Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Литературный обзор 10
2.1. Общее строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий 10
2.2. Строение области кора липополисахаридов грамотрицательных баїстерий 13
2.2.1. Семейство Aeromonadaceae 14
2.2.1.1. Род A eromonas 14
2.2.2. Семейство Alcaligenaceae 15
2.2.2.1. Род Bordeteila 15
2.2.3. Семейство Alteromonodaceae 16
2.2.3,1. Род Shewanella 16
2.2.4. Семейство Bradyrhizobiaceae 17
2,2.4.1. Род Bradyrhizobium 17
2.2.5. Семейство Burkholderiaceae 17
2.2.5.1. Род Burkholderia 17
2.2.6. Семейство Campylobacteraceae 18
2.2.6.1. Род Campylobacter 18
2.2.7. Семейство Chlamydtaceae 20
2.2.7.1. Род Chlamydia 20
2.2.8. Семейство Enterobacteriaceae 20
2.2.8.1. Род Citrobacter 21
2.2.8.2. Род Erwinia 21
2.2.8.3. Род Escherichia 22
2.2.8.4. Род Hafnia 24
2.2.8.5. Род Klebsiella 24
2.2.8.6. Род Proteus 25
2.2.8.7. Род Plesiomonas 27
2.2.8.8. Род Salmonella 27
2.2.8.9. Род Shigella 28
2.2.8.10. Род Serratia 28
2.2.8.11. Род Yersinia 29
2.2.9. Семейство Francisellaceae 30
2.2.9.1. Род Francisella 30
2.2.10. Семейство Helicobacteriaceae 30
2.2.10.1. Род Helicobacter 30
2.2.11. Семейство Legionellaceae 32
2.2.11.1. Род Legionella 32
2.2.12. Семейство Moraxellaceae 32
2.2.12.1. Род Acinetobacter 32
2.2.12.2. Род Moraxella 33
2.2.13. Семейство Neisseriaceae 34
2.2.13.1. Род Neisseria 34
2.2.14. Семейство Pasteurellaceae 35
2.2.14.1. Род Haemophilus 35
2.2.14.2. Род Histophilus 38
2.2.14.3. Род Mannheimia 38
2.2.15. Семейство Pseudomonadaceae 39
2.2.15.1. Род Pseudomonas 39
2.2.16. Семейство Rhizobiaceae 40
2.2.16.1. Род Agrobacterium 40
2.2.16.2. Род Rhizobium 41
2.2.16.3. Род Sinorhizobium 42
2.2.17. Семейство Vibrionaceae 42
2.2.17.1. Род Vibrio 42
2.3. Заключение 43
3. Результаты 47
3.1. Серологическая классификация Pseudomonas aeruginosa 47
3.2. Общие подходы к структурному анализу липополисахаридов 48
3.2.1. Выделение ЛПС 48
3.2.2. Методы химической деградации ЛПС 48
3.2.3. Химические методы анализа 51
3.2.4. Масс-спектрометрия 52
3.2.5. Спектроскопия ЯМР 53
3.3. Структурное исследование ЛПС P. aeruginosa 56
3.3.1. Клинический изолят 2192 56
3.3.2. СерогруппаО-10 65
3.3.3. Серогруппа 0-12 72
3.3.4. Серогруши 0-6 79
3.3.5. СерогруппаО-13 84
3.3.6. Серогруппа 0-1 86
3.3.7. Серогруппа 0-7 90
3.3.8. Серогруппа 0-9 92
3.3.9. Серогруппа 0-4 94
З.З.'Ю. Серогруппа 0-11 96
3.3.1 К Серогруппа 0-3 97
3.3.12. Серогруппа 0-2 99
3.3.13. Серогруппы 0-14 и 0-15 101
4. Обсуждение результатов 103
5. Экспериментальная часть 118
5.1. Выращивание бактериальной массы 118
5.2. Выделение липополисахаридов 118
5.3. Жесткая щелочная деградация ЛПС 119
5.4. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС 120
5.5. Определение моносахаридного состава 121
5.6. Определение состава аминокомпонентов 122
5.7. Хроматографические методы 122
5.8. Масс-спектрометрия 124
5.9. Спектроскопия ЯМР 125
Выводы 126
- Строение области кора липополисахаридов грамотрицательных баїстерий
- Род Escherichia
- Род Agrobacterium
- СерогруппаО-10
Введение к работе
1. ВВЕДЕНИЕ
Род Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae объединяет грамотрицательные микроорганизмы, занимающие в природе различные экологические ниши. В их числе находится синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa — условно-патогенный микроорганизм, проявляющий себя при состояниях, связанных с резким угнетением иммунной системы, часто вследствие термических ожогов и хирургических операций, а также при предрасполагающих заболеваниях, таких как муковисцидоз и рак.
Липополисахарид (ЛПС) является одним из основных компонентов наружной мембраны клеточной оболочки грамотрицательных бактерий и общепризнанным фактором их патогенности. ЛПС играет важную роль во взаимодействии бактерий с окружающей средой, включая организм хозяина, по отношению к которому он проявляет себя как эндотоксин и антиген. Септический шок, вызываемый эндотоксином, остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и высокой летальности. Вместе с тем эндотоксин способен оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к бактериальным инфекциям.
ЛПС имеет сложное строение, включая в себя три различные по составу и функциональному назначению области — О-полисахарид (О-антиген), липидный участок, - так называемый, липид А и соединяющий их олигосахарид, называемый кором. Изучение строения ЛПС необходимо для понимания на молекулярном уровне патофизиологических процессов, происходящих при бактериальных инфекциях, и механизмов функционирования защитных систем животных и человека.
Особый интерес к кору ЛПС P. aeruginosa связан с тем, что он является бактериальным лигандом, ответственным за узнавание микроорганизма рецепторами эпителиальных клеток. Узнавание и последующее поглощение бактериальных клеток являются важными этапами процесса очистки слизистой оболочки дыхательных путей при хронической респираторной инфекции, вызываемой P. aeruginosa у больных муковисцидозом. Потенциальное терапевтическое значение может иметь препарат полного кора, под действием которого улучшается способность эпителиальных клеток поглощать бактерии P. aeruginosa за счет продуцирования большего числа рецепторов. Другим перспективным подходом к лечению инфекционных заболеваний представляется использование протективных антител к кору ЛПС P. aeruginosa, имеющему сходную структуру у всех штаммов. Предполагается, что увеличение устойчивости микроорганизма к клеточному поглощению, способствующее поддержанию хронической инфекции, связано с изменениями в строении кора и липида А. Таким образом, выяснение строения кора и липида А имеет большое значение для понимания того, как бактерия инициирует и поддерживает хроническую инфекцию, и для создания новых терапевтических подходов для борьбы с ней.
В то время как у больных муковисцидозом хроническая инфекция вызывается шероховатыми штаммами, ЛПС которых лишен О-полисахаридной цепи, больные с ослабленной иммунной системой страдают от синегнойной инфекции, которая вызывается гладкими штаммами P. aeruginosa, продуцирующими полный ЛПС, Эти штаммы являются серологически гетерогенными, и их классифицируют на основе иммуноспецифичности ЛПС, которая определяется тонкой структурой О-полисахаридной цепи. О-Полисахариды построены из повторяющихся олигосахаридных звеньев, причем установлено, что наибольший вклад в иммуноспецифичность вносит терминальный участок последнего повторяющегося звена, находящегося на невосстанавливаюшем конце цепи. В связи с этим важной задачей является также установление строения О-полисахаридов различных О-серогрупп P. aeruginosa, включая структуру, так называемого, биологического повторяющегося звена - олигосахарида путем полимеризации которого в процессе биосинтеза ЛПС образуется высокомолекулярный О-полисахарид. Данные о структуре биологического повторяющегося звена, а также о строении области связывания О-полисахарида с кором ЛПС способствуют лучшему пониманию путей биосинтеза ЛПС, а также генетических и биохимических механизмов диверсификации поверхностных структур микробной клетки.
Липополисахариды P. aeruginosa систематически изучаются с 70-х годов, и к началу нашей работы было установлено строение химических повторяющихся звеньев О-полисахаридов типовых штаммов всех О-серогрупп Р, aeruginosa, а также липида А. В то же время структура биологического повторяющегося звена была установлена лишь для одного О-полисахарида, а данные о строении олигосахарида кора были неполными и в некоторых аспектах противоречивыми.
Целью настоящей работы было выяснение строения кора ЛПС клинического изолята P. aeruginosa от больного муковисцидозом и типовых штаммов серогрупп P. aeruginosa, строения биологических повторяющихся звеньев О-полисахаридов всех О-серогрупп P. aeruginosa, а также места присоединения и типа связи между О-полисахаридом и кором. В результате этой работы впервые удалось установить полную структуру ЛПС P. aeruginosa, выявить консервативные и вариабельные элементы структур кора и О-полисахаридов, а также сделать ряд выводов о молекулярных основах иммуноспецифичности и об особенностях биосинтеза ЛПС этих бактерий. Диссертация включает "Литературный обзор", в котором дана общая характеристика ЛПС грамотрицательных бактерий, приведены данные о структурах кора бактерий, принадлежащим к различным семействам и родам, и выявлены общие и специфические особенности строения этой части ЛПС. В главе "Результаты" дано соответствие между некоторыми из существующих схем серологической классификации P. aeruginosa и описана общая стратегия структурного анализа ЛПС, включая различные подходы к деградации ЛПС, а также химические, масс-спектрометрические и ЯМР-спектроскопические методы исследования. Во второй части этой главы приведены особенности и результаты структурного анализа каждого из исследованных штаммов P. aeruginosa. В главе "Обсуждение результатов" проведен сравнительный анализ установленных в ходе работы структур с привлечением лит. данных по этой теме и обсуждается значение полученных результатов для понимания биологической роли и путей биосинтеза ЛПС P. aeruginosa. В экспериментальной части описано выделение ЛПС и его компонентов и приведены методики их структурного анализа.
Работа была поддержана грантами РФФИ 02-04-04005, АФГИР RN1-422 и RB1-2042, ННИО 436 RUS 113/314/0-3 и ИНТАС YS 2001-2/6, а также Грантами поддержки ведущих научных школ РФ 00-15-97373 и НШ-1557.2003.3. Часть работы по изучению кора и липида А была проведена в Центре медицины и биологических наук Исследовательского центра Борстеля (Борстель, Германия). Результаты работы опубликованы в шести статьях [1-6] и тезисах трех докладов [7-9] и были представлены автором в виде стендовых и устного доклада на XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 2000 г.), XI и XII Европейских симпозиумах по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2001 г.; Гренобль, Франция, 2003 г.) и II Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Москва, 2002 г.).
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н. Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, определение основных направлений работы, помощь при интерпретации результатов и подготовке статей для печати. Автор благодарит проф, Александра Степановича Шашкова за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР, Буко Линднера, Хермана Моля и Анну Николаевну Кондакову за съемку масс-спектров, к.х.н. Нину Алексеевну Кочарову за передачу своего опыта проведения химических экспериментов, зав, лаб. химии углеводов проф. Владимира Николаевича Шибаева за внимание к работе и обсуждение ее биосинтетических аспектов. Автор искренне признателен академику Николаю Константиновичу Кочеткову за интерес к работе, а также коллективу Лаборатории химии углеводов за товарищескую поддержку.
Строение области кора липополисахаридов грамотрицательных баїстерий
Структурные варианты кора различных бактерий заметно более ограничены по сравнению со структурами О-полисахаридов. В частности, в коре всех бактерий присутствует 3-дезокси-п-лганно-окт-2-улозоновая кислота (Kdo, рис. 2.2.1., Л), гликозидная связь которой соединяет кор с липидом А. У большинства бактерий кор содержит несколько остатков Ъ-глщеро-В-манно-гептозы (Hep, рис. 2.2. L, С), два из которых образуют олигосахарид HepH-(al— -Hep al- SJ-a-Kdo1 с остатком Kdo1, замещенным в положение 4 остатком Kdo11 или фосфатной группой. Вместо остатка Kdo (Kdo у бактерий Acinetobacter [18; 19] или Kdo у бактерий Burkholderia, Serratia и Yersinia [20-24]) может присутствовать стереохимически сходный моносахарид -т -глщеро-Х}-тало-окт-2-упоъотюъгя кислота (Ко, рис, 2,2.1., В) [25]. Кор некоторых бактерий содержит и-глщеро-Э-мсяшо-гетозу (Hep , рис. 2.2.1., D) - биосинтетический предшественник Hep [26]. В ЛПС Klebsiella pneumoniae [27;28] и Helicobacter pylori [29-31] (a 1 2)- или (сс1-»3)-связанные остатки Hep образуют гептагликановые цепи, биологическая роль которых неизвестна. В корах, содержащих Hep, принято делать подразделение на внутреннюю и внешнюю области: к первой относят участок, построенный из остатков Hep и Kdo, а второй состоит в основном из гексоз и гексозаминов. Это подразделение используется и в тех случаях, когда ко внутреннему кору присоединены дополнительные остатки гексоз, а гептозы входят в состав внешнего кора. Внутренняя область является структурно более консервативной, чем внешняя. Так, все представители семейства Enterobacteriaceae отличаются присутствием в полном коре разветвленного пентасахаридного фрагмента, состоящего из двух остатков Kdo и трех остатков Hep, а в семействе Pseudomonadaceae внутренняя область кора содержит по два остатка Kdo и Hep. Напротив, различия в составе и строении внешней области кора могут наблюдаться у бактерий, принадлежащих к различным видам одного рода, а иногда небольшие структурные вариации в этой области наблюдаются и у штаммов одного вида. Внутренняя область кора часто несет фосфатные, дифосфатные и этаноламинфосфатные группы и вместе с фосфатными группами липида А и присоединенными к ним аминосоединениями образует высокозаряженный участок ЛПС. Степень фосфорилирования кора может зависеть от условий выращивания микроорганизма [32].
Ниже описаны все известные к настоящему времени структуры кора ЛПС различных микроорганизмов, которые представлены в алфавитном порядке латинских названий семейств и родов. Таксономия бактерий приведена в соответствии с информационным ресурсом "Taxonomy Browser" Национального центра биотехнологической информации США, находящимся в Интернет по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/. В этой главе и далее в тексте и структурных формулах моносахариды находятся в пиранозной форме, имеют D-конфигурацию и присоединены а-гликозидной связью, если не указано обратное. Тетрасахаридный фрагмент этого олигосахарида Нер-(1- 2)-Нер-(1— 3)-Нер-(l-»6)-Kdo/6bm выделен из R-мутанта A, salmoinicida 438 [37]. Принимая во внимание близость строения внутреннего кора A. salmoinicida и A. hydrophila и тот факт, что (1 — 5)-связь между остатками Hep и Kdo характерна для всех остальных бактерий, кор которых содержит Пер, присутствие в коре A. salmoinicida 6-замещенного остатка Kdo в фуранозной форме вызывает сомнение. Скорее всего он появился в результате ошибочной идентификации 5-замещенного остатка ангидро-формы Kdo (aKdo), который является артефактом, образующимся при примененной в структурном исследовании мягкой кислотной деградации ЛПС. 2.2.2. Семейство Alcaligenaceae 2.2.2.1. Род Bordetella Bordetella pertussis продуцирует ЛПС R-типа. Он содержит широкораспространенный фрагмент, построенный из двух остатков Hep и несущего дифосфоэтаноламин остатка Kdo, с присоединенными к нему остатками Glc, GlcN и GlcA [38;39]: Прежде всего, вместо остатка Kdo, являющегося связующим звеном между кором и липидом А, он содержит 3,8-Дидезокси-8-амино-0-л днно-окт-2-улозоновую кислоту (Kdo8N) — моносахаридный остаток, не найденный ни в каких других природных углеводах. Второй отличительной особенностью кора является связывание двух из присутствующих моносахаридов (остатков Gal и Hep ) фосфодиэфирной связью. И, наконец, терминальный моносахаридный остаток кора 7»S)-GaloNAc присутствует в ациклической форме, присоединяясь ацетальной связью в положения 4 и 6 соседнего остатка Gal, Моносахариды в открытой форме обнаружены также во внешней области кора рока Proteus семейства Enterobacieriaceae [42-44]. В отличие от широко распространенного фрагмента кора Нер-(1—»5)-Kdo, присутствующий в обоих изученных штаммах Shewanella дисахарид Нер -(1—»5)-Kdo является редким структурным элементом и помимо этой бактерии был найден только у вида Vibrio salmonicida семейства Vibrionaceae [45]. 2.2.4. Семейство Bradyrhizobiaceae 2.2АЛ. Род Bradyrhizobium Из ЛПС штамма Bradyrhizobium (ранее Rhizobium) japonicum 61А10ІС и его мутанта JS314 выделен трисахаридный фрагмент кора Man-(1—»4)-p-GIc-(I—»5)-Kdo, а из штамма JS314 также моно-О-метилированный дисахаридный фрагмент Man4Me-(l -5)-Kdo [46]. Фрагмент p-GIc-(1 5)-Kdo присутствует в коре Sinorhizobium meliloti [47], а не содержащий О-метильной группы дисахарид Man-(1— -5)-Kdo входит в кор Rhizobium [48-54], что указывает на родственную связь между этими микроорганизмами, входящими в порядок Rhizobiales (ризобии). 2.2.5. Семейство Burkholderiaceae 2.2.5.1. Род Burkholderia У бактерий двух изученных родов семейства Burkholderia обнаружены значительные различия в строении кора. В полном коре В. cepacia GIFU 645 остаток Kdo1, связывающий кор с липидом А, замещен в положение 4 дисахаридом построенным из остатков Ко и Ara4N, а внешняя область представлена остатком L-Rha [21;55]: Нерш-(1- 7)-і -(4 -l)-p-Glc Ь-КпаЧІ -Нер Чі- -Нер -О- - о -р- липидА P-L-Ara4N-(l- 8)-Ko-(2-»4)-l
Замещение остатка Ко остатком p-L-Ara4N нестехиометрическое, и, кроме того, присутствуют молекулы, содержащие дополнительный остаток гептозы, конфигурация и место присоединения которого неизвестны [55]. Кор R-мутанта Ко2Ь, полученного из штамма Д cepacia АТСС 25416, содержит трисахарид P-L-Ara4N-(l—»-8)-Ko-(2-»4)-Kdo, в котором остаток Ara4N также присутствует в нестехиометрическом количестве [56]. В качестве бокового заместителя при остатке Kdo1 остаток Ко также найден в коре Y. pestis [22;24], Serratia [23] и В. cepacia [21;55;56]. Дисахарид сходного строения P-L-Ara4N-(l-»8)-Kdo, включающий остаток Kdo , является характерным компонентом кора Proteus [57-59]. Кор В. caryophylli 2151 не содержит остатков Ко и Ara4N и имеет следующее строение [60]: Как и в коре В. cepacia, в нем присутствует трисахарид из остатков Hep -Hep , но также и еще один, четвертый остаток Hep, присоединенный к остатку Kdo11, в результате чего строение кора В. caryophylli отличается уникальной особенностью - одновременным присутствием двух фрагментов Hep-(1 5)-Kdo. 2.2.6. Семейство Campylobacteraceae 2.2.6,1. Род Campylobacter Внутренняя область кора С. jejuni, С. coli и С. lari содержит общий структурный элемент следующего строения: гя Внешний корЧР1- 3)-Нер"-(1 - 3)-Hep4l- 5)-Kdo Остаток Hep1 замещен фосфоэтаноламином (XI = PEtn) в положение 7 в коре С. jejuni О:10 и в положение 6 в коре С. jejuni 0:1, 0:2, 0:4, 0:19 (типовой штамм), 0:23 и 0:36 [61-66], а в коре остальных штаммов остаток Hep1 не фосфоршгарован. Природа заместителя в положении 4 остатка Kdo остается невыясненной. Кор ЛПС Campylobacter содержит остатки гексоз во внутренней области. Так, в коре всех изученных бактерий этого рода остаток Hep1 замещен в положение 4 остатком глюкозы (Х2 = p-Glc) [61-66], что характерно и для многих бактерий других семейств. Кор С. lari PC 637 остаток Hep дополнительно несет в положении 2 остаток галактозы (Х2 = p-Glc и Gal) [67]. В коре С. coli 0:3 в качестве заместителя Х2 в четвертом положении остатка Hep1 присутствует дисахарид Hep-(l-»3)-p-Glc [68J. У С. jejuni 0:1, 0:2 и 0:10 остаток Hep" замещен в положение 2 еще одним остатком глюкозы (ХЗ — P-Glc) [61 ;62;64-66], а в коре С. coli 0:3 и С. lari PC 637 в этом же положении находится остаток галактозы (ХЗ = Gal) [67;68].
Род Escherichia
Строение кора Е, coli изучается уже более 30 лет, и 2 на сегодня накоплено большое количество данных о его особенностях. Установлено пять структурных типов кора Е. coli, называемых типами R1-R4 и К-12. На основании серологических данных, полученных с помощью кроличьих поликлональных антисывороток, специфичных к различным типам кора, было предположено существование кора смешенного типа R1R4 у штамма Е. coli 1502 [84], однако позднее было показано, что этот кор относится к типу R1 [85]. Общее строение консервативной внутренней области кора Е. coli может быть представлено следующим образом: В соответствии с отнесением кора Е. coli к сальмонельному типу его внешняя область присоединяется в положение 3 остатка Hep глюкозидной связью, а остаток Hep фосфорилирован в положение 4. В корах типов R2, R3 и К-12 остаток Kdo11 может быть частично замещен в положение 4 еще одним остатком Kdo [XI = Kdo-(2— А)] [86], присутствующем в нестехиометрическом количестве. В коре R2-rana штамма Е. coli EH 100, полученного из Е. coli О100, обнаружено нестехиометрическое замещение остатка Kdo1 в положение 7 остатком Gal [XI = Gal-(l- 7)] [87;88], а в коре типа К12 штаммов Е, coli W3100 и 3110 часть остатков Kdo11 замещена в положение 5 остатком L-Rha [XI = L-Rha-(l- 5)] [31;89]. Для коров типов R1 и R3 характерно нестехиометрическое замещение остатка Нерш в положение 7 остатком галактозамина [Х3= GalN-(l- 7)], который в полном коре частично N-ацетилирован [86;90]. В коре Rl-типа Е. coll F470 и в коре R3-rana Е. coU F653 это же положение замещено остатком глкжозамина [ХЗ = GIcN-(I-»7)], причем во втором штамме этот заместитель присутствует только в том случае, если остаток Hep" не фосфорилирован [91;92]. Таким образом, Е. соН является одной из бактерий, для которых характерно присутствие гексоз во внутренней области кора. Во внутренней области кора Е. соН фосфатные группы локализованы на остатках Hep и Hep1, причем остаток Hep фосфорилирован нестехиометрически. В коре Rl-типа в положении 4 остатка Hep локализован дифосфоэтаноламин (Х2 = PEtn) [93], а в коре R4-rana этот заместитель находится в положении 4 обоих остатков Hep (Х2 = Х4 = РЕХп) [94].
Определение степени замещения монофосфатной группы фосфоэтаноламином затруднено лабильностью пирофосфатной связи, легко расщепляющейся при деградации ЛПС в различных условиях, используемых в структурных исследованиях, но, по-видимому, во всех случаях /VEtn-rpynna присутствует в нестехиометрическом количестве. В коре Е. colt К-12 фосфоэтаноламин обнаружен в положении 7 остатка Kdo" (XI = PEtn-7) [95]. Внешняя область имеет уникальное строение для каждого из пяти типов коров Е. coli: Наиболее близкое строение имеют внешние области коров типов R1 и R4, которые отличаются присутствием (рі-»3)-связанного остатка глюкозы в коре R1 и (pi — 4)-связанного остатка галактозы в коре R4. В коре Rl-типа этот остаток глюкозы является местом присоединения О-полисахарида [96], а в корах типов R2 и К-12 О-полисахарид присоединяется к (1- 2)-связанному остатку глюкозы [97]. Уникальной особенностью кора К-12 является присутствие во внешней области дисахарида GlcNAc-(pl 7)-Hep, оба компонента которого, также как терминальный (р1-»4)-связанный остаток галактозы в коре R2Hna, присутствуют в нестехиометрическом количестве [89;98;99]. Исследование продуктов мягкого кислотного гидролиза ЛПС целого ряда штаммов Hafnia alvei позволило установить следующую углеводную основу кора, первоначально считавшуюся общей для всего вида: В большинстве штаммов кроме дифосфоэтаноламина при Hep1 кор содержит также фосфатную группу в положении 4 остатка Нерп (XI = Р-4), а в штамме Я alvei 1211 вместо нее на этом остатке в положении 6 присутствует фосфоэтаноламии (XI = Шх\РР-6) 100;101]. Для штамма Я. alvei АТСС 2 найдено, что положение 6 остатка Glc является местом присоединения О-полисахарида [102]. Позднее эти данные были дополнены структурами, не укладывающимися в общую формулу. Так, из ЛПС некоторых штаммов был выделен разветвленный трисахарид Нср-(1 5)-[Gal-(1 7)]-Kdo [31;103;104], причем в штаммах Я alvei 2 и 1211 остаток галактозы О-ацетилирован в положение 6. В коре Я. alvei 1185 и 1204 терминальный остаток Glc заменен на остаток Gal [105]. Внешний кор Я alvei 23 и 1222 имеет строение, сходное с кором R4Hna Е. coli, а Я. alvei 39-е полным кором Ra-типа Salmonella [106]. Кор К. pneumoniae не входит в сальмонельную группу, и его внешняя область присоединяется к остатку Hep" в положение 3 остатком GalA.
Типичным для К. pneumoniae является отсутствие фосфатных групп во внутренней области кора и присутствие остатка Kdo во внешней области. В обобщенном виде строение кора К pneumoniae можно представить следующим образом: В корах К. pneumoniae 01, 02а, 02а,с, ОЗ, 04, 05 и 012 остатки p-Glc и Hep могут замещаться остатком P-GalA (XI и Х2 = Н или P-GalA), а остаток Kdo111 -нестехиометрически остатком Ъ-гпицеро-Ъ-манпо -гептозы (ХЗ = Hep) [107-109]. Положение 5 остатка Kdo111 является местом присоединения О-полисахарида [109]. Некоторое отклонение от общей структуры обнаружено в коре К, pneumoniae 08, во внешней области которого остаток GIcN заменен остатком Glc [110]. К. pneumoniae 01 продуцирует уникальный структурный вариант кора, в котором остаток Kdo заменен на находящийся в том же положении дисахарид, построенный из а-(1-»2)-связанных остатков Hep [109]. В ЛПС R-штамма К. pneumoniae R20 (ОГ:К200 присутствует ос-(1-»-2)-связанный гептогликан, содержащий уже до четырех остатков Hep ; кроме того, во внутренней области его кора остаток Kdo11 замещен третьим остатком Kdo [111-113]. Трисахаридный фрагмент Нер -(1— -2)-GlcN-(l—»4)-GalA, присутствующий в Нер -содержащем коре К. pneumoniae, найден также в коре P. mirabilis R110/1959 [27;28]. Кор глубокого R-мутанта К. oxytoca R29 имеет только внутреннюю область, состоящую из двух остатков Kdo, двух остатков Hep и остатка P-Glc 114]. 2.2.8.6. Род Proteus Бактерии Proteus характеризуются структурной вариабельностью кора от штамма к штамму и существованием различных структурных вариантов кора в одном и том же штамме. В качестве общего структурного элемента во внутренней области кора подавляющего большинства изученных штаммов содержится 4-амино-4-дезокси-р-Ь-арабиноза (P-L-Ara4N), присоединенная к остатку Kdo1: Единственным исключением, в котором Ara4N отсутствует, является P. mirabilis 027. В этом штамме остаток Kdo нестехиометрически фосфорилирован в положение 7, а в положении 6 остатка p-Glc находится остаток P-GalA [42]. В большинстве штаммов остаток Hep содержит фосфоэтаноламин в положении 6 (XI = PEtn) [28;42;43;115-117], а остаток Hep111 может быть терминальным или гликозилированным в положение 7 (Х2 = P-GalA или P-GalAN) [28;42;43;59;115-118]. В ряде штаммов остаток P-GalA присутствует в виде амида с бутан-1,4-диамином (путресцином), 4-азаоктан-1,8-диамииом (спермидином) или4-азагептан-1 7-диамином [59; 119].
Род Agrobacterium
Интересно, что из ЛПС V. parahaemolyticus NIH 5425-62 (02) был выделен трисахаридный фрагмент кора p-GIcA-(l—»2)-Нер-(1- 3)-Нер , также содержащий остаток О-глицеро-D-.манно-гептозы на восстанавливающем конце [240]. Конфигурация остатка нонулозоновой кислоты Leg в коре V. salmonicida первоначально была установлена как L-глицеро-О-галакто [45], однако позднее она была пересмотрена в пользу л-глицеро-ТУ-гаяакто-конфигурации [241]. Состав и структуры бактериальных ЛПС отличаются широким разнообразием. Липид А является наиболее консервативной частью ЛПС, О-антигенный полисахарид гладких штаммов — наиболее вариабельной, а олигосахарид кора сочетает в себе как консервативные, так и вариабельные элементы структуры, Моносахаридным компонентом кора, общим для ЛПС всех грамотрицательных бактерий, является 3-дезокси-0-лшяио-окт-2-улозоновая кислота (Kdo) или другая, близкая ей по структуре окт-2-улозоновая кислота. В коре ЛПС большинства бактерий содержится один или два остатка Kdo, образующих дисахарид Kdon-(2-»4)-Kdo , причем гликозидная связь Kdo1 соединяет кор с липидом А. Некоторые бактерии характеризуется заменой в части молекул ЛПС одного из остатков Kdo остатком п-глицеро-п-тало-окт-2-улозоновой кислоты (Ко), как это найдено для Kdo1 у некоторых штаммов A cinetobacter и для Kdo" у Burkholderia cepacia, Serratia marcescens и Yersinia pestis. В коре Shewanella oneidentis вместо Kdo обнаружено ее аминопроизводное 8-амино-3,8-дидезокси-0-лшмно-окт-2-улозоновая кислота - моносахарид, не найденный ни в каких других природных углеводах. Кор Chlamydia и некоторых глубоких R-мутантов Е. coli представляет собой трисахарид Kdo-(2-»8)-Kdo-(2- 4)-Kdo или Kdo-(2- 4)-Kdo-(2-»4)-Kdo соответственно, а ЛПС двух штаммов Acinetobacter baumannii содержит уникальные трисахариды и тетрасахариды из остатков Kdo, связанных (2- 4)- и (2- 5)-связями, Характер замещения остатка Kdo1 в положение 4 - фосфорилирование или гликозилирование (остатком Kdo или Ко) - является консервативным признаком семейства. Так, в семействах Aeromonadaceae, Alcaligenaceae, Alteromonodaceae и Vibrionaceae остаток Kdo1 фосфорилирован, а в семействах Burkholderiaceae, Enterobacteriaceae, Legionellaceae, Moraxellaceae, Neisseriaceae, Pseudomonadaceae и Rhizobiaceae — гликозилирован. Единственным известным на сегодня исключением является семейство Pasteurellaceae, два рода которого - Haemophilus и Mannheimia - относятся к первой группе, а третий - Histophilus — ко второй. Род Histophilus был создай недавно для бактерий, ранее классифицировавшихся как Haemophilus somnus, и тип замещения остатка Kdo1 в коре свидетельствует о том, что таксономическая классификация этих бактерий нуждается в дальнейшим уточнении.
В таксонах более высокого ранга характер замещения остатка Kdo может быть различным, как это имеет место, например, в семействах Atcaligenaceae и Burkholderiaceae, принадлежащих к одному порядку Burkholderiales. Вторым по распространенности в составе кора моносахаридом является Ъ-глицеро-т - .ишшо-гептоза (Hep). Независимо от характера замещения Kdo для всех ЛПС, содержащих этот моносахарид, характерно присутствие консервативного трисахаридпого фрагмента Hep"-(l- 3)-HepI-(1 5)-KdoI (к этой группе относятся ЛПС бактерий Aeromonadaceae, Atcaligenaceae, Bradyrhizobiaceae, Campylobacteraceae, Enterobacteriaceae, Helicobacter iaceae, Neisseriaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae и Vibrionaceae). В пределах семейства в коре могут присутствовать более крупные общие структурные элементы; например, все ЛПС семейства Enterobacteriaceae характеризуются наличием разветвленного пентасахарида Нер-(1— 7)-Нер-(1- 3)-Нер-(1— 5)-[KdoI1/Ko-(2- 4)]-KdoI. В ЛПС, не содержащих Hep, варианты замещения остатка Kdo1 в положение 5 более разнообразны. Кор большинства из них (Francisetlaceae, Legionellaceae, Rhizobium) содержит дисахарид Man-(l-»5)-Kdo , кор Moraxellaceae — Glc-(l- 5)-KdoI] Agrobacterium — Gal-(1— 5)-Kdo, а кор Bradyrhizobium и Sinorhizobium — P-Glc-fl- -Kdo1. Последние три микроорганизма ранее относили к роду Rhizobium, и с точки зрения этого отличия в коре ЛПС их выделение в отдельные рода, а впоследствии и вынесение рода Bradyrhizobium в отдельное семейство, является целесообразным. С другой стороны, из ЛПС Bradyrhizobium был выделен также дисахаридный фрагмент Man4Me-(l—»5)-Kdo, являющийся моно-О-метилированным производным соответствующего фрагмента кора Rhizobium, что подтверждает существование филогенетической связи между этими бактериями, относящимися к одному порядку Rhizobiales. ЛПС некоторых бактерий содержат О-глицеро-О-манио-тетпоъу (Hep ), являющуюся биосинтетическим предшественником Hep. В коре Vibrio salmonicida остаток Hep входит во внутренний кор, заменяя остаток Hep1, и в ЛПС Shewamlla семейства Alteromonodaceae единственный остаток Hep также образует дисахарид Нер -(1— 5)-K.do . Более распространен остаток Hep во внешней области кора. Он может присутствовать в виде моносахаридного компонента, как в коре некоторых энтеробактерий {Klebsiella, Proteus, Serratia и Yersinia) и Haemophilus ducreyi семейства Pasteurellaceae. Дисахаридный фрагмент Нер -(1-»6)-Нер входит в состав кора Aeromonas hydrophila и Mannheimia haemolytica, в коре Klebsiella pneumoniae и Helicobacter pylori найден его (1—»2)-связанный аналог, а в коре Proteus -дисахарид Нер-(1— 2)-Нер . ЛПС К. pneumoniae и Н. pylori отличаются присутствием не только гептозных дисахаридов, но и гептогликанов, построенных из остатков Hep . Так, до четырех (al—»2)-связанных моносахаридов присоединяются к кору К. Pneumoniae, и полимерные цепи из (al-»3)- или чередующихся (a 1 -2)- и (а1- 3)-связанных остатков Hep — к кору Н. pylori. Кроме гептогликанов, с кором могут быть связаны некоторые другие гликоолигомеры или гликополимеры, как, например, глюкан и L-рамнан с варьирующейся длиной цепи (от ди- до пентасахарида) в ЛПС Acinetobacter или глюкан и L-фукозилированный поли(М-ацетиллактозамин) в ЛПС Helicobacter pylori.
Состав остальных моносахаридных и неуглеводных компонентов кора варьируется в довольно широких пределах. Из первых часто присутствуют глюкоза, галактоза, рамноза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты, глюкозамин, галактозамин, их N-ацетильные производные, а также б-дезоксигексозамины, 4-амино-4-дезоксиарабиноза, аминоуроновые кислоты, N-ацетилнейраминовая кислота и некоторые другие моносахариды. Чаще всего они присутствуют в пиранозной форме, хотя сахара в фуранозной форме были найдены в коре Shewanella putrefaciens (галактоза) и Vibrio cholerae (фруктоза и седогептулоза). Особо следует отметить присутствие в коре Proteus и Shewanella oneidentis N-ацетилгалактозамина в ациклической форме, присоединенного ацеталыюй связью в положения 4 и 6 соседнего моиосахаридного остатка. Кор последнего микроорганизма отличается также присутствием гликозилфосфатной связи между моносахаридными остатками наряду с гликозидными связями. Из неуглеводных заместителей кора отметим фосфатные группы, способствующие стабилизации внешней мембраны за счет образования с ионами двухвалентных металлов мостиков между соседними молекулами ЛПС, фосфоэтаноламин и фосфохолин, которые могут служить лигандами для рецепторов в организме хозяина, а также аминокислоты (чаще всего глицин и аланин) и О-ацетильные группы. Строение внешней области, если таковая может быть выделена в общей структуре кора, или, если нет, - характер гликозилирования внутренней области у одних бактерий t консервативно в пределах вида (реже рода), а у других в значительной степени варьируется от штамма к штамму внутри вида. В последнем случае эта структура определяет сероспецифичность бактерий с ЛПС в R-форме, таких как, например, Neisesria meningitidis и Haemophilus influenzae, а иногда, наряду со структурой О-полисахарида, даже бактерий с ЛПС в S-форме, как это наблюдается у рода Proteus. Присутствие остатка N-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac) на восстанавливающем конце кора N. meningitidis является одним из примеров структурной мимикрии ЛПС под гликолипиды и гликопротеины человека, помогающие бактериям избегать защитного действия иммунной системы хозяина. Аналогичную роль могут играть антигенные детерминанты Льюиса и групп крови животньк и человека, экспонируемые на невосстанавливающем конце полилактозаминовой цепи, связанной с кором Н. pylori.
СерогруппаО-10
Жесткая щелочная деградация ЛПС серотипа О-10а,10Ь сопровождалась деполимеризацией О-полисахарида по механизму (i-элиминирования в 4-замещенных остатках L-GalNAcA, которые превращались при этом в остатки 2-амино-2-дезокси-0-/и/7ео-гекс-4-епуроновой кислоты (AHexNA). Фракционированием продуктов (ОСою-1) методом ВЭАЖХ (рис. 3.3.2.1) были выделены два основных олигосахарида ОСою-1-1 и ОСою-1-2. Масс-спектры ИЭР показали присутствие псевдомолекулярных ионов [М-Н]" при m/z 2519,64 и 2659,65, которые соответствовали пентакисфосфорилированной углеводной основе кора-липида А состава 6dHexiHex4HexN3Hep2Kdo2i,s (ОСою-1-2), и олигосахариду, содержащему на один остаток глюкозы меньше, но замещенному дисахаридным остатком деградированного первого повторяющегося звена О-полисахарида состава AHexNA6dHexNi6dHexiHex3HexN3Hep2Kd02y5 (ОСою-1-1) (рассчитанные мол. массы 2519,57 и 2659,62 Да соответственно). Спектр Н-ЯМР ОСою-1-2 содержал сигналы 10 аномерных протонов при 4,62-5,75 м.д„ двух метиленовых групп (НЗах и H3eq двух остатков Kdo) при 1,83-2,24 м.д. и одной метильной группы (Н6 Rha) при 1,32 м.д. (ЗН). В спектре 13С-ЯМР ОСокг1-2 присутствовали сигналы аномерных атомов С при 92,7-105,6 м.д., трех атомов С, связанных с атомом N (С2 GlcN1, GlcN11 и GalN), при 51,7-56,6 м.д„ метильной группы (С6 Rha) при 18,3 м.д. и метиленовых групп (СЗ двух остатков Kdo) при 35,4 и 36,3 м.д.. Спектр 31Р-ЯМР ОСою-1 содержал сигналы пяти фосфатных фупп при -0,9, 0,7,0,9 и 2,1 (2Р) м.д. ЯМР -спектры указывали на то, что ОСою-1-ї и OCoio-1-2 являются индивидуальными соединениями. Спектр Н-ЯМР ОСою-1-1 содержал сигналы 11 аномерных протонов при 4,67-5,75 м.д., двух метиленовых групп (НЗах и H3eq двух остатков Kdo) при 1,83-2,26 м.д,, двух метальных групп (Нб Rha и QuiN) при 1,27 и 1,37 м.д. и протона при двойной связи (Н4 AHexNA) при 5,95 м.д. Спектр 13С-ЯМР ОСою-1 "1 содержал сигналы аномерных атомов С при 92,9-105,7 м.д., пяти атомов С, связанных с атомом N (С2 GlcN1, GlcN11, GalN, QuiN и AHexNA), при 51,9-56,8 м.д., метальных групп (C6 Rha и QuiN) при 17,7 и 18,2 м.д., метиленових групп (СЗ двух остатков Kdo) при 35,5 и 36,3 и атома С4 остатка AHexNA при 107,6 м.д., В спектре 31Р-ЯМР ОСОІО-2 присутствовали сигналы пяти фосфатных групп при -0,2, 0,7, 0,9 и 2,1 (2Р) м.д. Спектры Н- и 13С-ЯМР ОСою-1-1 и ОСою-1-2 были отнесены при помощи двумерной спектроскопии ЯМР (Приложение, таблицы 3.3.2.1. и 3.3.2.2.), как описано в разделе 3.2.5. Конфигурации гликозидных связей, включая р-конфигурацию связей остатков AHexNA и QuiN, были определены по значениям КССВ Ji .
Структура и место присоединения дисахаридного остатка повторяющегося звена AHexNA-(pi-»3)-QuiN-(pi следовали из корреляций AHexNA HI,QuiN НЗ и QuiN Hi,Rha НЗ при 5,60/4,13 и 5,02/4,03 м.д. соответственно, продемонстрированных с помощью эксперимента ROESY. Спектры Н, P-HMQC ОСою-1-1 и ОСою-1-2 были практически идентичны и по корреляциям сигналов атомов Р и протонов моносахаридных остатков Р2/Н2 Hep1, Р4/Н4 Hep1 и Р6/Н6 Hep" при 5р/5н 0,7/4,53, 2,1/4,50 и 2,1/4,55 м.д. соответственно позволили установить в коре обоих олигосахаридов присутствие трех фосфатных групп в положениях 2 и 4 остатка Hep1 и в положении 6 остатка Hep". В результате были установлены полные структуры ОСош-1-2 и ОСою-1-1 (5 и 6 соответственно, рис. 3.3.2,2.), Олигосахарид 5 соответствует незамещенному кору гликоформы 1, отличающемуся от кора гликоформы 1 из клинического изолята P. aeruginosa 2192 присутствием дополнительного, четвертого остатка GlcIV, присоединенного в положение 2 остатка рамнозы. Олигосахарид 6 соответствует кору гликоформы 2, имеющему такую же внешнюю область, что и кор P. aeruginosa 2192, но замешенному дисахаридным остатком деградированного первого повторяющегося звена О-полисахарида. Строение олигосахарида 6 определяет структуру биологического повторяющегося звена О-полисахарида серогруппы О-10, которое начинается остатком QuiNAc и заканчивается остатком рамнозы. Фракционированием продуктов мягкого кислотного гидролиза при рН 4,2 ЛИС серотипа О-10а,10Ь с помощью хроматографии на геле Sephadex G-50 были выделены высокомолекулярный О-полисахарид и два олигосахарида, соответствующие кору, замещенному одним повторяющимся звеном О-полисахарида (ОСою-2), и незамещенному кору Анализ аминокомпонентов в ОСою-3 привел к идентификации GalN, аланина и этаноламина в молярном соотношении 1:1,25:0,33. Масс-спектр ИЭР (рис. 3.3.2.3,, В) показал, что ОСою-3 представляет собой смесь олигосахаридов состава 6dHeX]Hex4IIexNiI Iep2aKdoAlaiCrai, содержащих также фосфатные труппы и фосфоэтаноламин (PEtn) и не содержащих О-ацетильных групп. Основные пики при т/г 1833,50, 1913,47, 1956,51 и 2036,48 соответствовали соединениям с составом варьирующихся заместителей Р2, Рз, зЕиіі и P4Etnі (рассчитанные и экспериментальные мол. массы совпадали). Общее содержание молекул с фосфоэтаноламином в ОСою-3 составляло 60%. А Масс-спектр ИЭР ОСою-2 (рис. 3.3.2.3., А) показал, что олигосахариды, входящие в его состав, отличаются от соответствующих олигосахаридов в составе ОСою-3 отсутствием одного остатка глюкозы и присутствием вместо него одного повторяющегося звена О-полисахарида, присоединенного к кору. Последнее содержит по одному остатку L-Rha, QuiNAc и L-GalNAcA. Фракция ОСою-2 характеризовалась тем же типом гетерогенности, что и ОСош-3 (см. выше), и дополнительно нестехиометрическим О-ацетилированием олигосахаридного повторяющегося звена О-полисахарида (основные пики при т/г 2221,66, 2301,63, 2344,65 и 2424,63 для соединений без 0-ацетильной группы и m/z 2263,67, 2343,65, 2386,68 и 2466,64 для О-ацетилированных соединений). Фракционированием ОСою-3 с помощью ВЭАЖХ (рис. 3.3.2.4.) были выделены четыре основные фракции (от ОСою-3-1 до ОСот-3-4). Из них фракции ОСою-З-З и ОСою-3-4 содержали максимальное число фосфатных групп (четыре и три), и фракция ОСоіо-3-З содержала также этаноламин, что следовало из их мол. масс 2036,47 и 1913,47 Да соответственно (данные МС ИЭР). В соответствии с этим спектр Н-ЯМР ОСоіо-3-З содержал сигналы этаноламина при 3,32 (CH2N) и 4,23 (СНгО) м.д., а спектр 31Р-ЯМР сигналы дифосфатной группы при -10,9 и -11,0 м,д., которые отсутствовали в спектрах ОСою-3-4, Таким образом, ОСою-З-З отличается от ОСою-3-4 присутствием фосфоэтаноламина, связанного с одной из фосфатных групп с образованием дифосфоэтаноламина.
