Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы
1. Флуоресцентные метки для анализа моно- и олигосахаридов
2. Общие представления о микрочипах
2 Экспериментальная часть
1 Оборудование и реактивы
2 Методы
3 Результаты и их обсуждение
1. Бифункциональные флуоресцентные метки
2. Выбор метода отщепления олигосахаридов.
3. Установление структуры Fmoc-Gly-олигосахаридов, выделенных из IgG и 4.2АР как бифункциональная флуоресцентная метка
5. Гликочип
6. Оптимизация иммуноферментного анализа
7. Сравнение трех «платформ» для изучения углеводсвязывающих белков Заключение
Выводы
- Общие представления о микрочипах
- Методы
- Выбор метода отщепления олигосахаридов.
- Оптимизация иммуноферментного анализа
Введение к работе
Обзор литературы
Общие представления о микрочипах
Микрочип - это устройство, на котором размещено множество веществ (лигандов), с помощью которых анализируются различные биологические жидкости. На небольшой площади чипа размещяют сотни и более нуклеотидов, антител и т.п. Например, существует технология, которая позволяет расположить на 1 см подложки более 6000 нуклеотидов (технология GenPak, Дания). Высокая плотность размещения лигандов на поверхности позволяет проводить одновременный анализ множества биологических аналитов в небольшом объеме образца. Информация о взаимодействиях обычно считывается с помощью флуоресцентного ридера. Большинство предлагаемых чипов являются двумерными (2D), элементы которых представляют собой лиганды, химически или сорбционно закрепленные на специально обработанной стеклянной или другой поверхности. Существуют микрочипы на основе трехмерных гидрогелей (3D), в которых лиганды равномерно распределены по всему объему капли геля, и в тоже время находятся на удаленном расстоянии друг от друга [72]. Первыми были разработаны ДНК-микрочипы, лигандами здесь являются молекулы ДНК или олигонуклеотидов [73]. ДНК-чипы используют для решения таких задач, как идентификации генов, изучения профиля генной экспрессии (для классификации раковых клеток при лейкемии, раке молочной железы, меланоме), изучения функций генов, при создании новых лекарств и т.д. [74]. Белковые чипы появились почти сразу за ДНК-чипами. В качестве лигандов здесь используются как целые белковые молекулы, так и пептиды. Область применения белковых микрочипов на сегодняшний день очень широка. Это изучение белок-белковых, белок-лигандных, пептид-лигандных и др. взаимодействий, изучение активности ферментов, поиск новых субстратов и многое другое [75]. Гликочипы (т.е. микрочипы с иммобилизованными олиго- и полисахаридами, гликоконъюгатами) появились относительно недавно, уже после начала выполнения данной диссертационной работы. Технология изготовления гликочипов активно развивается [76, 77], в том числе лабораторией углеводов, ИБХ РАН. На сегодняшний день предложено несколько способов нанесения лигандов, как основанных на ранее известных ДНК и белковых технологиях, так и совершенно новых.
Спектр углеводных лигандов и области использования углеводных микрочипов неуклонно расширяется [78]. Углеводные лиганды могут быть иммобилизованы на чипе в самом виде спейсерированных синтетических и природных олигосахаридов, полисахаридов, протеогликанов, неогликопротеинов и неогликолипидов. В зависимости от свойств используемого лиганда используют и различные типы иммобилизации. Для крупных молекул, таких как протеогликаны, неогликопротеины и полисахариды можно использовать физическую адсорбцию [79], либо иммобилизацию на подложке, содержащей фотореактивные группы (арил-трифторметил-диазирин) [80]. Неогликолипиды иммобилизуют также физической сорбцией [81]. Для иммобилизации низкомолекулярных лигандов применяют химические способы, в частности, спейсерированные олигосахариды, содержащие амино- и тиольную группы, иммобилизуют на поверхностях, активированных N-гидроксисукцинимидом или малеимидом [76, 82]. Если на поверхности чипа сначала иммобилизовать стрептавидин, то в качестве лигандов можно использовать биотинилированные олигосахариды или гликоконъюгаты [83]. Изучение углевод-белковых взаимодействий — одно из самых распространенных применений гликочипов. Результатом такого изучения является определение специфичности пектинов, антител, поиск специфических ингибиторов гликозидаз, определение углеводов, участвующих в процессах адгезии клеток. При помощи гликочипов уже начинают изучаются клеточные рецепторы непосредственно на поверхности клетки [1,84]. В работе использовали следующие растворители и реагенты: ЫаНСОз, Na2C03, NaOAc, NaH2P04, Na2HP04, цитрат натрия, Na2S04, СаС12, NaOH, концентрированный аммиак, «Диа-М», Россия; NH4HCO3, NaBHsCN, ВНз-пиридиновый комплекс, Pd-чернь, о-фенилендиамин, 4-ДМП, п-нитрофениловый эфир биотинилкапроновой кислоты, пиперидин, этаноламин, метакриламид, Щ-метиленбисакриламид, Темед, БСА, нейраминидаза из Vibrio cholerae, «Sigma», США; Rh-наночастицы любезно предоставлены А. Россо (Национальная химическая школа, Репе, Франция); PNG-аза F «Bio Labs», США; 2,5-дигидроксибензойная кислота, N-гидроксисукцинимид, Et3N, N-(9-флуоренилметиоксикарбонил)глицин, М-(2-пиридил)-аминоуксусная кислота, гидразин гидрат, диэтиловый эфир 2,6-дигирокситерефталевой кислоты, п-толуолсульфохлорид, тримезиновая кислота, трихлорангидрид тримезиновой кислоты, Tween-20, «Fluka», Швейцария; п-феноксазонфениламин, п-феноксазонфенилметилбромид любезно предоставлены А.А. Формановским (ИБХ РАН) трифторуксусный ангидрид, уксусный ангидрид, трифторуксусная кислота, уксусная кислота, ацетилхлорид, бензальдегид, «Acros», США; [ Н]-лейцин, «ПСН», США; гидразид 7-диэтиламинокумарин-З-карбоновой кислоты, «Molecular Probes», США; Bind Silane, «Amersham Pharmacia Biosciences», США; пиридин, толуол, этилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ ацетонитрил, метанол, этанол, «Реахим», Россия; DMF, DMSO, «Merck», Германия; 110S, 110S-NHCOCH2NH2 Btri-OCH2CH2NH2, Atri-OCH2CH2NH2, 90S, 90S-NHCOCH2NH2, Galal-6Glcpl-NHCOCH2NH2, изомальтооктаоза, pNPA, pNSA, В -РАА30, содержащий 20% тої Вй, «Lectinity», Россия; 110S-2AP, «Glyence», Япония; АГП, НПЦ «Биоген», Россия; IgG человека, «LFB», Франция; человеческие антитела, узнающие Galal-6Glc любезно предоставлены П.
Обуховой, ИБХ РАН, Россия; мышиные моноклональные антитела против иммуноглобулинов человека, «Southern Biotech», США; антитела против иммуноглобулинов мышей и человека, меченые пероксидазой, Су5 и биотином, стрептавидин, меченый пероксидазой, галактозидаза Bovine testes, «Boehringer-Manheim», Германия; антитела против иммуноглобулинов человека, меченые стрептавидином и Texas Red, стрептавидин, меченый А1еха555, «Pierce», США; сыворотки крови от здорового донора (группа крови О) и от больного раком молочной железы (группа крови А) любезно предоставлены Маргарет Хуфлейт (Гликомедицинский исследовательский институт, Ла Хойя, США); биотинилированные лектины из Aleuria aurantia, Erythrina cristgalli и Ricinus communis, «Vector Laboratories», США; сцинцилляторная жидкость "Universal coctail", «ISN Radiochemicals», Швеция. 1.2. Сорбенты, ТСХ-пластинки Для гель-фильтрации использовали Sephadex G-10, G-15, LH-20, «Pharmacia Biotech», Австрия. Ионообменную хроматографию осуществляли на Dowex 50Wx2-200, «Acros», США; ТСХ проводили на пластинках с силикагелем или с оксидом алюминия, «Merck», Германия; Разделение реакционных смесей проводили на Cig-патронах, «Диа-Пак», Россия и бумаге ЗММ, «Whatman», Англия. 1.3. Модули для иммуноферментного анализа, стекла Для конструирования чипов использовали N-гидроксисукцинимид-активировашіьіе стекла, «Schott Nexterion», Германия; стекла Corning 2947, обработанные BindSilane; аминированные стекла, «Corning», США. Для иммуноферментного анализа использовали 96-луночные планшеты MaxiSorp, «Nunc», Дания; 8-луночные аминированные модули, «Costar», США. 1.4. Оборудование Использовали хроматографы, снабженные УФ-детектором, «Beckman System Gold», США, «Gilson», США и флуориметром «Varian», США. Принт чипов осуществляли с помощью принт-робота «Qarray Genetix», Англия; принт-робота Microarray technology, «Array IT» (США); визуализацию флуоресцентных сигналов на чипах проводили с помощью флуоресцентного микроскопа ImaGel (ИМБ РАН, Россия) и сканера для слайдов ScanArray 5000, «PerkinElmer», США. Контроль разделения олигосахаридов при гель-фильтрации осуществляли на рефрактометре «Waters», США; радиоактивность измеряли на счетчике «Beckman LS6000SC», США. Масс-спектры снимали на времяпролетном масс-спектрометре «Ultraflex П Bruker», Германия, оснащенном УФ лазером (Nd). Н-ЯМР спектры записывали на спектрометре «Bruker» 500 Гц.
Методы
В колбу помещали 5 г (24 ммоль) п-феноксазонфениламина, 3.0 г (36 ммоль) метилового эфира хлоруксусной кислоты и 1.4 г (36 ммоль) гидроксида натрия, прибавляли 30 мл воды, перемешивали 3 ч, поддерживая значение рН не ниже 7 добавлением щелочи. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол 100:1. По окончании процесса реакционную смесь отфильтровывали через стеклянный фильтр, подкисляли соляной кислотой до рН 2.0, выдерживали 0.5 ч при комнатной температуре и отфильтровывали получившийся осадок. Высушивали на масляном насосе в течение ночи. Затем растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 2 мл (37 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 2.5 суток. Контроль реакции осуществляли методом ТСХ в метаноле. Пластинки проявляли под УФ-светом. По окончании реакционную смесь упаривали досуха на роторном испарителе, соупаривали с толуолом, 3x20 мл, и перекристаллизовывали из метанола. Выход моногидразида - 65%, Тпл 228С. Характеристические сигналы Н-ЯМР-спектра (DMSO-D6), ppm: 3.75 (2Н, дублет, -СН2-), 7.8 (Ш, триплет, ароматический -NH-), 9.16 (1Н, синглет, гидразидный -NH-), сигналы: 6.73 и 8.22 (дублеты), 7.4 и 7.9 (мультиплет и дублет) отнесены к ароматическим протонам (8Н). 2. Синтез бимодальных флуоресцентных меток 2.1. Дигидразид N-пиридилиминодиуксусной кислоты 1 г (6 ммоль) метилового эфира N-пиридиламиноуксусной кислоты растворяли в 5 мл дихлорэтана и прибавляли по каплям 0.4 мл BF3 Et20, охлаждали реакционную смесь до 0С. Затем при перемешивании по каплям прибавляли раствор 0.76 г (7 ммоль) диазоуксусного эфира в дихлорэтане, перемешивали при 0С в течение 10 мин до окончания вьщеления газа, затем еще 1 ч при комнатной температуре. Через 1 ч к реакционной смеси прибавляли 5 мл насыщенного раствора гидрокарбоната аммония, после чего отделяли органическую фазу и высушивали ее над сульфатом натрия. Согласно данным ТСХ (на силикагеле в этилацетате) в смеси присутствовали только исходные соединения. 2.2. Дигидразид М-Сп-феноксазонфенилУиминодиуксусной кислоты В колбу помещали 5 г (24 ммоль) п-феноксазонфениламина, 5.7 г (60 ммоль) метилового эфира хлоруксусной кислоты и 2.4 г (60 ммоль) гидроксида натрия, прибавляли 30 мл воды перемешивали в течение 3 ч, поддерживая значение рН не ниже 7 добавлением щелочи. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе хлороформ-метанол 100:1.
По окончании процесса реакционную смесь отфильтровывали через стеклянный фильтр, подкисляли соляной кислотой до рН 2.0 и выдерживали 0.5 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывали. Высушивали в вакууме в течение ночи. Затем растворяли в 50 мл метанола, прибавляли 2 мл (37 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 2.5 суток. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на AI2O3 в метаноле. По окончании процесса реакционную смесь упаривали досуха на роторном испарителе, соупаривали 3x20 мл толуола, и перекристаллизовывали из метанола. Согласно данным Н-ЯМР, в ходе синтеза был получен ранее охарактеризованный моногидразид (см. выше) с выходом 65%. 2.3. Дигидразид 1Ч-(п-феноксазон-п-фенилметил)-иминодиуксусной кислоты В колбу с обратным холодильником помещали 2.88 г (10 ммоль) п-феноксазонфенилметилбромида, прибавляли 3.95 г (20 ммоль) диметилового эфира иминодиуксусной кислоты, 4.14 г (30 ммоль) карбоната калия и растворяли в 50 мл DMF. Нагревали и кипятили в течение 3 ч, контроль реакции осуществляли по ТСХ на оксиде алюминия в хлороформе. По окончании реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, вливали в нее 300 мл воды и экстрагировали 3x50 мл хлороформа. Экстракты объединяли, промывали 3x100 мл воды и насыщенным раствором хлорида натрия и высушивали над сульфатом натрия. Упаривали на роторном испарителе и наносили на колонку, заполненную силикагелем (3x25 см). Элюировали смесью хлороформ-метанол, 100:1. Фракции, содержащие продукт (контроль по ТСХ на силикагеле в той же системе растворителей), объединяли и упаривали. Перерастворяли в 100 мл метанола, прибавляли 2 мл гидразингидрата (37 ммоль) и выдерживали 2.5 суток при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси хлороформ-метанол, 100:1. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе, соупаривали с толуолом, 3x20 мл, и перекристаллизовывали из метанола. Выход дигидразида - 82%, Тпл 200С. Характеристические сигналы Н-ЯМР- спектра (D6-DMSO), ррт: 3.73 (2Н, синглет, -СН2-), 3.12 (2Н, синглет, -NCH2CO), область 7.23-8.27 (мультиплеты) - ароматические протоны (8Н), 9.24 (1Н, синглет, -NH-), 4.18 (2Н, дублет, NH2). 2.4. Дигидразид (7-диэтиламинокумарин-3-карбонил)гидразида тримезиновой кислоты К 330 мг (2.9 ммоль) N-гидроксисукцинимида прибавляли 1 мл трифторуксусного ангидрида и перемешивали при комнатной температуре 3 ч. Упаривали в вакууме и высушивали в течение 1.5 ч. В эту же колбу прибавляли 100 мг (0.48 ммоль) тримезиновой кислоты в 2 мл абсолютного пиридина и перемешивали в течение 1.5 ч при комнатной температуре. Контроль протекания реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в сиситеме хлороформ:изопропанол 20:1. По окончании реакции приливали 15 мл охлажденной 2 М соляной кислоты, полученный трис-сукцинимидный эфир тримезиновой кислоты отфильтровывали, промывали водой, сушили в вакууме и использовали далее. Выход - 74% (Rf = 0.38, хлороформ:изопропанол 20:1). Характеристические сигналы Н-ЯМР-спектра (CDCI3), ррт: 2.94 (4Н, синглет, -СО-СНг- СНг-СО-), 9.14 (ЗН, синглет, ароматические протоны). К раствору 10 мг (36 мкмоль) гидразида 7-диэтиламинокумарин-З-карбоновой кислоты в 1 мл DMF приливали при перемешивании раствор 54 мг (ПО мкмоль) три- сукцинимидного эфира тримезиновой кислоты (см. выше) в 0.75 мл DMF и перемешивали 15 мин при комнатной температуре. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси хлороформ-изопропанол 20:1. ТСХ показала наличие исходных веществ и ряда побочных продуктов их разложения. 2.5.
Синтез дигидразида2.5-дигидрокситерефталевой кислоты 500 мг (2 ммоль) диэтилового эфира 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты растворяли в 30 мл метанола при 100С при кипячении с обратным холодильником, затем прикапывали при перемешивании 0.6 мл (12 ммоль) гидразингидрата и выдерживали сутки при 100С с обратным холодильником. Контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в смеси толуол:этилацетат 100:1. По окончании реакции (судили по исчезновению исходного эфира) оставляли реакционную смесь при 4С на ночь для кристаллизации, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали последовательно водой и этанолом, высушивали. Выход - 95% (Rf = 0.60 (изопропанол:этилацетат:вода 2:3:1)). Тт 134С. Характеристические сигналы !Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ррт: 7.47 (2Н, синглет, ароматические протоны), 9.85 (1Н, синглет, -NH-). 2.6. Синтез дигидразида 2.5-диметокситерефталевой кислоты 400 мг (1.6 ммоль) диэтилового эфира 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты растворяли в хлороформе, приливали по каплям 670 мг (16 ммоль) раствора диазометана в диэтиловом эфире и перемешивали 10 мин. Прибавляли по каплям 100 мкл безводной уксусной кислоты до прекращения выделения азота и упаривали в вакууме. 300 мг (1 ммоль) полученного вещества растворяли в 30 мл метанола при 100С при кипячении с обратным холодильником, затем прикапывали при перемешивании 0.29 мл (6 ммоль) гидразингидрата и выдерживали 3 суток при 60С. Охлаждали до 4С и оставляли реакционную смесь для кристаллизации, осадок отфильтровывали, промывали последовательно водой и метанолом, высушивали. Выход - 80%. Тпл 135С. Характеристические сигналы Н-ЯМР-спектра (D6-DMSO), ppm: 3.88 (6Н, синглет, протоны метоксигрупп), 7.48 (2Н, синглет, ароматические протоны), 9.56 (Ш, синглет, - NH-). 2.7. Сукцинимидный эфир N-f9-флуоренилметоксикарбонил)глицина (Fmoc-Gly-SI) К 150 мг (1.3 ммоль) N-гидроксисукцинимида прибавляли 0.5 мл трифторуксусного ангидрида и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Упаривали досуха в вакууме. Прибавляли 100 мг Fmoc-Gly (0.34 ммоль) и растворяли в 2 мл сухого пиридина, перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, контроль реакции осуществляли с помощью ТСХ на силикагеле в системе толуол-этилацетат 2:1. Упаривали реакционную смесь на роторном испарителе, соупаривали с 50 мл толуола.
Выбор метода отщепления олигосахаридов.
В выбранном подходе необходимой стадией является получение олигосахаридов в виде гликозиламинов. Мы проверили все подходящие варианты, чтобы выбрать наиболее удобный. В качестве основного модельного объекта нами был выбран человеческий aj-кислый гликопротеин (АГП), который имеет 5 сайтов гликозилирования и для которого известна высокая степень гетерогенности - от простых двухантеиных, до четырехантенных полилактозаминового типа, мопо- и ди-фукозилированных, большинство из которых сиалировано [28, 97-101]. Содержание углеводов в АГП составляет около 45% (по массе) [102]. В нашей работе мы использовали десиалилированный АГП (аАГП), чтобы упростить олигосахаридный профиль. Основные десиалилированные структуры человеческого АГП известны по литературе [28, 97-101], рис. 3: Полученные из аАГП гликозиламины, после удаления остатков бикарбоната аммония лиофилизацией (чтобы избежать взаимодействия Fmoc-Gly-SI с аммиаком), превращали во Fmoc-Gly-производные в найденных (см. выше) условиях. Разделение Fmoc-Gly-меченых олигосахаридов проводили на Сі8-колонке, используя градиент ацетонитрила в воде. Был получен следующий хроматографический профиль (рис. 4 а). Суммарный выход меченых олигосахаридов составил около 50%, т.е. из 1 мг аАГП было вьщелено около 150 мкг меченых олигосахаридов ( 60нмоль). Олигосахариды фракции № 12 дополнительно разделяли на амино-фазной колонке. 2.2. Отщепление олигосахаридов карбонатом аммония Относительно недавно был предложен метод отщепления олигосахаридов насыщенным раствором карбонатом аммония в концентрированном аммиаке [86]. Метод был разработан для отщепления О-цепей, но, согласно данным авторов статьи, предложенные условия также подходят и для отщепления N-цепей, при этом продуктом реакции являются необходимые нам гликозиламины, т.е. при такой схеме их нет необходимости получать специально (схема 12). Привлекательна также легкость удаления реагентов (аммиак, карбонат аммония) путем упаривания и лиофилизации, что позволяет избежать ряда стадий очистки реакционной смеси от солей. 2.2.1. Отщепление олигосахаридов от IgG человека Поскольку в цитируемой выше статье не были приведены количественные данные отщепления, а метод представляется нам весьма привлекательным, то было необходимо проверить его эффективность.
Это было сделано на примере отщепления N-цепей IgG человека. Содержание углеводов в IgG человека составляет около 2.5% (по массе). Таким образом, в описанных в [86] условиях реакция отщепления действительно идет, но отщепляется только 13% от общего количества олигосахаридов (2.6 мкг, т.е. 1.3 нмоль из 1 мг IgG), поэтому необходима оптимизация процесса отщепления. Оптимизацию процесса отщепления проводили на примере аАГП. 2.2.2. Отщепление олигосахаридов от аАГП человека Для увеличения эффективности отщепления повышали температуру и увеличивали длительность проведения реакции. Максимальный выход составил 14% (42 мкг,т.е. 17нмоль из 1 мг аАГП) при проведении реакции в течение 3 сут. при 65 С (хроматограмма представлена на рис. 46). Дальнейшее увеличение времени проведения реакции и температуры практически не изменило эффективности отщепления, однако, по всей видимости, привело к образованию пептидов, а затем соответствующих Fmoc-GIy-производных пептидов, которые не полностью удалялись после очистки и осложняли разделение олигосахаридов. Пептид-К-гликозидаза F (PNGase F) является гликоамидазой, т.е. расщепляет амидную связь между остатком GlcNAc и аспарагином, при этом олигосахарид освобождается в виде гликозиламина, который далее медленно гидролизуется в восстанавливающий сахарид [107]. Привлекательность подхода состоит в том, что можно использовать полученные в ходе отщепления гликозиламины для превращения в Fmoc-Gly-производные сразу же после отщепления, in situ. Оптимальным значением рН для PNG-азы F является 7.5-8.5 [108], поэтому представлялось возможным сохранить образующиеся гликозиламины и использовать их для мечения с помощью Fmoc-Gly-SI. Для того, чтобы совместить отщепление гликозиламинов PNG-азой F и Fmoc-Gly-мечение, использовали в качестве растворителя летучие буферные смеси, а именно раствор бикарбоната аммония, либо Et3N-AcOH буферный раствор. Отщепление олигосахаридов от аАГП проводили в нативных условиях, т.е. в отсутствие денатурирующих условий, варьируя количество фермента. Максимальный выход Fmoc-Gly-меченых олигосахаридов, 50% (150 мкг (-60 нмоль) из 1 мг аАГП), наблюдался в следующих условиях: 100 мМ Et3N-AcOH (рН 7.3), 5-Ю U PNG-азы F, 2 ч при 37С. Соответствующий хроматографический профиль разделения олигосахаридов (в виде Fmoc-Gly-производных) представлен на рис. 4в. Подобранные условия удобны тем, что мечение проводится сразу же по окончании реакции отщепления. Это позволяет существенно сократить время проведения анализа. Сравнение профилей (рис. 4) позволяет заключить, что наибольшее разнообразие и максимальный выход олигосахаридов дает гидразинолиз; эффективность отщепления карбонатом аммония была заметно ниже, а ферментативное отщепление хоть и методически удобно, но уступает гидразинолизу в отношении разнообразия полученных олигосахаридов (рис. 4), иначе говоря, фермент отщепляет не все углеводные цепи или отщепляет их с разной эффективностью.
Для установления структуры олигосахаридов, отщепленных от IgG с помощью карбоната аммония, применяли масс-спектрометрию. Идентифицированы четыре типа двухантенных фукозилированных цепей: моногалактозилированные (№ 6, рис. 5), дигалактозилировапные (№ 8), агалакто (№ 5) и агалакто с бисектным остатком GlcNAc (№ 15). Полученные результаты согласуются с литературными данными, когда углеводные цепи отщепляли другими методами [104-106]. Поскольку наибольшее разнообразие отщепленных от аАГП олигосахаридов наблюдали в случае гидразинолиза, то структуру определяли только для фракций № 8-14, полученных после Fmoc-Gly-мечения и последующего ВЭЖХ-разделения (рис. 4а). Для этого использовали масс-спектрометрический анализ в сочетании с экзогликозидазным отщеплением терминальных моносахаридов, т.е. Fmoc-Gly-меченые олигосахариды анализировали до и после обработки Р-галактозидазой. Предполагаемые структуры олигосахаридов (в задачу данного исследования не входило установление полной структуры всех олигосахаридов) приведены в табл. 6. Соотношение четырех-/трех-/двухантенных олигосахаридов составляет 55:34:11, что согласуется с литературными данным [28, 97, 98]. Кроме того, полученные данные позволяют предположить наличие в АГП нового, трифукозилировапного олигосахарида №11а (табл. 6). После выделения и идентификации олигосахариды превращали в глицильные производные. Для этого Fmoc-группу отщепляли пиперидином (схема 10) в условиях, подобранных на примере 11 OS: 1 ч при комнатной температуре в смеси DMF-вода- пиперидин 5:7:2 (по объему). Полученные глицильные производные использовали далее для иммобилизации на 20-гликочипе. 2-аминопиридин - наиболее популярная и широко используемая в структурном анализе олигосахаридов метка. С ее помощью получены углеводные карты многих гликопротеинов, на которых зафиксированы времена удерживания и/или относительные миграционные индексы 2АР-меченых олигосахаридов, разделенных разными способами (ВЭЖХ на колонках с различными сорбентами, высокоэффективным КЭ) (см. гл. 1 литературного обзора); определять структуру ОС в виде 2АР-производных, опираясь на эти данные значительно проще. Кроме того, большое количество 2АР-меченых олигосахаридов коммерчески доступны, т.е. при наличии метода иммобилизации их можно было бы использовать непосредственно для конструирования чипов. Следует отметить также, что благодаря минимальному размеру и низкой гидрофобности, эта метка особенно привлекательна с точки зрения последующего изучения углевод-связывающих белков.
Оптимизация иммуноферментного анализа
Несмотря на интенсивное развитие исследований с использованием чипов, изучение углевод-белкового взаимодействия с помощью классического твердофазного метода анализа (ИФА) в 96- или 384-луночных планшетах по-прежнему остается актуальным. Этот метод прост, хорошо воспроизводим, дает высокое соотношение сигнал/шум; кроме того, широкий круг неогликоконъюгатов, используемых для адсорбции на планшет, доступен коммерчески. Для проведения ИФА используется рутинное оборудование, в то время как оборудование для чипной технологии на два порядка дороже. Недостатком ИФА является довольно большой расход гликоконъюгата, около 0.1 мг ( 100 нмоль углеводов на планшет, или 1 нмоль в лунку). Нет сомнений, что снижение расхода олигосахаридов на 1-2 порядка величины могло бы значительно расширить репертуар используемых олигосахаридов, и, соответственно, круг решаемых задач. Поскольку необходимой стадией в иммуноферментном анализе является физическая адсорбция углеводных (Glyc) антигенов- конъюгатов Glyc-BSA или Glyc-PAA- на поверхности полистироловых (или полихлорвиниловых) планшетов, то представляется очевидным использовать два пути решения этой задачи: 1. Химическая иммобилизация олигосахаридов в составе полимерного конъюгата на полистирольный планшет, имеющий на своей поверхности реакционноспособные группы, в частнсти, аминогруппы. Химическая иммобилизация привлекательна тем, что потенциально позволяет избежать потерь углевода и, тем самым, снизить количество расходуемого конъюгата, конечно, при условии, что выбранная химическая реакция проходит с высоким выходом в разбавленных растворах. Эту проблему в принципе могли бы решить полимерные конъюгаты, несущие не только множество копий углеводного лиганда, но и множество копий активных для иммобилизации групп в составе одной молекулы. Такому конъюгату достаточно присоединиться к поверхности одной ковалентной связью - это приведет к иммобилизации сразу многих десятков или даже сотен (в зависимости от молекулярной массы) углеводных лигандов (рис. 12). Физическая сорбция полиакрилового конъюгата, имеющего размеры, заведомо достаточные для многоточечного взаимодействия с поверхностью пластика.
Есть еще одна причина привлекательности высокомолекулярных гликоконъюгатов, в частности, при изучении специфичности антител. Известно, что расстояние между Fab-фрагментами антитела лежит, как правило, в интервале 100-150 А, а обычно ближе к 150 А [112]. Это значит, что антитело неспособно связываться с одной молекулой гликоконъюгата двухвалентно (если это IgG) или более валентно (IgM), когда размер гликоконъюгата не превышает 100 А Таким образом, можно кардинально улучшить связывание антител с гликоконъюгатом за счет мультивалентности, если синтезировать конъюгат заведомо больших, чем 150 А, размеров. 6.1. Сравнение физической сорбции и химической иммобилизации гликоконъюгатов Для проверки сформулированных выше предположений были синтезированы полимерные гликоконъюгаты двух типов (рис. 13): реакционно-способные, для ковалентной иммобилизации (X - активная группа), и «инертные» (где X - это NHCH2CH2OH). "Ч гД гА Glyc-NH X х Рис. 13. Структура полиакриловых гликоконъюгатов. В качестве углеводной компоненты (Glyc) использовали спейсерированный В , т.е. Galccl-3(Fucocl-2)Gal. Оба типа полимеров были синтезированы в виде высоко- (2000 кДа) и низкомолекулярного (30 кДа) конъюгатов. Отметим, что обычно в ИФА используют гликоконъюгаты с относительно низкой молекулярной массой 30 кДа. Химическую иммобилизацию гликоконьюгатов изучали с использованием полимерных конъюгатов с молекулярной массой 30 кДа и 2000 кДа. Оба полимера содержали 20 мол.% углеводов, остальные 80% карбоксильных групп были активированы п-нитрофенолом или N-гидроксисукцинимидом (рис. 13). Иммобилизацию проводили на ИНг-полистироле, содержащем, согласно данным производителя, 2 1013 аминогрупп/см2, реакцию проводили в DMSO. По окончании реакции (24 ч при комнатной температуре) непрореагировавшие активированные группы замещали водным аммиаком или 2-этаноламином, т.е. конечные химически иммобилизованные полимеры являются замещенными полиакриламидами. Оказалось, что активированные гликоконыогаты можно иммобилизовать в широком интервале концентраций, 3-200 нг полимера в лунку (2-150 пмольВы). 6.1.2. Физическая адсорбиия Btr-PAA30 и В1гГРААто на полистироле Физическую адсорбцию гликоконьюгатов изучали с использованием «инертных» конъюгатов с молекулярной массой 30 кДа (В -РАА30) и 2000 кДа (В -РАА2000). Мы провели оптимизацию условий адсорбции на модифицированном полистироле (обычно в виде 96-луночных планшетов, объем лунки - 200 мкл). Изучали влияние следующих факторов на степень адсорбции полимера: длительности процесса, температуры инкубации, значения рН и ионной силы буферного раствора. Для Btrj-РАА30 оптимальными и в тоже время практически удобными условиями были: 1 ч при 37С или 16 час при 4С в карбонатном буферном растворе. Обычно используемый интервал концентраций полиакриламидных гликоконьюгатов составляет 1 - 10 мкг/мл, оптимальная концентрация подбирается в зависимости от аффинности связывающихся антител или лектинов и марки пластика. В случае В -РАА30 приемлемой оказалась величина 5 - 10 мкг/мл (4-8 нмоль В[г/мл). Понижение концентрации гликоконъюгата ниже 1 мкг/мл снижает чувствительность определения, и компенсировать это снижение увеличением времени адсорбции не удается. Для физической адсорбции высокомолекулярного конъюгата Btri-PAA2000 оптимальными условиями инкубирования были: 24 ч при комнатной температуре и концентрация 0.5 мкг/мл (0.4 нмоль Вщ/мл).
Дальнейшее увеличение времени инкубации лишь незначительно увеличивало адсорбцию. 6.1.3. Сравнение физической сорбции и химической иммобилизаиии гликоконъюгатов В оптимизированных (см. выше) условиях была изучена зависимость оптической плотности в ИФА от концентрации физически адсорбированного или химически иммобилизованного конъюгата (рис. 14, табл. 7). Оказалось, что в случае низкомолекулярных полимеров химическая иммобилизация дает существенный выигрыш в расходе конъюгата по сравнению с физической адсорбцией. В случае высокомолекулярных полимеров эти два способа иммобилизации оказались сопоставимы (рис. 14, табл. 7). Следует, однако, отметить высокий фон аминированного полистирола (т.е. величину оптической плотности в лунках, не содержащих антигена), от которого не удается избавиться ни использованием "блокирующих" агентов (BSA, желатин, твин), ни химической модификацией с помощью уксусного ангидрида. Поэтому химическая иммобилизация гликокоиъюгатов на аминированном полистироле в дальнейшем не использовалась. В случае физической адсорбции, при стандартной концентрации гликоконъюгата (5-Ю мкг/мл, 4-8 нмоль Btri/мл) низкомолекулярный и высокомолекулярный варианты мало отличались, давая практически одинаковую величину OD при связывании с антителами. Однако при уменьшении количества иммобилизуемого Btrj-PAA величина OD резко падала, в то время как в случае высокомолекулярного полимера падение сигнала начиналось только при уменьшении его концентрации на порядок (рис. 14). Если сравнивать область малых концентраций, то несомненными преимуществами обладает физически адсорбированный Btri-PAA: его количество, дающее в ИФА приемлемое соотношение сигнал/фон, в 10 раз меньше, чем при использовании ЗОкДа конъюгата; в величинах концентраций, раствор с концентрацией 0.5 мкг/мл высокомолекулярного полимера эквивалентен раствору 5 мкг/мл низкомолекулярного (табл. 7). Однако, оставалось неясным, достигнут ли с помощью РАА2000 предел снижения расхода гликоконъюгата, иными словами, необходимо было знать, какая часть взятого гликоконъюгата адсорбируется на поверхность, а какая остается в растворе. 6.1.4. Измерение абсолютной величины физически адсорбированного гликоконъюгата. Чтобы выяснить, какая часть гликоконъюгата растворенного и внесенного в лунку планшета, реально сорбируется на пластике, а какая часть фактически выбрасывается после окончания процедуры, были синтезированы радиоактивно-меченые В гРАА и Btri-PAA , содержащие в своем составе тритий-меченый лейцин. Измерялась радиоактивность не только твердой фазы, но и растворов до и после адсорбции, что позволило с уверенностью говорить об абсолютном количестве адсорбировавшегося вещества.
