Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Литературный обзор 6
2.1. Механизмы токсического действия эндотоксинов и стратерии по их нейтрализации 6
2.2. Структура липида А 11
2.2.1. Общая характеристика липида А 11
2.2.2. Варианты липида А, имеющие модификации в структуре гидрофильной части молекулы 16
2.2.2.1. Вариации в углеводной части молекулы липида А 16
2.2.2.2. Наличие остатков фосфорной кислоты 21
2.2.3. Характеристика гидрофобной части молекулы липида А 25
2.2.3.1. Качественный состав жирных кислот липида А 25
2.2.3.2. Количественный состав жирных кислот липида А 28
2.2.4. Бактерии, не содерэ/сащие липида А 33
2.2.5. Взаимосвязь структуры и биологических свойств липида А 35
3. Результаты и обсуждение 43
3.1.Липиды а из бактерий рода marinomonas 44
3.1.1. Структура липида А из Marinomonas communis АТСС27118' 44
3.1.2. Структурная характеристика липида А из Marinomonas mediterranea АТСС 700492Т 54
3.2. Структура липидов а из бактерий рода chryseobacterium 58
3.3. Некоторые особенности состава наружной мембраны бактерий рода chryseobacterium .68
3.3. Некоторые биологические свойства липидов а и липополисахаридов из бактерий родов chryseobacterium marinomonas 73
4. Экспериментальная часть 80
Выводы 89
- Структура липида А
- Количественный состав жирных кислот липида А
- Структура липидов а из бактерий рода chryseobacterium
- Некоторые биологические свойства липидов а и липополисахаридов из бактерий родов chryseobacterium marinomonas
Введение к работе
Инфекционные болезни относятся к числу самых распространенных патологий у человека [1]. Антропогенная трансформация окружающей среды способствует появлению новых патогенов и новых инфекционных заболеваний. Даже в странах с развитой системой здравоохранения смертность от этих болезней очень высока. В последние годы наблюдается снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Это в первую очередь связано с тем, что в результате генетической изменчивости бактерий появляются штаммы, устойчивые к действию антибиотиков, а также штаммы с измененным антигенным составом, что помогает патогенам избегать иммунной реакции хозяина и снижает эффект от использования современных вакцин.
Особое место среди бактериальных инфекций занимают заболевания, вызванные грамотрицательными бактериями (ГОБ). Важной причиной смертности при системной грамотрицательной инфекции является эндотоксический шок (эндотоксемия) [2]. Это осложнение возникает в результате накопления в крови человека эндотоксинов, уникальных компонентов наружной мембраны (НМ) ГОБ, что приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, синтезу большого количества эндогенных цитокинов эффектор-ными клетками организма хозяина, и, в конечном счете, к серьезным нарушениям в организме, таким как гипотония и полиорганная дисфункция [3].
Несмотря на значительный прогресс в антимикробной химиотерапии, количество летальных исходов при эндотоксемии остается неприемлемо высоким [4-6]. Современная медицина не располагает специфическими терапевтическими препаратами против эндо-токсического шока, поэтому существует потребность в развитии новых подходов к лечению этого состояния. В основе одного из них лежит понимание того, что медиатором заболеваний, вызванных ГОБ, являются эндотоксины [5]. В связи с этим весьма актуальным становится использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих выделение или иммунологическую реактивность последних. Потенциальным кандидатом на роль антагонистов эндотоксинов являются сами эндотоксины. В химическом плане они представляют собой липополисахариды (ЛПС), включающие наряду с О-полисахаридом (О-ПС) и олиго-сахаридом кора липидный домен, называемый липидом А (ЛА) [7, 8], который считается эндотоксическим центром ЛПС [9,10].
Наиболее распространенным структурным вариантом ЛА, проявляющим ярко выраженные эндотоксические свойства, является дифосфорилированный дисахарид глюкоза-мина (GlcN), имеющий шесть остатков жирных кислот (ЖК) [7-9]. С другой стороны, про-
изводные ЛА, имеющие низкую степень фосфорилирования и ацилирования, проявляют слабую (или не проявляют вовсе) эндотоксическую активность, что делает возможным их использование в качестве антагонистов эндотоксинов [11-13]. В настоящее время проводится обширный поиск объектов, источников ЛА необычных структурных форм. Особенности строения ЛА во многом определяются условиями роста ГОБ [14-16]. В этом плане большой интерес представляют морские бактерии, которые в силу особых условий обитания (повышенное содержание солей, низкая температура, высокое гидростатическое давление, неравномерное поступление питательных веществ) могут синтезировать ЛА с низким эндотоксическим потенциалом. Действительно, как показали недавние исследования, морские микроорганизмы синтезируют необычные структурные варианты ЛА, которые проявляют слабую токсичность [17]. Это дает основание предполагать наличие у ЛА из морских ГОБ функции антагонистов эндотоксинов.
Настоящая диссертационная работа посвящена изучению структуры и биологических свойств ЛА из морских бактерий рода Chryseobacterium и Marinomonas.
Структура липида А
ЛА - ковалентно связанный компонент ЛПС, с помощью которого последний удерживается в НМ клеток ГОБ [7, 8]. Впервые термин «липид А» появился в 1954 г. для обозначения осадка («фракция А»), выпадающего при кислотном гидролизе эндотоксинов [66]. Впоследствии этот термин стал использоваться для обозначения липидного участка молекулы ЛПС и в настоящее время считается общепринятым. ЛА является обязательным участком молекулы ЛПС [7-9] и связан с полисахарид-ной частью последнего кислотолабильной кетозидной связью [67]. Для получения ЛА в свободном виде используют кислотный гидролиз ЛПС (1%-ная АсОН, 100 С, 1-3 ч [66]) или целых бактериальных клеток [68, 69]. Гидролиз может быть более мягким (0,02 М ацетатный буфер, рН 4,5 или 6,5) или более жестким (например, 5-10%-ная АсОН или 0,1 М НС1, 100 С, 15-45 мин). Иногда для более полного гидролиза полезным бывает добавление в гидролизующую смесь детергентов, таких, как SDS [70]. Характерной особенностью ЛА является высокая степень гетерогенности, которая определяется особенностями его биосинтеза, видовой принадлежностью бактерии, из которой он выделяется, а также условиями выделения ЛА. Гетерогенность ЛА легко обнаруживается с помощью ТСХ. Для фракционирования сложных липидных смесей используют различные типы хроматографии (гель-хроматография на сефадексе LH-20; колоночная хроматография на силикагеле и DEAE-целлюлозе; ВЭЖХ на обратнофазном силика-геле; препаративная ТСХ). Гидролиз ЛПС, даже самый мягкий, сопровождается частичной деградацией ЛА в результате разрыва присутствующих в составе его молекул кислотолабильных связей, что увеличивает присущую ЛА гетерогенность и делает более трудным получение индивидуальных соединений. Структурный анализ ЛА значительно облегчается, если для его изучения в качестве исходного материала используют природные или лабораторные штаммы бактерий, ЛПС которых имеют неполную структуру. Это так называемые Re-гликолипиды, состоящие из ЛА и двух остатков 3-дезокси- -лшнн0-окт-2-улопиранозоновой кислоты (Кдо) [71], и липоолигосахариды (ЛОС), не содержащие О-ПС, которые часто встречаются у непатогенных бактерий [72]. ЛА из различных бактерий образуют группу близкородственных по структуре, но не идентичных соединений. Классическим (или «нормальным») ЛА принято считать ЛА из бактерий сем. Enterobacteriaceae [7] из-за их большого исторического преимущества перед ЛА из бактерий других таксономических групп: первые данные по структуре и биологической активности ЛА были получены на образцах, выделенных именно из энтеробак-терий [73]. Кроме того, ЛА кишечных бактерий проявляют высокую эндотоксическую активность и часто используются как reference-соединения для оценки биологической активности ЛА из бактерий различной видовой принадлежности.
Изучение структуры ЛА из Escherichia coli, типичного представителя бактерий семейства Enterobacteriaceae, показало, что он содержит пиранозидные остатки гексозами-нов D-гл/око-конфигурации (GlcN), которые присутствуют в виде (3-(1 - 6)-связанного ди- Дисахарид несёт а-гликозидную (положение 1) и негликозидную (положение 4 ) фосфорильные группы и сложноэфирно- (положения 3, 3 ) и амидносвязанные (положения 2, 2 ) (і?)-3-гидрокси- и (і?)-3 ацилоксиалкановьіе кислоты. Гидроксильные группы GlcN в положениях 4 и 6 изолированного ЛА не замещены. Когда ЛА находится в составе ЛПС, гидроксильная группа при С6 атоме GlcN участвует в образовании связи с олигосахари-дом кора [75]. Фосфатные группы могут быть частично замещены так называемыми полярными заместителями, в качестве которых выступают этаноламин (EtN) и 4-амино-4-дезоксиарабиноза (Ara4N). ЛА подобной структуры обнаружены также у бактерий Salmonella typhimurium [76], Shigella flexneri [77], частично у Salmonella minnesota [78] и Proteus mirabilis [79] и других. На примере ЛА из Е. coli [74] и некоторых других бактерий [80-83] показано, как осуществляется биосинтез этой довольно сложной молекулы (схема 2). ствляется с помощью фермента LpxA, цитозольной UDP-N-ацетилглюкозамин-ацилтрансферазы [84], абсолютно специфичной не только к положению гидроксильной группы, но и к длине цепи 3-гидроксикислот. Посредством LpxA продуцируется более 90 % ЛА в диких штаммах Е. coli. Следующим этапом является отщепление ацетильной группы от азота в положении 2 GlcN, осуществляемое ШР-моноацил-ТМ-ацетилглюкозамин деацетилазой (LpxC) [85], которая, в отличие от LpxA, не проявляет чувствительности к длине цепи ацильного остатка, уже присутствующего в Ш)Р-моноацил-г4-ацетилглюкозамине. Далее происходит присоединение второго ацильного остатка к свободному атому азота GlcN при С2 UDP-GlcN с помощью ШР-З-О-моноацил-Ы-ацилтрансферазы (LpxD) [86], абсолютно специфичной к 3-гидроксикислотам, активированным АСР, в результате чего образуется 1ГОР-2,3-диацилглюкозамин - предшественник восстанавливающего конца углеводного скелета ЛА. Длина цепи жирной кислоты (ЖК) не является в такой же степени существенной для LpxD, как для LpxA, и в качестве субстрата для него может выступать не только кислота З-ОН-14 : 0, но и, например, 3-гидроксипальмитиновая [86].
Происходящее затем расщепление пирофосфатной связи, осуществляемое UDP-2,3-диацилглюкозамин-гидролазой (LpxH), специфичной к диацилированному субстрату, приводит к образованию 2,3-диацилглюкозамин-1-фосфата (липида X (ЛХ)) - предшественника восстанавливающего конца ЛА [87]. На следующем этапе происходит реакция конденсации, осуществляемая дисахарид-синтетазой LpxB, активной в виде димера, в ходе которой к ЛХ в положение б присоединяется 1ЛЗР-2,3-диацилглюкозамин и образуется 1-фосфат (3-(1 — 6)-связанного дисахари-да GlcN, имеющего четыре остатка ЖК [88, 89]. Под действием 4 -киназы это производное превращается в дифосфат, называемый предшественником ЛА IVA [90-92]. Фосфорилиро-вание 4 -ОН-группы является необходимым для действия последующих ферментов, таких как Кдо-трансфераза KdtA, осуществляющая следующий этап биосинтеза ЛА - присоединение Кдо к предшественнику IVА [93-95]. После включения остатка Кдо биосинтез ЛА в Е. coli заканчивается переносом АСР-активированных лаурата и миристиата к невосстанавливающему концу ЛА (образуются ацилоксиацильные заместители [96, 97]) с помощью так называемых поздних ацилтранс-фераз, LpxL и LpxM, активность которых напрямую зависит от наличия Кдо в акцепторных субстратах [98, 99]. В результате синтезируется ЛА, представленный на рис. 1. Аналогичные ферменты, участвующие в биосинтезе ЛА, обнаружены в большинстве ГОБ. Таким образом, ЛА представляют собой амфифильные соединения, молекулы которых включают гидрофильные (GlcN, остатки фосфорной кислоты и полярные заместите- ли) и гидрофобные (остатки ЖК) домены. Дифосфат глюкозаминобиозы, ацилированный четырьмя остатками кислоты З-ОН-14 : 0 (первичные ЖК), является наиболее консервативным участком молекулы ЛА кишечных и некоторых других бактерий. Вариации в структуре ЛА этой группы бактерий обусловлены наличием и природой полярных заместителей, а также количеством и природой так называемых вторичных ЖК, ацилирующих гидроксильные группы 3-гидроксиалкановых кислот. Ни один тип модификации структуры ЛА кишечных бактерий не является стехиометрическим, что является причиной его внутренней (обусловленной не условиями выделения) гетерогенности, о которой говорилось выше. Изменения в структуре ЛА, осуществляемые ферментами, отличными от описанных выше, а также действием систем регуляции биосинтеза ЛА, могут зависеть от вида, штамма и даже порции бактериальной культуры. Вариации в структуре ЛА бактерий, филогенетически удаленных от бактерий семейства Enterobacteriaceae, носят значительно более глубокий характер, затрагивают как гидрофильную, так и гидрофобную часть молекулы, и часто имеют хемотаксономическую ценность. II.2.2. Варианты липида А, имеющие модификации в структуре гидрофильной части молекулы Как говорилось выше, гидрофильная часть молекулы ЛА включает в себя углеводный фрагмент, фосфатные группы и полярные заместители. С появлением большого количества информации, касающейся структурной характеристики ЛА из различных видов бактерий, стало ясно, что в природе существует довольно широкий набор молекул, отличающихся между собой по структуре углеводного скелета. П.2.2.1.
Количественный состав жирных кислот липида А
По количеству ацильньгх заместителей ЛА подразделяют на пента-, гекса- и гептаа-цильные типы. Как правило, ЛА представляет собой набор молекул, отличающихся друг от друга по степени ацилирования. Принадлежность ЛА к тому или иному структурному типу определяется преобладанием молекул соответствующей степени ацилирования. Классическим, и наиболее распространенным, вариантом структуры ЛА является гексаа-цильный (рис. 1) [74]. ЛА с шестью остатками ЖК синтезируется во многих бактериях, в первую очередь, в бактериях сем. Enterobacteriaceae [7-9]. Существуют ЛА с симметричным (по три остатка ЖК на один остаток GlcN, ЛА из Shigella sonnei (рис. 10) [164], С. testosteroni [142], S. natans [143], С. violaceum [129], Rba. gelatinosus [165] и др.) и несимметричным (ЛА из Е. coli [74], S. minnesota R595 [78], S. typhimurium [76], S. flexneri \J1\ P. mirabilis [79], Haemophilus influenzae (рис. 11) [166], Campylobacter fetus [167] и др.) распределением ЖК на молекуле глюкозаминобиозы. Характерной особенностью ЛА с симметричным распределением ЖК является отсутствие ацилоксиалкановых кислот со сложноэфирным типом связи. Так, в гексаациль-ном ЛА из P. aeroginosa 3-гидроксидодекановые кислоты, ацилированные остатками 12 : 0 или 3-гидроксидодекановой кислот, имеют амидный тип связи. Показано, что присоединение ацилоксиацильных остатков к этому ЛА, в отличие от ЛА из Е. coli, происходит до его гликозилирования остатком Кдо [168]. Возможно, это явление наблюдается тогда, когда ГОБ синтезирует ЛА с симметрично распределенными остатками коротких ЖК. Другим объяснением может служить то, что поздние ацилтрансферазы могут обладать более широкой специфичностью к субстрату и способны присоединять ЖК к ЛА, не содержащему остатков Кдо [169]. В ЛА из бактерий рода Salmonella обнаружены молекулы с семью остатками ЖК [170]. Такую же степень ацилирования имеет часть молекул ЛА из Pantoea agglomerans, [171]. Вероятно, присоединение седьмого остатка ЖК является следствием мутации в кодирующем LpxD rmefirA. Бьшо показано, что у бактерий Е. coli и S. typhimurium с такими мутациями в ЛА появлялся седьмой остаток ЖК, кислота 16 : 0, присоединенная к N-связанной З-ОН-14 : 0 кислоте восстанавливающего конца [172], когда микроорганизмы выращивали при непермиссивных температурах [173]. Присоединение дополнительного остатка 16 : 0 кислоты осуществляется ацилтрансферазой PagP, использующей глицеро-фосфолипиды в качестве источника этой ЖК [174, 175].
Поскольку ЛА-дисахарид-синтаза не может использовать в качестве субстрата предшественник с остатком 16 : 0 кислоты, мутация в fir А должна происходить после этого шага биосинтеза ЛА, в результате чего получается дисахарид с семью остатками ЖК. Присоединение 16:0 кислоты к ЛА придает ему устойчивость к катионным антимикробным пептидам [131]. По-видимому, вставка дополнительного ацильного остатка, уменьшающая текучесть НМ, достаточна для предотвращения проникновения пептидов. Следует сказать, что гептаацильные ЛА встречаются довольно редко. Значительно чаще встречаются ЛА с более низкой степенью ацилирования. Примером такого ЛА является ЛА из P. gingivalis (рис. 8) [115], который имеет всего пять остатков ЖК. Недоацилированный тип структуры ЛА часто встречается у психрофильных бактерий, предпочитающих низкую температуру роста [16]. Пентаацильный тип структуры имеет также ЛА из B.fragilis (рис. 12) [117]. Отсутствие фосфата при атоме С4 дисахари-да D-GlcN, о чем говорилось выше, и сложноэфирносвязанных ацилоксиацильных групп в сочетании с низкой степенью ацилирования и преобладанием кислот с 15-17 атомами углерода являются уникальными особенностями этого ЛА, отличающими его от ЛА энтеро-бактерий. Подобным пентаацильным типом структуры обладают ЛА из патогенной Р. intermedia [119], Б. henselae (рис. 6), имеющей необычное строение углеводного скелета [111], Burkholderia caryophylli [133], Pseudoalteromonas haloplanktis, выделенной из вод Антарктического океана [176, 177], В. pertussis [178], многих бактерий рода Pseudomonas: P. aeruginosa [179], сапрофитной бактерии (патогена культивируемых грибов), P. reactans [121], P. cichorii [120]. Следует сказать, что наряду с пентаацильными молекулами, которые преобладают в общей популяции молекул (в ЛА из P. aeruginosa на долю молекул с пятью остатками ЖК приходится 75 % [179]), многие ЛА содержат гексаацильные производные с симметричным распределением остатков ЖК. Это дает возможность понять механизм образования недрацилированных структурных типов ЛА. Наличие в ЛА менее шести остатков ЖК может обуславливаться отсутствием вторичных ЖК, что является результатом мутации генов, гомологичных генам из Е. coli и других бактерий, участвующих в ацилоксиацилиро-вании ЛА. Так, при инактивации генов поздней ацилтрансферазы в Neisseria meningitidis (в гексаацильном ЛА из этой бактерии остатки ЖК расположены симметрично) были получены два мутанта. Из первого был выделен ЛА с пентаацильным типом структуры, в котором на невосстанавливающем конце GlcN отсутствовал остаток вторичной, 12:0, кислоты.
Из второго - ЛА с тетраацильным типом структуры, в котором отсутствовали оба остатка вторичной кислоты [180]. Аналогичным образом происходит образование недоа-цилированного типа ЛА с несимметричным распределением ЖК. Так, например, в результате мутации гена поздней ацилтрансферазы LpxM в ЛА из Е. coli и S. flexneri блокируется ацилирование тетрадекановой кислотой остатка кислоты З-ОН-10 : 0 в положении СЗ , что приводит к накоплению их пентаацильных производных [181]. Образование недоацилированных структурных типов ЛА может происходить также в результате действия деацилаз. Например, было показано, что в S. typhimurium PhoP/PhoQ-система активирует ген деацилазы PagL, термоустойчивого фермента НМ, удаляющего остаток кислоты З-ОН-10 : 0 из положения 3 восстанавливающего конца предшественника ЛА [182]. Родственная ЛА-липазная активность наблюдалась в мембранах нитрифицирующих бактерий R. leguminosarum и Rhizobium etli [83]. Однако, в отличие от PagL, ферменты этих микроорганизмов нуждаются в присутствии двухзарядных катионов для проявления активности. К ГОБ, содержащим частично З-О-деацилированные ЛА, относятся патоген P. aeruginosa [183], а также P. gingivalis, часть молекул ЛА которой не содержит обоих, 3- и З -сложноэфирносвязанньгх остатков ЖК [115]. Однако в этих микроорганизмах не обнаружены явные гомологи PagL, что предполагает наличие в них дополнительных, структурно отличающихся 3-О-деацилаз. ЛА необычного, тетраацильного типа был выделен из бактерии В. bronchiseptica, поражающей дыхательные пути млекопитающих и вызывающей синдром коклюша [184]. Тетраацильным типом обладает ЛА из Н. pylori (рис. 9) [118]. Степень ацилирования ЛА из этой бактерии зависит от того, из какого ЛПС (S- или R-формы) он был выделен: в ЛПС R-формы присутствует ЛА, содержащий 4 остатка ЖК; в ЛПС S-формы, наряду с тетраацильным ЛА обнаружен его гексаацильный аналог [118]. Интересно также, что из этой бактерии был выделен ЛА, не имеющий ацильного заместителя при СЗ атоме глюко-заминобиозы и, таким образом, содержащий всего три остатка ЖК (рис. 13) [132]. Особое место среди ГОБ занимают микроорганизмы, в которых отсутствует ЛПС. Так, было показано, что аэробная палочка Sphingomonas paucimobilis (ранее Pseudomonas paucimobilis) не содержит характерных для ЛПС составляющих, таких как 3-гидроксикислоты, Кдо и гептозы. Как следствие, попытки выделить ЛПС их этих бактерий были безуспешны. Вместо этого экстракцией смесью СНСІз-MeOH после гидролиза 5%-ной трихлоруксусной кислотой был получен гликосфинголипид [185], структура которого представлена на рис. 14 [186].
Структура липидов а из бактерий рода chryseobacterium
Открытый в 1994 г. род Chryseobacterium принадлежит к семейству Flavobacteri-асеае [246], которое является частью филогенетического кластера Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides [247, 248], и включает в себя четырнадцать видов бактерий. Это гетеротрофные, аэробные, желто-пигментированные, палочковидные ГОБ, не образующие спор, которые встречаются в морской среде и пресных водах, почве, а также выделяются из клинических источников. Объектами исследований этой части диссертационной работы стали типовые штаммы Chryseobacterium indoltheticum CIP 103168т [249], выделенный из морской слизи, и Chryseobacterium scophthalmum CIP 104199т [250], проявляющий патогенные свойства по отношению к морскому моллюску Scophthalmum maximus [251]. Структурные работы по ЛА из бактерий рода Chryseobacterium до настоящего времени не проводились. Обычным способом получения ЛА является мягкий кислотный гидролиз ЛПС, предварительно выделенных из ГОБ PhOH-содержащими системами различной степени гид- рофобности. Однако, используя этот подход, получить ЛА из бактерий С. indoltheticum и С. scophthalmum не удалось. В то же время жесткий щелочной гидролиз бактерий привел к получению 3-гидроксиалкановых кислот с высоким выходом (0,31 % и 0,39 % на вес обезжиренных клеток соответственно), что можно расценивать как косвенное доказательство присутствия в них ЛА-содержащих фрагментов. Одним из упрощенных способов получения ЛА является обработка бактерий 0,1 М НС1 или 10%-ной АсОН с последующей экстракцией смесью СНС13-МеОН, которая ранее успешно применялась для получения моно- [68] и дифосфорилированных [252] производных ЛА из Е. coli и Yersinia pseudotuberculosis соответственно. Используя гидролиз обезжиренных клеток С. indoltheticum и С. scophthalmum 10%-ной АсОН, мы получили препараты (выход 0,65 % и 0,60 % соответственно), содержащие фосфор, -GlcN и ЖК, что указывает на их принадлежность к ЛА (табл. 5). ГЖХ и ГЖХ-МС анализ метиловых эфиров ЖК изучаемых ЛА, очищенных гель-хроматографией на сефадексе LH-20 с последующей колоночной хроматографией на си-ликагеле или препаративной ТСХ (в случае ЛА из С. indoltheticum) показал, что основными ЖК были З-гидрокси-13-метилтетрадекановая (З-ОН-шо-15 : 0) и З-гидрокси-15-метилгексадекановая (З-ОН-юо-17 : 0).
Измерение оптического вращения фракций, содержащих 3-гидроксиалкановые кислоты, показало, что они имеют (Я)-конфигурацию ([cc]D = -14,1 (0,5, СНСІз) для С. indolthelicum и [a]D = -12,9 (0,5, CHC13) для С. scophthalmum). Присутствующие в гидролизатах транс-А -13-метилтетрадекановая (А -изо-15 : 0) и транс-А2- 15-метилгексадекановая ((А2-юо-17 : 0) кислоты [253], по-видимому, являются производными З-ОН-изо-15 : 0 и З-ОК-изо-17 : 0 кислот, которые, как и все 3-гидроксиалкановые кислоты, легко подвергаются дегидратации в условиях сильного кислотного или щелочного гидролиза [254]. В FAB-масс-спектрах отрицательных ионов ЛА из С. indoltheticum и С. scophthalmum (рис. 26(a) и (б) соответственно) присутствуют пики при m/z 766,31 и 766,2, которые соответствуют молекулярному иону [М-Н] , содержащему GlcN, фосфатную группу, кислоты З-ОН-изо-15 : 0 и З-ОН-изо-17 : 0. Молекулярная масса 767,4948 Да, рассчитанная для формулы C38H74O12NP, хорошо согласуется с данными FAB-MC. Наряду с пиками диацильного ЛА в спектрах обоих соединений наблюдаются пики при m/z 526,14 и 526,17, соответствующие моноацильным производным, которые, видимо, образуются в результате частичной деградации их молекул в условиях FAB-MC, а именно, в результате отщепления кислоты З-ОН-мзо-15 : 0. В случае ЛА из С. indoltheticum обнаружены также пики при m/z 508,1 и 510,16 (рис. 26(a)), продукты дегидратации иона при m/z 526,14., что подтверждает принадлежность кислоты З-ОН-изо-15 : 0 к 3-гидроксиалкановым кислотам. CAD-эксперименты с пиком молекулярного иона при m/z 766,97 ЛА из С. indoltheticum (рис. 26(e)) указывают на возможность отщепления кислоты З-ОН-изо-15 : 0 в условиях FAB-MC. Разрыв связи между GlcN и остатком ЖК возможен в том случае, если они соединены между собой сложноэфирной связью. Следовательно, данные масс-спектрометрии изучаемых ЛА косвенно указывают на сложноэфирный тип связи кислоты З-ОН-изо-15 : 0 с GlcN. Прямое доказательство было получено при обработке ЛА 0,12%-ной NH4OH: в гидролизатах ЛА из обеих бактерий была обнаружена кислота З-ОН-изо-15 : 0. Таким образом, ЛА из С. indoltheticum и С. scophthalmum представляют собой монофосфорилирован-ный GlcN с двумя остатками 3-гидроксиалкановых кислот, один из которых (З-ОН-изо-15 : 0) имеет сложноэфирный тип связи, другой (З-ОН-мзо-17 : 0) - амидный. Сдвиг в слабое поле сигналов HI (5,58 м.д.), Н2 (4,23 м.д.) и НЗ (5,20 м.д.) (рис. 28) указывает на замещение гидроксильиых и аминогруппы при атомах С1, СЗ и С2. Сигналы остальных протонов GlcN (Н4, Н5, Нба и Нбэ) находятся в области 3,60-3,90 м.д., что свидетельствует об отсутствии заместителей при соответствующих гидроксильиых группах.
Корреляция сигналов НЗ, Н4, Н5 с индивидуальными углеродными резонансами при 74,09, 68,85, 73,7 м.д. и сигналов Нба и Нбэ с сигналом С6-атома при 61,6 м.д. подтверждает отсутствие заместителей в положениях С4 и Сб. В тоже время сдвиг сигналов атомов С2 и СЗ в сильное и слабое поля соответственно демонстрирует наличие ацильного заместителя при СЗ-атоме. Малая (J(l, 2) 3,3 Гц) и большие (J(2, 3), J(3, 4) и ./(4, 5) 9-11 Гц) величины констант расщепления указывают на то, что GlcN изучаемых ЛА имеет а-аномерную конфигурацию с аксиальными протонами Н2-Н5. Положение сигналов атомов С1 (95,27 м.д.) и С2 (52,70 м.д.) подтверждает а-конфигурацию остатка GlcN. Два сигнала в области резонанса карбонильных групп (около 174 м.д.) и кросс-пики а-СН2 (2,45 и 2,51 м.д.; 2,25 и 2,33 м.д.), Р-СН (3,93 и 3,99 м.д.) и у-СН2 (1,45 и 1,48 м.д.) протонов с сигналами С-атомов при 44,05, 42,74, 69,28, 68,85 и 37,86 и 37,55 м.д. указывают на наличие сложноэфирно- и амидносвязанных 3-гидроксиалкановых кислот изо-серии (о присутствии кислот шо-серии свидетельствуют сигналы при 22,96 и 39,51 м.д. для четырех терминальных СНз-групп и двух (ю-І)-СН-групп соответственно). На основании полученные данных мы предлагаем следующую структуру для ЛА из С. indoltheticum и С. scophthalmum (рис. 29а). Таким образом, в результате проведенных исследований установлены структуры ЛА из двух бактерий рода Chryseobacterium, С. indoltheticum и С. scophthalmum. Показано, что они обладают необычной, моносахаридной природой и представляют собой 1-фосфат D-глюкозамина, ацилированный остатками (і?)-3-ОН-изо-15 : 0 и (і?)-3-ОН-мзо-17 : 0 кислот при С2- и СЗ-атомах соответственно. Следует отметить, что для получения ЛА мы использовали довольно жесткий (10%-ная АсОН, 100 С, 3 ч) гидролиз. Теоретически, такая обработка может вызвать частичную деградацию кислотолабильных связей в ЛА, что может привести к потере ЖК со сложноэфирным типом связи и гликозидносвязанного фосфата. Однако общеизвестно, что гликозидная связь между остатками GlcN в ЛА с двумя фосфатными группами устойчива в этих условиях. Например, Галлоуэй и Раетц [68], а также Красикова и соавт. [252] использовали более жесткий гидролиз (0,2 М НС1 и 1 М НС1 соответственно) для выделения ЛА. В обоих случаях наблюдалось отщепление кислотолабильной фосфатной группы в положении С1, однако полученные ЛА имели дисахаридную структуру. Более того, мы проверили влияние кислотного гидролиза на структуру монофосфорилированного ЛА и обработали клетки М. communis, ЛА которых не содержит фосфатной группы в положении 4 (рис. 22), 10%-ной АсОН. В результате был выделен ЛА, который не содержал продуктов гидролиза гликозидной связи и, согласно данным MALDIOF-MC, имел структуру, аналогичную структуре ЛА, полученного гидролизом ЛПС (рис. 30). Эти данные говорят в пользу того, что ЛА необычной моносахаридной природы не является артефактом, а реально существует в клетках бактерий рода Chryseobacterium.
Некоторые биологические свойства липидов а и липополисахаридов из бактерий родов chryseobacterium marinomonas
Конечной целью структурных изучений ЛА из морских бактерий был поиск среди них потенциальных антагонистов эндотоксинов. Наличие у ЛА из М. communis, М. mediterranea и С. indoltheticum необычных структурных особенностей (низкая степень ацилирования и фосфорилирования, необычное распределение остатков ЖК на молекуле глюкозаминобиозы, моносахаридный тип структуры (рис. 22, 25 и 29(a) соответственно)) делает перспективным изучение их биологических свойств. В рамках настоящей работы были изучены эндотоксические свойства ЛПС и ЛА из выше перечисленных микроорганизмов, а также проведена оценка возможности их использования в качестве потенциальных антагонистов эндотоксинов. Следует сказать, что все известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов обладают слабой токсичностью. Поэтому на первом этапе мы определили острую токсичность ЛПС из бактерий М. communis, М. mediterranea и С. indoltheticum (табл. 7). Согласно полученным результатам, ЛПС из М. mediterranea и, особенно, из М. communis проявляют слабую токсичность, их 50%-ные летальные дозы составляют 2,73 и 12,65 мкг/мышь соответственно. Для сравнения, ЛПС из Y. pseudotuberculosis и Е. coli имеют значительно более низкие 50%-ные летальные дозы (0,06 и 0,012 мкг/мышь (табл. 7) соответственно). ЛПС и Л А из С. indoltheticum были не токсичны при всех исследуемых дозах. Токсические свойства ЛПС связывают с их способностью индуцировать синтез ФНО а в иммунокомпетентных клетках человеческой крови. Поэтому для характеристики эндо-токсического и антиэндотоксического потенциала биологических препаратов различного происхождения часто используют способность изучаемых соединений индуцировать и/или ингибировать синтез ФНО а [27]. Нарис. 34 представлены данные индукции синтеза ФНО а ЛПС и ЛА из М. communis, М. mediterranea и С. indoltheticum в пробах цельной крови человека. ЛПС из М. communis был не активен: даже при максимально высокой концентрации препарата (10 мкг/мл) содержание цитокина в пробе с исследуемыми веществом не превышало его содержания в контрольной пробе. ЛПС из М. mediterranea и С. indoltheticum начинают индуцировать синтез ФИО а в концентрации 100 и 10 нг/мл соответственно (для сравнения, синтез ФНО а под действием ЛПС из Е. coli начинается при концентрации менее 0,1 нг/мл).
Максимальное количество ФНО а индуцируется при концентрации 1 и 10 мкг/мл для ЛПС из М. mediterranea и С. indoltheticum соответственно, но оно в 3,2 и 1,4 раза ниже содержания ФНО а в пробах с теми же концентрациями ЛПС из Е. coli. ЛА из М. communis и С. indoltheticum (ЛА из М. mediterranea в этом тесте не изучался) не индуцируют синтез ФНО а в исследуемом диапазоне концентраций (рис. 34(6)). Таким образом, ЛПС и ЛА из морских ГОБ С. indoltheticum, М. communis и М. mediterranea значительно отличаются по способности индуцировать синтез ФНО а как между собой, так и от ЛПС из Е. coli. Как известно [143, 152], максимальной эндотоксиче-ской активностью обладают ЛПС, ЛА которых имеют два остатка GlcN, две фосфатных группы и шесть остатков ЖК, т.е. такие, как ЛА из Е. coli (рис. 1 [74]). Из изученных нами ЛА наиболее близким по структуре ЛА из Е. coli является ЛА из М. mediterranea (рис. 25), который представляет собой смесь двух типов молекул, отличающихся между собой степенью ацилирования: часть молекул (меньшая) имеет шесть остатков ЖК, другая (значительно большая) - пять. В соответствии с этим, ЛПС из М. mediterranea, доля молекул ЛА с гексаацильным типом структуры в котором невелика, имел значительно более низкую индуцирующую активность, чем ЛПС из Е. coli. В отличие от ЛА из М. mediterranea, ЛА из М. communis является монофосфорили-рованным производным и не имеет ацильного заместителя при СЗ -атоме невосстанавли-вающего конца глюкозаминобиозы (рис. 22). Это может объяснять, почему ЛА и ЛПС из М. communis не индуцировал синтез ФНО а даже в максимально высоких концентрациях. По-видимому, определенный вклад в низкую эндотоксическую активность изучаемых препаратов вносит отсутствие в составе их молекул фосфатной группы. Наиболее активным индуктором синтеза ФНО а из всех проверенных нами образцов оказался «ЛПС» из С. indoltheticum. Как и другие ЛПС, исследуемые в настоящей работе, он был получен в результате обработки бактерий С. indoltheticum горячим водным PhOH. Однако, как указывалось выше, он не содержит 3-гидроксиалкановых кислот, обязательных компонентов практически всех изученных к настоящему времени ЛПС [203], и из него не выделяется ЛА. Таким образом, достаточно высокая индуцирующая способность этого препарата определяется не липидным фрагментом его молекулы, который у него отсутствует, а какими-то другими особенностями его состава или структуры. В отличие от «ЛПС», ЛА из С. indoltheticum не индуцировал синтез ФНО а в клетках крови человека (рис. 34(6)). Как говорилось выше, в структурном плане он подобен биосинтетическому предшественнику ЛА [255] (рис. 29(a)) и некоторым синтетическим мо- носахаридным аналогам ЛА, известным своей низкой эндотоксической активностью [213, 267], что хорошо согласуется с полученными нами данными (рис. 34(6)). Таким образом, изучаемые нами ЛА и ЛПС являются слабыми индукторами синтеза ФИО а в клетках крови человека. Следует сказать, что все известные к настоящему времени антагонисты эндотоксинов на основе ЛА практически не индуцируют синтез цито-кинов в клетках крови человека и проявляют слабую токсичность [12, 210, 222]. Высокие 50%-ные летальные дозы ЛПС и ЛА из М. communis и ЛА из С. indoltheticum в сочетании с их низкой индуцирующей способностью предполагают, что они могут быть антагонистами эндотоксинов, т.е. препятствовать связыванию эндотоксинов со специфическими рецепторами на клетках-мишенях макроорганизма, тем самым ингибируя синтез ФНО а и, в конечном итоге, предотвращая процессы, ведущие к развитию патофизиологических реакций.
В связи с этим, мы изучили способность этих соединений ингибировать индуцированный ЛПС из Е. coli (в концентрации 10 нг/мл) синтез ФНО а. Как видно из рис. 35, ЛА из С. indoltheticum ингибирует синтез ФНО а на 16,0 и 40,7 %, но только при максимально высоких исследуемых концентрациях препарата (10 и 100 мкг/мл). Интересно, что первоначально попытки найти антагонисты эндотоксинов были сфокусированы именно на моносахаридных аналогах ЛА, однако полученные данные несколько противоречивы. Так, было показало, что ЛХ практически не проявлял эндотокси-ческие свойства и мог ингибировать действие энтеробактериальных ЛПС у животных и в некоторых клеточных системах [217,268-271], но не проявлял подобные свойства в случае макрофагов мышей и человека, в то время как синтетический моносахаридный аналог ЛА полностью ингибировал синтез ФНО а иммунокомпетентными клетками человека, индуцированный ЛПС из S. abortus equi [213]. Следует сказать, что ЛХ и Л А из С. indoltheticum, с одной стороны, и синтетический аналог ЛА, с другой, отличаются друг от друга положением фосфатных групп. По-видимому, именно этим объясняются различия в биологической активности синтетического моносахаридного аналога и ЛА из С. indoltheti-сит. ЛА из М. communis, несмотря на свою низкую ФНО а-индуцирующую активность, обладал слабыми ингибирующими свойствами (рис. 35). При концентрациях 10 и 100 мкг/мл содержание ФНО а под действием этого препарата уменьшалось всего на 19,8 и 24,5 % соответственно. В отличие от ЛА, ЛПС из М. communis проявлял ярко выраженные антагонистические свойства (рис. 35): ингибирование синтеза ФНО а наблюдалось уже при концентрации 10 нг/мл, достигая максимального значения (почти 80%-ное ингибирование) при концентрации 1000 нг/мл. Несовпадение биологической активности ЛА из М. communis и соответствующего ЛПС, включающего в свой состав идентичный по структуре эндотоксический центр, может объясняться тем, что гидрофильный ЛПС [272] и гидрофобный ЛА по-разному ведут себя в водных растворах. Следует отметить, что увеличение содержания ЛПС из М. communis в пробе приводило к снижению его ингибирующей активности. В результате, при концентрации ЛПС 100 мкг/мл содержание ФНО а всего на 18 % ниже, чем в контрольной пробе.
