Содержание к диссертации
Введение
1 Протонные аденозинтршосфатазы бактерий и митохондрий 7
1. Субъединичный состав Н+-АТР-азного комплекса 10
2. Стехиометрия субъединиц Н+-АТР-азных комплексов бактерий и митохондрий 19
3. Биогенез Н+-АТР-аз бактерий, митохондрий, хлоро-пластов 24
4. Аминокислотная последовательность отдельных субъединиц Н+~АТР-аз бактерий, митохондрий и хлороп-ластов 30
2 Результаты и обсуждение 50
1. Выделение и характеристика OSCP 51
2. Исчерпывающий гидролиз OSCP трипсином. Выделение и анализ пептидов 55
3. Выделение и характеристика продуктов бромциано-вого расщепления OSCP 71
Материалы и методы 84
Выводы 100
- Стехиометрия субъединиц Н+-АТР-азных комплексов бактерий и митохондрий
- Аминокислотная последовательность отдельных субъединиц Н+~АТР-аз бактерий, митохондрий и хлороп-ластов
- Исчерпывающий гидролиз OSCP трипсином. Выделение и анализ пептидов
- Выделение и характеристика продуктов бромциано-вого расщепления OSCP
Стехиометрия субъединиц Н+-АТР-азных комплексов бактерий и митохондрий
При определении стехиометрических соотношений использовались несколько разных подходов, один из которых предусматривает окрашивание красителями гелей с разделенными субъединицами АТР-азного комплекса и последующее денситометрическое определение интенсивности отдельных белковых полос. Этим методом Кагавой с сотрудниками была найдена следующая формуда PQ для термофильной бактерии PS-3 - а : ъ : с = 1:(2-3): :(4-6), что также было подтверждено измерением количества радиоактивной метки, включившейся в каждую субъединицу при выращивании клеток PS-з на среде с радиоактивно-меченными аминокислотами /18,109/. Фостер и Филлингейм на основании изучения субъединиц фермента, выращенных на среде с [ s] -сульфатом и [С] -глюкозой, применение которых обеспечивало равномерное введение метки во все субъединицы, пришли к следующей формуле PQ для E.coli - а : ъ : с = 1:2:(10) /НО/. Отличное от этого соотношение субъединиц PQ АТР-азного комплекса E.coli получено Нильсеном и сотрудниками /III/. При сканировании авторадиограмм белков Н -АТР-азы из клеток E.coli , выращенных на среде с [ s] -метионином и разделенных электрофорезом в ПААГ, принимая во внимание установленное ими в ходе определения нуклеотидной последовательности соответствующих генов atp -оперона количество остатков метионина в субъединицах PQ, этими авторами была предложена следующая стехиометрия: а: ъ :с = 1:1:6 или 1:1:8. При изучении топографии АТР-азного комплекса Е.СОІІ с помощью бифункциональных агентов были получены димеры субъединицы Ь f что указывало на то, что в составе PQ E.coli входит больше одной субъединицы b /112/. Из сказанного следует, что единственным фактом, не вызывающим сомнения у исследователей, является то, что ДЦКД-свя-зывающий белок входит в состав фактора PQ бактерий в виде олигомера. Об этом также свидетельствуют эксперименты по ингибированию активности PQ дициклогексилкарбодиимидом. Для блокирования переноса протонов через PQ не обязательна модификация всех молекул протеолипида. В случае E.coli полное ингибирование наступает при модификации 1/3 молекул ДЦКД-связывающего белка /ИЗ/. Аналогичные результаты были получены для PQ термофильной бактерии PS-3 /И4/. Определение стехиометрии митохондриального FQ затруднено из-за отсутствия точного качественного (более сложного) субъединичного состава.
При использовании минимальной концентрации ДЦКД, ингиби-рующей І -АТР-азу митохондрий дрожжей и и. crassa модифицируется I из б молекул протеолипида /115/. В слзгчае митохондриального комплекса дрожжей и бычьего сердца удалось показать, что протеолипид выделяется в виде высокомолекулярного производного (45 кДа у дрожжей и 18 кДа у быка), которые, по-видимому, являются его природными гекса- (в случае дрожжей) или тримерами (в случае митохондрий сердца быка) /74, 116/. При определении стехиометрии наиболее хорошо изученного компонента мембранного сектора - OSCP было показано, что 2-3 молекулы этого белка необходимы для реконструкции олиго-мицин-чувствительной АТР-азы из OSCP , Fj и СМЧ, лишенных Fj и OSCP /84,117/. В аналогичных опытах у других авторов титр OSCP равен 1,1-0,5 моль OSCP/ моль Fj /118/. Также изучалось молярное соотношение OSCP : Fj при образовании комплекса OSGP - Fj в растворе. Двумя группами авторов было показано, что 3 моля OSCP образуют комплекс с I молем Fj /94,97/. В аналогичных опытах с использованием 26,5 кДа -белка крысиной печени (гомолога OSCP из митохондрий бычьего сердца) было обнаружено соотношение I моль 26,5 кДа / I моль Pj /94/. Подобные результаты были получены при оценке количества 26,5 кДа - белка и OSCP методом окрашивания разделенного в ПААГ нативного АТР-азного комплекса (1,2 моль 26,5 кДа/ / моль АТР-азы и 0,7 моль OSCP / моль АТР-азы) /94/. По мнению Фишера, завышенный титр OSCP по сравнению с 26,5 кДа -белком, полученный в ряде экспериментов, связан со спонтанным образованием димеров, обусловленным окислением остатков цистеина. Обработка OSCP к -зтилмалеимидом снижала титр OSCP до I моля на моль Pj, а модификация OSCP Си -фенантролином, приводящая к окислению цистеинов и образованию димеров, предотвращала образование комплекса PJ-OSCP /94/. Для АТР-азного комплекса дрожжей была исследована стехиометрия белка АТР6 /119/. Методом электрофореза в градиенте ПААГ удалось показать, что АТР6 входит в состав комплекса в виде двух изобелков с близкими молекулярными массами. Методом иммунопреципитации фермента, выращенного на среде, содержащей меченные [с] -аминокислоты, было подсчитано, что каждый из изобелков представлен двумя копиями. 0 стехиометрии Fg, Pg и других компонентов MFQ пока нет достоверных сведений. Pj -сектор. Стехиометрия субъединиц MPj, BFj и CFj обсуждается на протяжении двух десятков лет. Главное внимание исследователей сосредоточено на выяснении количества копий больших субъединиц об и /3 » которые формируют каталитический центр молекулы.
Для бактерий общепринятой является формула з/ З Ъ-? Наиболее убедительные доказательства в пользу существования трех копий оС- и /3-субъединиц были получены Кагавой и сотрудниками /120/ для термофильной бактерии PS-3 при изучении количества титрующихся SH -групп в составе целой молекулы Pj и индивидуальных субъединиц фермента. В пользу о( з/Зз стехиометРии Г0В0РЯТ данные, полученные при анализе радиоактивности, включенной в субъединицы Pj, выделенные из бактерий, выращенных на среде, обогащенной [ с] -аминокислотами, [С] - глюкозой или р s] -сульфатом для E.coli /121/ и M.lysodecticus /122/. Стехиометрия оі /З ІҐ б. была также получена Данном и сотрудниками /123/ в экспериментах по реконструкции Pj E.coli при смешивании выделенных гомогенных препаратов оС -» /3 -» У"- » 8- и -субъединиц в различных соотношениях. Об этом свидетельствуют и результаты химической модификации Pj E.coli высокой концентрацией [С] -ДІЩ, приводящей к инактивации фермента /124/, а также данные опытов с использованием моноклональных антител против о( -субъединицы Pj E.coli /125/. На электронной микрофотографии комплекса Pj-моноклональные антитела наглядно видно, что в состав Pj входит 3 симметрично расположенные оС -субъединицы. Суммируя выше сказанное, по-видимому, можно считать доказанным, что в состав BFj входит 3 оС- и 3 /3-субъединицы . Количество минорных субъединиц точно не установлено. В случае MFj единого мнения относительно стехиометрии субъединиц пока не существует, хотя наиболее вероятной считается формула оі з/З з Г -і Опыты по связыванию [ СІ - -ауровертина /126/ доказывают, что в состав MPj бычьего сердца входит 3 уЗ-субъединицы, в противоположность ранее опубликованным данным, согласно которым MPj содержит 2/3 /54/. Формула о 3/З3 Т д6 была предложена для MPj крысиной печени на основании интенсивности окрашивания субъединиц после разделения электрофорезом в ПААГ /127/. При анализе количества радиоактивности, включенного в субъединицы MPj ,s . cerevisiafi , выросших на среде с [ С] -аминокислотами, а также определении титруемых SH-групп в этом фермента была предложена формула з/ З /128/. Наличие трех сК - и трех /3 -субъединиц также согласуется с существованием б нуклео-тидсвязывающих мест на ферменте /129/. Однако данные рентге-ноструктурного анализа кристаллов, полученных из препаратов Pj крысиной печени, объясняют как формулу Ы з/ З так и о( Z/3Z /130/. Что касается белкового ингибитора, то считается общепринятым, что он взаимодействует с MPj при соотношении I моль ингибитора / I моль фермента /60/.
Аминокислотная последовательность отдельных субъединиц Н+~АТР-аз бактерий, митохондрий и хлороп-ластов
Наиболее полная информация об аминокислотной последовательности субъединиц Fj получена для бактерии E.coli . Как указывалось ранее, на основании структуры генов atp -оперона были выведены аминокислотные последовательности для всех пяти субъединиц Fj, установлено точное число остатков (о(-513, /3-460, У -287, О -177, -133) и их молекулярные массы (оС -55,264 кДа, /3 -50,157 кДа, )Г-31,41 кДа, -19,31 кДа, Ss -14,194 кДа) /131/. Кроме того, определена полная или частичная структура некоторых субъединиц каталитической части из митохондрий сердечной мышцы быка и дрожжей, хлоропластов шпината и кукурузы, а также термофильной бактерии PS-3 /54/. Первичные структуры /3 -субъединиц Fj-ATP-аз E.coli » митохондрий бычьего сердца, дрожжей и хлоропластов чрезвычайно консервативны, около 70% аминокислотных остатков идентичны /138/. По данным Уолкера и сотрудников /152/, высокой консервативностью обладают и с -субъединицы из фермента митохондрий сердечной мышцы быка и Е. col . Теми же авторами было отмечено, что существует слабая гомология (около 20% идентичных и 15% консервативно замещенных аминокислот) между cL - 1& 3 -субъединицами E.cli , наблюдаемая на всем протяжении молекул. Учитывая близкие молекулярные массы обеих субъединиц, авторы полагают, что по крайней мере для . E.cali , оС - и А -субъединицы имеют общего предшественника. По-видимому большие субъединицы митохондриального комплекса сердечной мышцы быка также имеют сходную структуру /138/. Консервативность d- и /з-субъединиц не была неожиданностью, так как ранее иммунохимическими методами было установлено, что антитела против оС -субъединицы Н АТР-азы митохондрий сердца быка взаимодействуют как с о( -, так и с /3 -субъединицей /138/. На основании аминокислотной последовательности уЗ -субъединицы E.coli Каназавой было предсказано, что остатки /3 - 240-330 образуют нуклеотид-связывающий домен /153/, существование которого было предсказано Россманом для многих ферментов. В лаборатории Уолкера /152/ при анализе аминокислотных последовательностей с помощью ЭВМ были выявлены два небольших участка (А и В) в составе о( - и /3 -субъединиц, гомологичные участкам полипептидной цепи других белков, использующих АТР в качестве субстрата (табл. I). Методом химической модификации было локализовано несколько аминокислотных остатков уз -субъединиц из различных источников, входящих в активный центр фермента.
В таблице 2 показано, что остатки Туг , связывающийся с аналогом АТР пара-фторсульфонил [14с] -бензо-5-аденозином (FSBA) , Giu , модифицируемый ДЦКД, Туг , взаимодействующий с 7-хлор-4-нитро- Iі С ] бензофуразаном ( [ с] - Kbf - сі ) находятся в районах гомологичных последовательностей /54,154/. Первичным акцептором Mbf-Cl при модификации MFj бычьего сердца является остаток ЇУГ311 fi-субъединицы, однако при подщелачивании среды происходит миграция ингибитора на лизин, при этом АТР-азная активность МРт остается подавленной. Этот остаток лизина также был локализован ( Lysl6„ ) /155/. Интересно отметить, что ьУ3іб2 входит в состав фрагмента А. /3-субъединицы быка (табл. I) и является консервативным во всех нуклеотид-связывающих белках. Кристаллографический анализ фермента аденилаткиназы показал, что ее остаток Ьув2І (гомолог Ьув1б2 Р -субъединицы АТР-азы быка), по-видимому, взаимодействует с фосфатом при катализе. Приведенные выше данные указывают на то, что активный центр АТР-аз эволюционно далеких видов устроен по единому принципу. Кроме того, имеется определенное сходство в организации активного центра многих нуклеотид-связывающих ферментов. Отсутствие данных об аминокислотной последовательности У -субъединицы из MFj и CPj не позволяет оценить степень консервативности этой субъединицы фермента, однако следует отметить, что ее Mr в -АТР-азах бактерий, хлоропластов и митохондрий находится в пределе 30-33 кДа /54/. Как отмечалось ранее, Mr о - и -субъединиц из различных источников сильно различаются (см. раздел I). Кроме того, -субъединица бактерий и хлоропластов является природным белковым ингибитором АТР-азной активности (диссоциация или ограниченный протеолиз . приводит к повышению АТР-азной активности BPj и CPj) /156/. Фикция _ -субъ-единицы митохондрий до настоящего времени не выяснена. Определение аминокислотной последовательности О -субъединицы из митохондрий сердца быка позволило установить, что она является аналогом -субъединицы бактерии E.coli /157/, в свою очередь бактерий гомологична по структуре и функциям хлоропластов /150/. Однако -субъединицы бактерий и хлоропластов гораздо менее консервативны, чем /3 -субъединицы соответствующих видов.
В 1981 году была определена аминокислотная последовательность белкового ингибитора из митохондрий сердечной мышцы быка /158/ и S.cereviciae/I59/. Ингибитор из митохондрий сердца быка содержит 84 аминокислотных остатка ( Mr = 9,758 кДа), а ингибитор дрожжей - 63 а.о. ( Mr = 7,383 кДа) Оба ингибитора имеют общие черты строения, в частности, распределение заряженных и гидрофобных остатков по цепи молекул неравномерно, основные и кислые аминокислоты организованы в кластеры. Оба белка имеют участки повторяющихся последовательностей, что указывает на дупликацию ДНК в процессе эволюции. Недавно было показано, что аминокислотные последовательности ингибиторов гомологичны (36 аминокислотных остатков идентичны или консервативны). Оба белка характеризуются высоким содержанием о( -спиралей, для ингибитора дрожжей предсказано существование длинного с -спирального участка (ост. 14-63) /160/. Как отмечалось ранее, во взаимодействие ингибитора с FjpQ-ATP-азой дрожжей вовлечены стабилизирующие факторы I5K и 9К. При добавлении обоих факторов к PJPQ время образования комплекса PjFQ-ингибитор на порядок уменьшается, кроме того эти факторы полностью предотвращают диссоциацию ингибитора в ответ на удаление АТР и % .В случае растворимой Pj-ATP--азы добавление стабилизирующих факторов не влияет на кинетику взаимодействия ингибитора с ферментом. Поскольку факторы влияют только на мембраносвязанную Fj-ATP-азу или очищенный FJFQ-КОМПЛЄКС, но не растворимую Fj, весьма вероятно, что FQ необходим для образования стабильного комплекса FjFQ-ингибитор - I5K - 9К, который, возможно, является природной формой Н АТР-азы дрожжей, а белки I5K и 9К - составными частями мембранного сектора. Определение аминокислотной последовательности 9К - фактора /160/ показало, что этот белок имеет ряд особенностей, характерных также для ингибиторов (неравномерное распределение заряженных и гидрофобных аминокислотных остатков и их кластеризация, высокое содержание об-спиральных участков, наличие повторяющихся последовательностей). Стабилизирующий фактор 9К гомологичен обоим ингибиторам, особенно дрожжевому (около 50% аминокислотных остатков идентичны) (рис. 5 а, б). Участки повторяющихся последовательностей ингибитора дрожжей и 9К-белка совпадают, что по мнению авторов, указывает на то, что дупликация генов произошла раньше, чем точечные мутации, которые привели к появлению двух белков с разными функциями. Несмотря на обнаруженную гомологию, между ингибитором дрожжей и 9К-белком не было найдено перекрестных иммунологических реакций. Авторы отмечают, что между белками I5K и 9К существует также некоторая гомология в аминокислотных последовательностях.
Исчерпывающий гидролиз OSCP трипсином. Выделение и анализ пептидов
Согласно аминокислотному составу (табл. 3), полипептидная цепь osc? содержит более 15% остатков основных аминокислот (9 аргининов и 21 лизин). Поэтому в качестве первого этапа исследования структуры оказалось целесообразным проведение исчерпывающего гидролиза OSCP трипсином. Для предотвращения окисления остатка цистеина препарат белка карбокси-метилировали в денатурирующих условиях в присутствии меркап-тоэтанола иодуксусной кислотой по методу /172/. Поскольку такой препарат плохо растворялся при рН 8,3, то гидролиз проводили на свежеприготовленной суспензии, полученной быстрым диализом раствора белка в Ш мочевине против большого объема 0,1 N Ші НСО . Обработку белка ферментом проводили до полного исчезновения осадка в течение 4 часов при 37С, соотношение фермент - субстрат I : 50 по весу. Реакцию останавливали замораживанием раствора и лиофилизацией. При анализе гидролизата методом пептидных карт /173/ было обнаружено, что количество образовавшихся пептидов достаточно хорошо согласуется с ожидаемым (рис. II), причем все пептиды обладали электрофоретической или хроматографи-ческой подвижностью на бумаге. Поэтому для разделения смеси триптических пептидов нами была использована ставшая уже традиционной схема, включающая ионообменную хроматографию с последующим разделением образовавшихся фракций хроматографией на бумаге в системе ПБУВ (пиридин-бутанол-уксусная кислота-вода - 10:15:3:12). Первоначальное разделение гидролизата осуществлялось на колонке высокого давления с катионитом AG-50wx4 в градиенте концентрации и рН пиридин-ацетатного буфера. Анализ элюата осуществляли с помощью автоматического пептидного анализатора (и Technicon ", США). Промывка колонки после окончания опыта IN Каон показала, что элюция пептидов со смолы прошла полностью. В результате разделения было получено 16 объединенных фракций (рис. 12). Фракция Ш содержала довольно значительное количество солей, присутствие которых было обнаружено при концентрировании этой фракции на роторном испарителе.
Поэтому с целью обессоливают, эта фракция подвергалась дополнительной хроматографии на колонке с сефадексом G-Ю, уравновешенным слабым раствором аммиака (рис. 13). Анализ полученных фракций на гомогенность с помощью хроматографии в тонком слое целлюлозы в системе ПБУВ (рис.14) и определение N -концевой аминокислоты показал, что фракции П, Ш, ХІУ и ХУЇ представляют собой гомогенные пептиды, остальные содержали смесь двух и более фрагментов. С помощью хроматографии на бумаге фракции ІУ, УІ-УШ, X, XI и ХУ были полностью разделены на индивидуальные компоненты. Из фракций У и IX было получено соответственно 2 и 4 гомогенных пептида. Для разделения фракций I, ХП, ХШ, а также У-2 и IX-5 на индивидуальные компоненты была использована высокоэффектив- ацетонитрила в 10 тМ СН СОСШ4 , рН 5,6 (рис. 15а,б,в,г,д). Данные о распределении триптических пептидов по фракциям, их аминокислотный состав и и -концевые аминокислотные остатки приведены в таблице 4. В общей сложности было получено 42 пептидные фракции, содержащие гомогенный пептидный материал. Определение аминокислотного состава пептидов из этих фракций, а также результаты анализа их и -концевых аминокислотных остатков показали, что большинство индивиду- альных пептидов сконцентрировано в отдельных четко разделяемых фракциях, полученных при ионообменной хроматографии). Однако некоторые пептиды с идентичным аминокислотным составом были выделены из соседних фракций из-за неполного разделения последних. Выход пептидов Т-Ш и T-XI-2 в сравнительно далеко отстоящих друг от друга хроматографических пиках обусловлен частичным превращением и -концевого глута-мина в пироглутаминовую кислоту (н -концевой остаток пептида T-XI-2- Gin э пептид Т-Ш не содержал свободную аминогруппу при анализе дансильным методом, после обработки этого пептида неї в метаноле, приводящей к раскрытию пироглутаминового цикла, и последующего дансилирования в качестве я -концевой аминокислоты была найдена глутаминовая кислота), а в случае пептидов Т-УІ-2 и Т-УШ-4, Т-ХІ-І и Т-ХІУ - по-видимому, различной степенью окисления остатков метионина, входящих в их состав. и -Концевая аминокислотная последовательность всех пептидов, за исключением Т-І-І, устанавливалась методом Эдма-на /174/ с идентификацией аминокислот в виде 1-диметиламино-нафталин-5-сульфонильных ( иш ) производных / 175/ или фенилтиогидантоинов (Fffl) /176/. Второй вариант применялся при анализе пептидов, содержащих дикарбоновые аминокислоты и их амиды, так как дансильные производные амидов дикарбо-новых аминокислот разрушаются в условиях кислотного гидролиза. С-Концевая последовательность пептидов Т-П, T-I-3 и T-I-4 определялась с помощью карбоксипептидазы Y /177/. В таблице 5 приведены триптические пептиды, строение которых было установлено этими методами. Пептид Т-П не содержит остатков лизина и аргинина, и его С-концевой аминокислотой так же, как и целой молекулы белка, является лейцин.
Отскща было сделано заключение, что этот пептид занимает С-концевое положение в молекуле белка. Пептид Т-У-2-2 из-за практически полного неспецифического расщепления трипсином связи Phe-x был выделен в незначительных количествах, поэтому была установлена лишь часть его аминокислотной последовательности, совпадающая со структурой пептида T-I-3. Расщепление связи phe-X обусловлено, по-видимому, наличием химотриптической или химотрипсиноподобной активности в используемых препаратах фермента. Возможно, лабильность этой связи отражает особенности пространственной организации белка. Данные по определению аминокислотной последовательности пептида T-I-ї суммированы в таблице 6. Автоматической деградацией на жидкофазном секвенаторе была определена последовательность 19 аминокислотных остатков. Для установления полной структуры пептид T-I-ї был подвергнут гидролизу протеиназой V8 из Staphylococcus aureus . Образовавшуюся смесь двух фрагментов анализировали по методу Эдмана с идентификацией DMS - и РТН-производных аминокислот, что позволило определить С-концевую последовательность пептида и, таким образом, установить его структуру. Следует отметить, что из трех связей Glu-x » содержащихся в этом пептиде, гидролизу подвергалась лишь связь Glu-Ala (15-16), в то время как две другие ( Glu-Val (2-3) и Glu-Leu (20-21)), находящиеся вблизи N - и С-концевых остатков пептида, остались нерасщепленными. Полученные результаты находятся в соответствии со специфичностью действия протеиназы V8 . Так известно, что связь типа Giu-x-Pro является устойчивой к действию протеиназы /178/, кроме того, фермент плохо гидролизует связи Glu-x , находящиеся вблизи и- и С-концевых остатков полипептидной цепи, в результате расщепления которых образуются свободные аминокислоты, ди- или трипептиды /179/. Таким образом, в результате проведенной работы из смеси триптического гидролизата карбоксиметилированного препарата OSCP были выделены 31 индивидуальный пептид и свободные I ys и Arg . Установлена полная аминокислотная последовательность 30 пептидов и частичная - пептида Т-У-2-2. В целом триптический гидролиз OSCP прошел достаточно специфично. Все пептиды, кроме T-I-3 и Т-П, содержали в качест- ве С-концевых остатков Ъу8 и Arg . Выделенные триптические пептиды, за исключением продуктов неспецифического гидролиза и неполного расщепления некоторых связей (пептиды Т-Ш, Т-ХП-2 и Т-ХУ-І), содержат в общей сложности 190 аминокислотных остатков. Как показало определение полной аминокислотной последовательности OSCP , из триптического гидролизата были выделены все пептиды, составляющие молекулу белка. На следующем этапе изучения первичной структуры OSCP для объединения триптических пептидов в более крупные блоки было проведено расщепление молекулы белка бромцианом. Этот метод наиболее широко используется в белковой химии для получения крупных пептидных фрагментов, так как содержание метио-нина в белке, как правило, невелико, а расщепление белка этим химическим реагентом протекает наиболее селективно и количественно. По данным аминокислотного анализа белок содержит 8 остатков метионина, причем два из них входят в состав триптического пептида Т-У-2-2, структура которого установлена лишь частично.
Выделение и характеристика продуктов бромциано-вого расщепления OSCP
На следующем этапе изучения первичной структуры OSCP для объединения триптических пептидов в более крупные блоки было проведено расщепление молекулы белка бромцианом. Этот метод наиболее широко используется в белковой химии для получения крупных пептидных фрагментов, так как содержание метио-нина в белке, как правило, невелико, а расщепление белка этим химическим реагентом протекает наиболее селективно и количественно. По данным аминокислотного анализа белок содержит 8 остатков метионина, причем два из них входят в состав триптического пептида Т-У-2-2, структура которого установлена лишь частично. В результате действия бромциана можно было ожидать образования, по крайней мере, 8-9 пептидов. Расщепление белка бромцианом проводили в стандартных условиях (500 молей реагента на моль метионина, 70% муравьиная кислота, 20 часов, комнатная температура) /180/. Белок предварительно денатурировали при рН 8,3 в присутствии меркаптоэтанола. В качестве N -концевых остатков полученных пептидных фрагментов были индентифицированны Phe , Gly, Thr, Ala, Arg, Ser, lie. Необходимо отметить, что разделение пептидов, образующихся в результате расщепления белка бромцианом, довольно часто вызывает серьёзные трудности, поскольку крупные фрагменты, особенно при высоком содержании в них гидрофобных аминокислот, проявляют повышенную склонность к образованию устойчивых агрегатов /181/. Для подбора оптимальных условий разделения, позволяющих в наибольшей степени исключить агрегацию пептидов, была проведена серия аналитических экспериментов, для каждого опыта брали не более 0,05 мкм гидролизата. Было показано, что растворы 6М мочевины, 4М гуанидинхлоргидрата и 30% НСООН примерно в одинаковой степени подавляют агрегацию пептидов. Однако применение 30% НСООН имело некоторые преимущества, так как позволяло анализировать белковые фракции без предварительно обессоливания. Оценка величины молекулярных масс образовавшихся бром-циановых пептидов электрофорезом в 20% ПААГ в присутствии SDS показала, что целесообразным является первоначальное фракционирование пептидов методом гельфильтрации на биогеле Р-Ю.
В результате разделения бромцианового гидролизата хроматографией на биогеле Р-Ю в 30% НСООН было получено 7 объединенных фракций (рис. 16). Фракция У по данным N -концевого анализа содержала гомогенный пептид В-У и дальнейшей очистке не подвергалась. Во фракции УП методом аминокислотного анализа были идентифи- цированы гомосерин и гомосеринлактон, І что указывало на наличие в -молекуле белка связи метионил-метионин. Для выделения пептидов из фращии УІ использовали ВЭЖХ на носителе siiasorb Сjo, а из фракций П-ІУ, содержащих сравнительно более высокомолекулярные пептиды, - ВЭЖХ на колонке с носителем siiasorb Со. На рисунке 17 (а,б,в,г) представлены хроматограммы разделения указанных фракций. Фракция I содержала нерасщепленный белок и агрегаты крупных.пептидов, выделить гомогенные пептиды из нее не удалось. Распределение пептидов по фракциям, их аминокислотный состав и N -концевые аминокислотные остатки указаны в таблице 7. По данным аминокислотного анализа и определения N-концевой аминокислотной последовательности пептиды В-П-І и В-Ш-І образовались с небольшим выходом в результате неполного расщепления связей Met-їЬг и Met-Ser и являются суммами фрагментов В-ІУ-2 и В-Ш-2, В У и В-ІУ-І соответственно. Как отмечалось ранее, автоматической деградацией молекулы озер была установлена последовательность 33 аминокислотных остатков. Определение частичной аминокислотной последовательности пептида В-П-2 показало, что он является И концевым в молекуле белка. Для определения полной аминокислотной последовательности пептид В-П-2 был подвергнут гидролизу протеиназой V8. Разделение гидролизата осуществлялось при помощи ВЭШХ на колонке с обращенной фазой SilasогЪ С18 (рис. 18). Аминокислотный состав и N -концевые аминокислоты выделенных пептидов представлены в таблице 8. Пептиды BS-III и BS-ІІ образовались в результате неспецифического расщепления связи Ser-Ala (24-25) протеиназой V8 . Результаты определения аминокислотной последовательности пептидов BS-І и BS-V в совокупности с данными по структуре трип-тических пептидов Т-У-І и T-XI-4 позволили завершить установление строения фрагмента В-Д-2 : Полученные данные позволили завершить установление структуры триптического пептида Т-У-2-2, определить С-конце-вую последовательность фрагмента В-Ш-2 и частичную структуру бромцианового пептида Вх. Пептид Вх содержался во фракции І.
Как уже указывалось выше, разделить на индивидуальные компоненты эту фракцию эксклюзионной хроматографией и ВЭЖХ не удалось. Идентификация пептида Вх была затруднена из-за неполноты расщепления бромцианом связей в последовательности Met-Met-Ser , приводящей к гетерогенности IT -концевой области пептида. Пептиды В-ІУ-І, В-У, В-УІ-І и В-УІ-2 содержали от трех до тринадцати аминокислотных остатков, их структура была установлена по методу Эдмана с идентификацией аминокислот в виде DBS- и РТН-производных (табл. 9). Сравнительный анализ структуры бромциановых пептидов, приведенных в таблице 9, и соответствующих метионин-содержа-щих триптических пептидов позволил объединить в один блок Таким образом, с помощью гельфильтрации и ВЭЖХ на обращенной фазе выделено в индивидуальном состоянии 9 из 10 образовавшихся фрагментов бромцианового расщепления молекулы OSCP . Информация о частичной структуре десятого- бромцианового пептида (Вх) была получена в результате расщепления сукцинилиро- ванного препарата белка по связи Asn-Gly и последующего структурного анализа образовавшихся фрагментов. На рисунке 19 представлен порядок расположения бромциа-новых пептидов, позволивший представить "архитектуру" моле-, кулы белка в целом. При этом найдены перекрытия для 16 триптических пептидов в N -концевом блоке и восьми - в С-концевой части молекулы. В общей сложности в 2 блока было объединено 172 аминокислотных остатка, составляющих большую часть молекулы OSCP. Проведенное исследование триптических и бромциановых пептидов внесло существенный вклад в решение основной задачи - расшифровку полной аминокислотной последовательности OSCP-белка, придающего Е -АТР-азному комплексу чувствительность к олигомицину.
Похожие диссертации на Изучение структуры протонной аденозинтрифосфатазы митохондрий. Триптические и бромциановые пептиды OSCP-белка
