфиринов на основе 2-формил- 5,10,15,20- тетрафенилпорфирина и его металлокомплексов 48
3.1.1. Синтез нейтральных карборанилпорфиринов 50
3.1.2. Синтез карборанилпорфиринов с использованием 9-0- и 9-м-изоцианатокарборанов и некоторые их превращения 51
3.1.3. Синтез анионных дикарбаундекаборатных производных порфиринов 55
3.1.4. Синтез монокарборанилпорфиринов 57
3.2. Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX 60
3.3. Исследование биологической активности полученных соединений
3.3.1. Биологическая активность карборанилпорфиринов на основе синтетических порфиринов 64
3.3.2. Биологическая активность карборанилпорфиринов на основе природных порфиринов 69
4. Экспериментальная часть 75
Выводы 92
- Карбораниллорфирины на основе синтетических порфиринов
- Карборанилфталоцианины
- Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX
- Биологическая активность карборанилпорфиринов на основе природных порфиринов
Введение к работе
Современные методы лечения больных злокачественными новообразованиями предполагают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и лекарственную терапию. Селективное поражение опухоли при минимальном повреждении здоровых тканей в облучаемом объеме является важным условием эффективности противоопухолевой терапии. Одним из направлений в решении проблемы избирательного разрушения злокачественных опухолей является развитие бинарных противоопухолевых стратегий, таких как борнейтронзахватная (В-НЗТ) и фотодинамическая (ФДТ) терапии. Принцип действия В-НЗТ - разрушение злокачественных клеток в результате индукции локального радиоактивного излучения в биологических объектах, содержащих нерадиоактивный изотоп 10В, под действием тепловых нейтронов. Принцип действия ФДТ близок к В-НЗТ, и заключается в разрушении злокачественных новообразований при действии на опухоль, содержащую фотосенсибилизатор, света с определенной длины волны.
К сожалению, известные препараты для В-НЗТ меркаптоундекагидрододекаборат (BSH) и 4-дигидроксиборилфенилаланин (ВРА), используемые при лечении опухолей мозга и меланомы, являются не очень эффективными. Они обеспечивают достаточную концентрацию бора в опухоли (25-30 мг/кг), но не всегда создается необходимый градиент концентраций бора между опухолью и здоровой окружающей тканью.
Одним из путей поиска препаратов для В-НЗТ является использование полиэдрических соединений бора - карборанов (достижение необходимой терапевтической концентрации изотопа 10В), а также использование соединений, обладающих способностью избирательно накапливаться в быстро пролиферирующих тканях. В этом плане особый интерес представляют порфирины - макроциклические молекулы, входящие в состав простетических групп ряда ферментов, участвующих в регуляции важных физиологических процессов, включая перенос кислорода, транспорт электронов в дыхательной цепи и др. Относительно низкая токсичность порфиринов в отличие от традиционных препаратов, применяемых в химиотерапии и их способность накапливаться преимущественно в клетках, претерпевших злокачественную трансформацию, обеспечивают важные фармакологические преимущества этих соединений для применения в В-НЗТ и ФДТ. Полученные результаты по синтезу и изучению физико-химических свойств карборанилпорфиринов расширяют и углубляют фундаментальные знания об этом уникальном классе соединений.
Таким образом, разработка стратегии синтеза карб оран ил содержащих порфиринов и исследование их биологической активности является актуальной задачей и имеет как фундаментальное научное значение, так и практический интерес.
Карбораниллорфирины на основе синтетических порфиринов
Первые карборанилпорфирины были использованы Хаусгальтером и Рудольфом [45,46]. Эти авторы синтезировали карборанилпорфирины для использования в качестве катализаторов обратимого мультиэлектронного восстановления малых молекул - 02 и N2. Попытки получения вышеуказанными авторами простейших карборановых аналогов тетрафенилпорфирина конденсацией о-карборанилальдегида с пирролом оказались неудачными, в основном, из-за большого размера карборанового ядра. В случае менее стерически затрудненного о-карборан-1-ил-ацетальдегида, конденсация его с пирролом в кипящей пропионовои кислоте (реакция Ротмунда) дала карборанилпорфирины 38, 39, в которых клозо-карборановые полиэдры связаны с порфириновым макроциклом через метиленовый заместитель [45,46]. Кроме того, были получены металлокомплексы этих карборанилпорфиринов, содержащие в координационной сфере порфирина кобальт [47] или железо [46]. Одним из важных требований к препаратам для В-НЗТ является их водорастворимость. В большинстве случаев достичь этого можно превращением клозо-карборановых полиэдров до анионов нибо-дикарбаундекаборатов. Расщепление ллозо-карборановых полиэдров карборанилпорфирина 39 25% раствором пиперидина в пиридине привела к водорастворимому карборанилпорфирину, содержащему четыре анионных ншЭо-карборановых фрагмента [45,46]. Авторами [48] конденсацией тетра(о-аминофенил)порфирина с хлорангидридом карборанкарбоновои кислоты с последующим расщеплением клозо-кар бора новых полиэдров до анионных шдо-аналогов, был синтезирован борированный порфирин 40 (ВТРР), содержащий 4 нидо-карборановых полиэдра, связанные с порфирином по о-положениям фенильных колец. Предварительные испытания показали, что ВТТР накапливается преимущественно в печени и карциноме яичника. В работе [49] изучалось накопление бора в глиоме человека, привитой мышам, которым препарат вводился внутриперитониально, подкожно или обоими путями. Концентрации бора составили до 18 мкг/г опухоли в случае глиомы и до 45 мкг/г опухоли в случае карциномы яичника. Измерения проводили на 7-й день после введения препарата, при этом концентрация бора в печени составляла 102 мкг/г. Концентрация бора в глиоме была увеличена до 33 мкг/г опухоли при введении дополнительных количеств препарата в течение первых трех дней. Однако, несмотря на достаточно хорошие результаты, оказалось, что препарат токсичен для клеток крови. Авторами [30] описывается синтез карборанилпорфирина 41, который представляет собой борированное производное тетрафенилпорфирина.
Получение карборанилпорфирина на основе тетрафенилпорфирина проводилось путем монопиррольной конденсации, по методике [50], с выходом конечного продукта 42%. Для достижения водорастворимости карборановые полиэдры переводились в анионные дикарбаундекабораты при кипячении в метанольнои щелочи. Карборанилпорфирин 41 был выделен с выходом 50%. Этот карборанилпорфирин позволял достигалать необходимой терапевтической концентрации бора в опухоли, но он оказался токсичным для использования его в качестве препарата для В-НЗТ. Введение этого препарата вызывало изменения гематологических показателей и активности ряда циркулирующих ферментов. В связи с этим, был создан новый борированный порфирин 42, получивший название тетракарборанилфенилпорфирина (TCP) и получены его медный (СиТСР) 43 и никелевый (NiTCP) 44 комплексы. Биологические исследования NiTCP на мышах и CuTCP на крысах показали, что эти соединения не являются токсичными при введении их в организм в терапевтических дозах. После введения NiTCP животным-опухоленосителям концентрация бора в опухоли через 78 часов была в 85 раз выше, чем в крови и в 10 раз выше, чем в нормальных клетках мозга [51]. Для CuTCP данное соотношение составляло 39:1 и 20:1, соответственно [52]. NiTCP оказался нетоксичным для неопухолевых клеток. Таким образом, был сделан вывод, что NiTCP является перспективным агентом для доставки бора в опухоль [53]. Помимо соединения 43 получен препарат СиТСРН (45) [54]. Его исследования на глиоме человека, привитой крысам, показали следующие результаты: при введении препарата в концентрации 450 мг/кгтела через четыре дня концентрация бора в опухоли составляла 114 мкг/г опухоли, в окружающей ткани - 50 мкг/г, при этом концентрация бора в крови составляла всего лишь 5 мкг/г. Для сравнения, для применяющихся в клинике ВРА и BSSB (димера BSH), лекарственные формы которых являются водорастворимыми, не наблюдалось существенной разницы между концентрацией бора внутри опухоли и в перифокальной зоне [55,56]. Возможная причина этому - низкие молекулярные массы BSSB и ВРА (менее 500), из-за чего препараты не преодолевают барьер кровь/мозг, как это происходило в случае с СиТСРН, который, хотя и липофилен, но имеет молекулярный вес более 1300.
Таким образом, СиТСРН может быть полезным препаратом для доставки большого количества бора в злокачественные опухоли человека, что является непременным условием для его применения в В-НЗТ. Карборановые производные тетрафенилпорфирина 46-49 были синтезированы из 5,10,15,20-тетра(л-аминофенил)порфирина и хл оран гидр идо в 9-о-карборанилуксусной, 4-(9 -о-карборанил)валериановой, 4-(9 -м- карборанил)валериановой и 9-м-карборанкарбоновой кислот [57]. Главным отличием этого синтеза являлось то, что карборановые полиэдры были связаны с порфириновым макроциклом через атом бора полиэдра. Таким образом, в карборановом ядре сохраняются две незамещенные группы СН, что позволяет вводить различные заместители к атомам углерода каждого карборанового ядра и, таким образом, модифицировать гидрофобные/гидрофильные свойства синтезированных карборанилпорфиринов. Выходы карборанилпорфиринов 46-48 составляют 28-40%. Выход карборанилпорфирина 49 составил всего 2%. В основном был получен полимерный красно-фиолетовый продукт, нерастворимый в органических растворителях. В связи с рядом важных применений карборанилпорфиринов в медицине (БНЗТ, ФДТ и др.) важно изучить их спектральные характеристики и их взаимодействие со светом. Для порфирина 46 были изучены электронные и флуоресцентные спектры, анализ которых показывает, что ковалентное связывание молекул карборана с тетрафенилпорфирином приводит к значительным изменениям в тг-системе 20-членного ароматического макроцикла: положения максимумов в электронных и флуоресцентных спектрах сдвигаются в красную область на 3-8 нм по сравнению с исходным тетрафенилпорфирином [58]. Наличие довольно существенного красного сдвига в системе карборанилпорфиринов свидетельствует об участии карборанового ядра в создании полисопряженной системы и его способности проявлять свойства трехмерного ароматического заместителя. Таким образом, введение карборановых заместителей в порфирин приводит к специфическим донорно-акцепторным системам, влияющим на их кислотно-основные характеристики. В работе [59] использовался метод монопиррольной кондесации для получения следующих карборанилпорфиринов: Конденсация пиррола с (м-карборан-9-ил)ацетальдегидом, не привела к образованию порфириновой системы, в то время как 4-(о- и м-карборан-9-ил)пентанали давали карборанилпорфирины 50, 51 с выходом 38 - 41 %. Авторы [60] на основе 2-[(2-карбокси)винил]-5,10,15,20- тетрафенилпорфирина и 9-гидроксиметил-м-карборана, 1-гидроксиметил-о-карборана, 3-амино-о-карборана получили карборансодержащие производные тетрафенилпорфирина 52-54.
Карборанилфталоцианины
В отличие от карборанилпорфиринов, работ по синтезу и биологическим исследованиям борированных фталоцианинов очень мало. Опубликовано лишь несколько статей, описывающих синтез ковалентно связанных производных фталоцианинов и полиэдрических карборанов и анионных додекаборатов. Так как фталоцианины способны образовывать очень устойчивые комплексы с металлами, был получен ряд производных металл о фталоцианинов, содержащих карборановые кластеры. Первый борированный фталоцианин 102 был получен реакцией 1-(4-аминофенил)-о-карборана с кобальтовым комплексом тетрасульфонилхлорида фталоцианина. Незамещенные S03H группы были переведены в натриевые соли для улучшения растворимости в воде [10,87]. Первый детально охарактеризованный водорастворимый борированный фталоцианин 103 был синтезирован из карборанилзамещенного фталонитрила. В этом соединении четыре клозо-карборановых фрагмента ковалентно связаны с фталоцианиновой структурой. Водорастворимость достигнута гидролизом групп метиловых эфиров, за которым последовал ионный обмен с образованием натриевых солей карборанилфталоцианина. Этот борированный фталоцианин, по мнению авторов, может оказаться перспективным для В-НЗТ [88]. Борсодержащие фталоцианины 104-107, имеющие в качестве борной компоненты клозо-додекаборат, получены взаимодействием моноамино-ундека гидр о-хлозо-додекаборатн ого аниона с хлорметил-замещенным фталоцианином. Соединения обладали хорошей водорастворимостью за счет присутствия в молекуле анионов додекабората [89]. Также были проведены первичные биологические испытания этих соединений [90,91]. Помимо этого, был получен борированный фталоцианин 108 на основе цинсодержащего фталоцианина и клозо-додекаборатного аниона и исследованы его фотосенсибилизирующие свойства [92]. Оказалось, что этот препарат проявляет такую же способность к фотосинтетическому окислению, как и большинство фотодинамически активных сенсибилизаторов [93]. Биологические испытания показали хорошее накапливание этого соединения в опухоли и высокую эффективность как фотосенсибилизатора in vivo. Молекулярные структуры фталоцианинов устойчивы к воздействию тепловых нейтронов [96]. С этой точки зрения фталоцианины представляются более предпочтительными для В-НЗТ, чем порфирины; однако они крайне фоточувствительны, что ограничивает их практическое использование.
Более того, фталоцианины не подвергаются катаболизму в тканях. Их длительное присутствие в организме может вызывать повреждение тканей, этого недостатка лишены порфирины - компоненты природных метаболитов. Разработаны подходы к созданию конъюгатов природных и синтетических порфиринов с бор соде ржа щи ми полиэдрами - препаратов, потенцирующих эффект лучевого воздействия на злокачественные опухоли и/или способных вызывать гибель опухолевых клеток самостоятельно. Порфирины и их металлокомплексы обладают рядом уникальных свойств, которые особенно привлекательны в бинарных противоопухолевых стратегиях. Как показали биологические исследования, многие карборанилпорфирины нетоксичны в терапевтических концентрациях. Порфирины, в силу особенностей своей химической структуры (20-членный макроцикл с системой сопряженных связей, наличие кислотных (-NH-) и основных(-Ы=) атомов азота, формирующих координационный центр) являются перспективными агентами для доставки бора в опухоль и способны стабилизировать in vivo комплексы с ДНК. Кроме того, легкость их функционализации по периферии макроцикла позволяет изменять гидрофильность/гидрофобность системы в широком диапазоне концентраций. Наличие в порфиринах лабильной системы сопряженных л-связей позволяет понижать потенциальные барьеры окислительно-восстановительных и кислотно- основных реакций, что способствует прохождению лекарственных форм подобных соединений через мембраны клеток. Все оти свойства порфиринов удовлетворяют основным требованиям к противоопухолевм препаратам: преимущественное накопление и длительное задерживание в опухоли, минимальная общерезорбтивная токсичность, высокая фото/радибсенсибилизирующая активность. Желательно, чтобы препарат взаимодействовал с компонентами ядра опухолевой клетки. Большинство карборанилпорфиринов исследованы на моделях трансформированных клеток.
Хотя клеточные культуры не заменяют комплексную физиологию организма, данный подход необходим для выявления молекулярных мишеней новых препаратов, установления диапазона цитотоксических концентраций и оценки целесообразности дальнейшей разработки. Применение борированных порфиринов в В-НЗТ и ФДТ позволяет активировать разнообразные механизмы гибели опухолевых клеток, обусловливая перспективность использования этих методов против опухолей, устойчивых к другим воздействиям. Постоянное внимание исследователей к карборанилпорфиринам как классу противоопухолевых соединений позволяет надеяться на создание препаратов для клинического применения. Борированные порфирины относятся к, так называемым, препаратам «третьего поколения», которые пока еще не достигли стадии применения в клинике. Недостаточная растворимость и определенная токсичность порфиринов затрудняют практическое использование их борсодержащих производных. Высокая стоимость борсодержащих порфиринов также ограничивает их применение. Большинство синтезированных к настоящему времени карборанилпорфиринов проверялось на клеточном уровне и лишь несколько соединений исследовались на животных. Хотя тестирование in vitro имеет определенные ограничения и не может заменять комплексную физиологию моделей in vivo, данные эксперименты в какой-то степени могут выявить перспективность подобных соединений и целесообразность их дальнейшего изучения. Поэтому представляется важным разработать новые подходы к синтезу коньюгатов синтетических и природных порфиринов с полиэдрическими карборанами и монокарборанами, обладающих повышенной гидрофильностью и изучить биологические механизмы цитотоксичности новых соединений для опухолевых клеток человека. Исходным соединением в синтезе борированных порфиринов служил 2-формил-5,10,15,20-тетрафенилпорфирин 1 и его металлокомплексы Си (2), Со (3), Ni (4), Zn (5), Pd (6). Тетрафенилпорфирин получали методом монопиррольной конденсации из пиррола и бензальдегида [97]. Далее в координационную сферу порфирина вводили атом металла с использованием соответствующих ацетатов. Формилирование проводилось взаимодействием металлокомплексов тетрафенилпорфирина с комплексом Вильсмейера с последующим щелочным гидролизом образующейся иммониевой соли и выделением формильных производных [98]. Безметальный порфирин 1 получали при действии на иммониевую соль кобальтового комплекса концентрированной серной кислоты. Цинковый комплекс 5 получали введением атома цинка в координационную сферу порфирина 1 с помощью соответствующего ацетата.
Синтез карборанилпорфиринов на основе протогемина IX
Синтезу борированных производных природных порфиринов как транспортных систем для доставки бора в опухоль, уделяется большое внимание, обусловленное низкой токсичностью и высокой селективностью накопления этих соединений в клетках опухоли [15-17, 28-32]. Одно из наиболее перспективных к настоящему времени среди полученных соединений - калиевая соль тетра-кис-карборанкарбоксильного эфира-2,4-бис-(а,р-дигидроксиэтил) дейтеропорфирина IX (ВОРР). В настоящее время ВОРР проходит I стадию клинических испытаний как препарат для ФДТ, а также рассматривается в качестве потенциального агента для В-НЗТ [19]. Также ранее был разработан метод синтеза карборанилзамещенных производных природных порфиринов - дейтеропорфирина IX и протопорфирина IX [40, 41, 43] - путем активации карбоксильных групп порфирина ди-mpem-бутилпирокарбонатом (ВосгО) или пивалоилхлоридом. Метод позволяет получать нейтральные и анионные борированные аналоги природных порфиринов, в которых борсодержащие полиэдры соединены с порфириновым циклом эфирной или амидной связями. Развитием нашего подхода является создание серии новых карборанил- и монокарборанилпроизводных катионного протогемина IX (41) - важнейшего природного порфирина, входящего в состав гемоглобина в качестве простетической группы. Кроме того, доступность этого соединения позволяет получать на его основе карборанилпорфирины в количествах, необходимых для всесторонних исследований. Следует отметить, что взаимодействие порфирина 41 с различными типами борных полиэдров дает возможность регулировать гидрофильные/гидрофобные свойства борированных производных 41 за счет периферических функциональных групп и ионной природы молекулы в целом. Исследование биологических свойств новых соединений позволило выделить по крайней мере одно - 1,3,5,8-тетраметил-2,4-дивинил-6(7)-[2 -(клозо-монокарборан-1-ил)метоксикарбонилэтил]-7(6)-(2-карбоксиэтил)порфиринато железо (III) (49), обладающее выраженной противоопухолевой активностью при отсутствии общерезорбтивной токсичности у экспериментальных животных. При взаимодействии порфирина 41 с нейтральным 9-гидроксиметил-м-карбораном 42 в системе Ру-СН2СІ2 получен катионный дикарборанилзамещенный порфирин 43. Карборан в карборанилпорфирине 44 связан сложноэфирной связью с порфириновым макроцилом через атом бора полиэдра. Аналогичным методом при реакции 41 с нейтральным 3-амино-о-карбораном 44 был синтезирован карборанилпорфирин 45, в котором карборан связан с порфирином амидной связью через атом бора полиэдра.
Выходы продуктов 43 и 45 составили соответственно 71 и 65%. При деборировании клозо-полиэдров в соединении 45 BU4NF2H2O в ТГФ был получен (с выходом 85%) анионный карборанилпорфирин 46, содержащий два водорастворимых нія)о-7,8-дикарбаундекаборатньіх фрагмента. Замена катиона Bu4N+ на катионы Na+ или 1_Г приводила к водорастворимым формам соединения 46 Необычный результат был получен при реакции порфирина 41 с монокарборановыми спиртами 1-гидроксиметил-клозо-монокарборанилцезием 47 и {1-[1 -гидрокси(фенил)метил]-клозо-монокарборанил}цезием 48 [42], где образуются только цвиттер-ионные карборанилпорфирины 49 и 50 с выходами 57 и 59%, соответственно, в которых монокарборановые заместители связаны с порфириновым макроциклом сложноэфирной связью через атом углерода полиэдра. Хотя 47 и 48 брали с избытком 4:1 по отношению к 41, нами были выделены только монозамещенные цвиттер-ионные монокарборанилпорфирины 49 и 50. Это, по-видимому, связано с особенностями электронного строения монокарборанового полиэдра, что делает образование цвиттер-иоиного продукта предпочтительным. В отличие от анионного монокарборана, нейтральные карбораны 42 и 44 легко образуют дизамещенные протогемины 43 и 45. Мы показали, что при реакции 49 с 3-амино-о-карбораном 44 образуется цвиттер-ионный дизамещенный протогемин 51 с выходом 63 %, содержащий два борных полиэдра - клозо-монокарборановый (анионный) и карборановый (нейтральный). Таким образом, для объединения преимуществ ФДТ (возможность локального воздействия на опухоль без повреждения окружающих тканей, контроль наличия препарата в опухоли по его флуоресценции) и В-НЗТ (лечения глубоко расположенных опухолей или опухолей, диаметр которых превышает 1 см) нами был синтезирован ряд карборанил- и монокарборанилпроизводных протогемина IX, предположительно обладающих двойным действием: неитронзахватным и фотосенсибилизирующим [106,107]. В качестве природного порфирина нами впервые был использован [108] протогемин IX- важнейший природный порфирин, входящий в состав гемоглобина в качестве простетической группы. Отсутствие токсичность в исследованиях как in vitro, так и in vivo (см. главу 3.2.) позволяет предположить, что подобные карборанилпорфирины могут оказаться перспективными агентами для бинарных методов терапий. Правомерно предположить, что новые карборанилпорфирины будут проявлять различную цитотоксичность.
Поэтому соединения, способные вызывать гибель опухолевых клеток, могут служить прототипами самостоятельных противоопухолевых препаратов, т.е. использоваться без комбинирования с лучевыми воздействиями. Нетоксичные же соединения как самостоятельные лекарства непригодны и подлежат испытаниям в бинарных методах терапии. В качестве модели исследования цитотоксичности использовали культивируемые клетки опухолей человека А549 (аденокарцинома легких) и К562 (лейкоз). В параллельных экспериментах тестировали токсичность новых соединений для нормальных клеток, используя первичную культуру фибробластов кожи человека (ФКЧ). Для исследований в культурах клеток новые вещества растворяли в диметилсульфоксиде до концентрации 10 мкМ. Дальнейшие разведения проводили в водных средах; конечная концентрация диметилсульфоксида в культуре клеток составила около 0,1%- Гибель клеток, определяемую по восстановлению клетками 1 -(4,5-д и метил тиазол-2-ил )-3,5-дифенилформазана (МТТ-тест), регистрировали через 48-72 час. инкубации клеток с карборанилпорфиринами [109-112]. Вначале провели скрининг всей серии новых соединений на цитотоксичность. Соединения 7, 9, 11, 14, 16-18, 19, 21-23 не вызывали гибель клеток, что является необходимым условием для бинарных методов лечения, в то время как для медных комплексов карборанилпорфиринов (8, 10, 15, 20, 34) наблюдался выраженный цитотоксический эффект для опухолевых клеток. Так, сравнение активности о-метил- и м-изопропил-клозо- и нидо-карборанилпроизводных медного комплекса ТФП (8,10,34) показало, что наибольшую цитотоксичность проявляло соединение 8 (концентрация, вызывающая гибель 50% клеток, составила около 13 Ю"6 М) (таблица 4). Вещества 10 и 34 также были токсичны для клеток А549 в микромолярных концентрациях. Важно, что медные комплексы проявляют избирательную токсичность только к опухолевым клеткам, в то время как в параллельных экспериментах они нетоксичны для неопухолевых клетках в концентрации до 100 мкМ. Это может быть объяснено преимущественным наличием рецепторов для порфиринов в опухолевых клетках. Данное направление сейчас активно исследуется в литературе.
Биологическая активность карборанилпорфиринов на основе природных порфиринов
В отличие от синтетических карборанилпорфиринов, природные борированные порфирины не обладают цитотоксичн остью по отношению к нормальным и опухолевым клеткам. Для биологических испытаний было выбрано соединение 49, обладающее повышенной гидрофильностью благодаря анионному борсодержащему полиэдру и наличию гидрофильной карбоксильной группы. Вещество 49 (до 100 мкМ, 72 час. воздействия) не вызывало торможение пролиферации культивируемых клеток лейкоза К562, рака толстой кишки НСТ116, рака молочной железы MCF-7 и неопухолевых фибробластов кожи. В испытаниях на крысах максимально переносимая доза 49 составляла 100 мг бора/кг массы тела (650 мг 49/кг массы тела). Эти предварительные исследования позволили предположить, что 49 может быть использовано как противоопухолевый агент in VIVO. Изучение противоопухолевой активности 49 было выполнено на модели саркомы М1, прививаемой под кожу конечностей крыс. Животным-опухоленосителям вводили 49 внутрибрюшинно в концентрациях 2,5-20 мг/кг; через 24 часа опухоль подвергали подвергали световому облучению. В качестве источника применяли лампу АТО - 150 с фильтром 630 нм. (плотность энергии излучаемого света 300 Дж/см2). Размеры остаточной опухоли определяли в течении 21 дня после светового воздействия. Коэффициент (К) прироста объема опухоли к дню t после облучения подсчитывали по формуле К = (VrV0)/V0, где Vo - первоначальный объем опухоли, Vt - объем опухоли в день t. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле ТРО = (V - Ve )/Vk) 100%, где Vk - объем опухоли у животных, не получавших облучение, Ve - объем опухоли после облучения. Важно отметить, что на всем протяжении экспериментов у животных не отмечено снижения подвижности, изменения пищевых стереотипов и иных нарушений поведения; сохранялась целостность волосяных покровов. Это свидетельствует об отсутствии общерезорбтивной токсичности вещества 49. Изучение динамики роста опухоли М-1 после облучения, проведенного через 3 и 24 часа после введения препарата 49 при одинаковой плотности энергии излучения света (300 Дж/см2), а также одной и той же дозе препарата (2.5 мг/кг массы животного) показало, что эффективность ее, на первый взгляд, выглядит одинаковой (Таблица 5).
Однако в опыте, в котором облучение проводили через 3 часа после введения 49 (опыт 1), процент торможения роста опухоли (ТРО) относительно контроля был ниже, чем в опытной группе, где облучение проводили через 24 часа (опыт 2). Так, в первой группе динамика ТРО по срокам наблюдения составляла: на 3 сутки 9%; на 7 сутки - 64%, т.е. торможения практически не было; на 10 сутки -17,4%; на 14 сутки - 5,4% и на 21 сутки - 34,1%, в то время как при проведении облучения через 24 часа после введения указанного препарата на соответствующих сроках ТРО равнялось: 31,6, 16,5, 24,8, 47,1, и 45,0 %. Более того, при облучении через 3 часа ни у одного животного не наблюдалось полной регрессии опухоли, в то время как при облучении через 24 часа подобная регрессия к 21 суткам наступила в 22,2% случаев (под полной регрессией опухоли понимается отсутствие пальпируемой опухоли). Исследования показали, что проведение облучения с дозой препарата 2,5 мг/кг, приводило к торможению роста опухоли относительно контроля (рис 3). Коэффициент абсолютного прироста опухоли был ниже, чем в контроле. Статистически значимое снижение коэффициента имело место на всех, за исключением 10 и 21 суток, сроках наблюдения (Таблица 5). Увеличение количества вводимого препарата до 5 мг/кг способствовало повышению эффективности ФДТ. Это проявлялось в статистически значимом снижении коэффициента абсолютного прироста опухоли на протяжении всего срока наблюдения (21 суток) На 3 сутки у 8 из 9 животных наблюдалось не только замедление темпа роста опухоли по сравнению с контролем, но и уменьшение ее объема по сравнению с исходным. То есть наступала частичная ее регрессия. Полная регрессия опухоли имела место у 22,3% крыс. Проведение ФДТ с использованием фотосенсибилизатора в дозе 10 мг/кг в целом привело к увеличению ее эффективности относительно контроля. Также, как и при введении препарата в дозе 5 мг/кг, имелось статистически достоверное снижение коэффициента абсолютного прироста опухоли на всех сроках исследования результатов ФДТ между группами животных, которым вводили 5 мг/кг и 10 мг/кг, процент ТРО в последнем случае был выше и составлял: на 3 сутки 58,2% против 31,6% при дозе 5 мг/кг; на 7 сутки 81,0% против 16,5%; на 10 сутки 72,0% против 24,8%; на 14 сутки 78,3% против 47,1% и 73,6% против 45,0% на 21 сутки. Таким образом применение препарата 49 для ФДТ приводит не только к статистически значимому торможению роста опухоли по сравнению с контролем, но и к значительной регрессии опухоли. При этом наиболее эффективной для ФДТ оказалась доза в 20 мг/кг массы животного (рис 4). Кроме того, в качестве контроля, исследовался исходный протогемин IX (41). Это соединение вводили животным-опухоленосителям внутрибрюшинно в концентрациях 5 мг/кг, с последующим облучением через 24 часа.
Размеры остаточной опухоли определяли на протяжении 21 дня после воздействия (рис. 5). Было установлено, что 41 не проявляет эффектов подобно 49. Растворители для реакций готовили согласно стандартным методикам. Реагенты из Sigma-Aldrich Fine Chemicals использовались без дальнейшей очистки. Реакции проводили в атмосфере аргона Индивидуальность полученных соединений и ход реакции контролировали тонкослойной хроматографией на пластинках Silufol UV - 254 (Kavalier, Чехословакия) и DC-Alufolien Aluminium oxid 60 F254 neutral (Тур E) (Merck) Очистку полученных веществ проводили методом и колоночной хроматографии на силикагеле Merck L 0.040-0.063 и L40/100 (Чехословакия). ИК-спектры получены в таблетках КВг и в вазелиновом масле на приборе UR-20. Электронные спектры сняты на спектрофотометре JASCO UVA/IS-7800. Спектры 1Н и 11В ЯМР регистрированы на спектрометре Bruker АМХ - 400 в дейтерохлороформе CDCh и дейтероацетоне (С03)г)СО с рабочей частотой 400 МГц. Масс-спектры получены на время-пролетном масс-спектрометре Reflex III фирмы Bruker методом MALDI с использованием 2,4,5- тригидроксиацетобензойной матрицы. Общая методика получения о-метил- и м-изо про пил -клозо-карборанилпроизводных5,10,15,20-тетрафенилпорфирина (7-11). К раствору 0.1 ммоль соответствующего формилпорфирина в 10 мл тетрагидрофурана прибавляли при 20 суспензию литийпроизводного (получали прибавлением гексанового раствора бутиллития (0.4 ммоль, 1.3М) к раствору 0.4 ммоль клозокарборана в 5 мл тетрагидрофурана в токе аргона), перемешивали 1 час в токе аргона. Реакционную массу выливали в 15 мл воды, экстрагировали хлористым метиленом (3 5) мл. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток очищали на колонке с силикагелем (Г20) см, элюент- хлороформ-гексан (1:1), хлороформ.
