Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще остается весьма проблематичным. Поэтому поиск и изучение новых противоопухолевых препаратов по-прежнему является актуальной проблемой современной науки. Известно, что около половины всех имеющихся лекарственных препаратов создано на основе природных соединений. Это связано с тем, что природные биологически активные соединения нередко являются очень активными и малотоксичными. Следует также отметить, что эти биомолекулы были отобраны в ходе эволюционных процессов как наиболее эффективные, и поэтому они являются хорошими моделями для дальнейших синтетических модификаций.
Известно, что биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах. За последние 25 лет из морских гидробионтов было выделено более 20000 морских природных соединений, несколько десятков из которых находятся на различных стадиях клинических испытаний в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов.
Наиболее богатым источником морских биологически активных соединений продолжают оставаться губки. Данный факт связывают с «неподвижным» образом жизни этих животных и, как следствие, необходимостью вырабатывать защитные химические вещества, которые могут не только играть определённую экологическую и физиологическую роль, но и выполнять другие биологические функции.
Таким образом, поиск и выделение вторичных метаболитов морских губок, исследование их химических структур, а также молекулярных механизмов биологического действия является актуальным с точки зрения получения новых веществ с уникальной активностью, в том числе противоопухолевой.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было выделение, установление структуры, а также изучение противоопухолевой активности и некоторых аспектов молекулярных механизмов действия ааптаминовых алкалоидов из морской губки Aaptos sp. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Разработать схемы и провести выделение в индивидуальном виде ааптаминовых алкалоидов, ответственных за противоопухолевую активность экстракта губки Aaptos sp.;
Установить строение выделенных соединений;
Исследовать канцерпревентивную, цитотоксическую и цитостатическую противоопухолевую активность выделенных алкалоидов, а также возможные механизмы этой активности;
С помощью методов протеомики и молекулярной биологии исследовать влияние выделенных алкалоидов на протеом опухолевых клеток человека и экспрессию некоторых генов.
Основные положения, выносимые на защиту.
Морская губка Aaptos sp. содержит З-(УУ-морфолинил)-деметилоксиааптамин, 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и 6-(7У-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин, являющиеся новыми представителями класса ааптаминовых алкалоидов.
Ааптаминовые алкалоиды, выделенные из морской губки Aaptos sp. обладают канцерпревентивной и цитотоксической противоопухолевой активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин проявляют одинаковую цитотоксическую активность по отношению к лекарственно-устойчивым NT2-R и лекарственно-чувствительным NT2 опухолевым клеткам человека.
Исследуемые алкалоиды по-разному влияют на транскрипционную активность ядерных факторов АР-1, NFkB и р53. Этот эффект зависит от концентрации и химической структуры соединений.
Ааптамин в нецитотоксических концентрациях оказывает антипролиферативный эффект на опухолевые NT2 клетки, останавливая клеточный цикл в фазе G2/M.
Цитотоксическое действие ааптамина обусловлено активированием фосфорилирования ERKs, повышением уровня транскрипционной активности АР-1, NFkB и р53 ядерных факторов с последующей индукцией апоптоза опухолевых клеток.
Под воздействием нецитотоксических концентраций ааптамина на NT2 клетки происходит гипузинирование эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1, фосфорилирование кофилина-1, ап-регуляция CRABP2 с одновременным увеличением количества кодирующей его мРНК, а также изменение соотношения изоформ альфа-энолазы.
Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин по-разному влияют на протеом NT2-R опухолевых клеток, что выражается в воздействии на внутриклеточные уровни разных белков. Ааптамин в первую очередь проявляет свою антипролиферативную активность, тогда как деметилоксиааптамин и изоааптамин - цитотоксическую активность, реализующуюся по апоптотическому пути.
Научная новизна и практическая иенность работы. Из губки Aaptos sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Изучены ЯМР- и масс-спектры новых соединений, а также их некоторые химические свойства. Впервые выявлена сильная канцерпревентивная активность соединений этого ряда. Получены новые ценные данные о противоопухолевой активности ааптаминовых алкалоидов in vitro, в частности, их про-апоптотической
активности, влиянии на клеточный цикл и транскрипционную активность некоторых ядерных факторов. Исследование протеома клеток, обработанных ааптаминовыми алкалоидами, выявило некоторые уникальные изменения в белковом составе этих клеток. В частности, в обработанных ааптамином NT2 и NT2-R клетках была зафиксирована активация эукариотического фактора инициации трансляции 5А-1 (еШ5А), подобный эффект никогда ранее не наблюдался при действии низкомолекулярных веществ на клетки. Впервые были охарактеризованы некоторые особенности механизма действия ааптаминовых алкалоидов. Всё это создаёт основу для дальнейших исследований веществ этого типа как потенциальных хемопревентивных и терапевтических противоопухолевых препаратов.
Апробация работы. Результаты работы представлены на международных симпозиумах «Targeted Anticancer Therapies-2012» в 2012 г., Амстердам, Нидерланды, и «Targeted Anticancer Therapies-2011» в 2011 г., Париж, Франция; на Второй международной российско-корейской конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в 2010 г., Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г., Ханой, Вьетнам; на XII Всероссийской молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2009 г., Владивосток, Россия; на Первом дальневосточном международном симпозиуме, посвященном наукам о жизни «Life Science», 2008 г., Владивосток, Россия; на X Международной молодёжной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, 2007 г., Владивосток, Россия; а также на других конференциях.
Публикации. Всего опубликовано 27 работ - 9 научных статей, 1 патент и 17 тезисов докладов. Из них по теме диссертации 13 работ, в том числе 3 научных статьи, 1 патент и 9 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 144 цитируемых работы. Работа изложена на 145 страницах, содержит 35 рисунков и 14 таблиц.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н. Фёдорову С.Н. Автор благодарит также к.х.н. Шубину Л.К. за неоценимый вклад в химическую часть настоящего исследования; академика Стоника В.А. и д.х.н. Макарьеву Т.Н. - за ценные консультации; м.н.с. Кузьмич А.С. и н.с. Радченко О.С. - за помощь в проведении ряда экспериментов; д.х.н. Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. - за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с. Красохина В.Б. - за определение видовой принадлежности изученных морских организмов; к.х.н. Ермакову СП. за ряд советов по организации биологической части исследования и чл.-корр. РАН Васьковского В.Е. - за помощь в работе с научной литературой и сборе информации. Автор также выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф при университете Гамбурга (Гамбург, Германия), и в особенности,
доктору Фридману Хонекеру, доктору Штефану Балабанову и профессору Карстену Букамаеру.
Используемые сокращения. 2Б-Вестерн-блоттинг - двумерный Вестерн-блоттинг; 2D-PAGE - двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, используемый при анализе протеома клеток; АР-1 - активаторный белок-1, транскрипционный фактор; CRABP2 - клеточный ретиноевая кислота-связывающий белок 2; DHS - деоксигипузин синтаза; DOHH - деоксигипузин гидроксилаза; eIF5A - эукариотический фактор инициации трансляции 5А-1; EGF - эпидермальный фактор роста; GC7 - Ш-гупнил-1,7-диаминогептан; 1С5о - (Inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%; INCC5o - (Inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества, при которой происходит ингибирование колонеобразования (трансформации) клеток JB6 Р+ С141 в мягком агаре на 50%; MG-132 - М-(бензилокси-карбонил)лейциниллейциниллейциналь; MTS - 5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4,5-диметилтиазолил)-3-(4-сульфофенил) тетразолий, внутренняя соль; NFkB - ядерный фактор кВ, транскрипционный фактор; pi - изоэлектрическая точка; противоопухолевая активность - в данной работе - активность вещества по отношению к опухолевым клеткам, так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации.
