Введение к работе
Актуальность проблемы. На концах линейных хромосом эукариотических организмов находятся особые ДНК-белковые структуры, называемые теломерами. Теломерная ДНК состоит из повторяющихся нуклеотидных последовательностей и заканчивается 3'-выступающим одноцепочечным участком. При каждом клеточном делении в результате недорепликации происходит укорочение теломер. При достижении теломерами некоторой критичной длины клетка вовсе перестает делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, для которых природой предусмотрен неограниченный потенциал деления, например в одноклеточных организмах или в половых и раковых клетках существует механизм поддержания стабильности длины теломер, в основу которого положен синтез теломерной ДНК с помощью специального фермента теломеразы. Теломераза - сложный РНК-белковый комплекс, который состоит из молекулы РНК, обратной транскриптазы и ряда других белковых компонентов. Неослабевающий интерес к изучению теломеразного комплекса связан, в первую очередь, с перспективой лечения онкологических заболеваний путем ингибирования теломеразной активности и восстановления механизма контроля числа клеточных делений у раковых клеток.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являющиеся одноклеточными эукариотами, представляют собой очень удобную модельную систему для изучения теломеразы. Теломеразный комплекс этих дрожжей состоит из РНК TLC1, включающую в себя матричный участок для синтеза теломерных повторов, и, по крайне мере, трех важных белковых компонентов - Estlp, Est2p и Est3p. Обратная транскриптаза Est2p в комплексе с TLC1 способна удлинять теломероподобный ДНК-олигонуклеотид (праймер) in vitro. Белок Estlp считается ответственным за прикрепление теломеразы к теломере и активацию фермента в S-фазе клеточного цикла. Про Est3p можно с уверенностью утверждать, что он является компонентом теломеразного комплекса Saccharomyces cerevisiae и необходим для жизнедеятельности клетки, так как делеция его гена приводит к летальному фенотипу прогрессирующего укорочения теломер. Однако до настоящего времени структура и конкретная функции Est3p остаются неизвестными, в связи с чем, этот компонент дрожжевого теломеразного комплекса вызывает огромный интерес у исследователей.
Цель работы. Разработка эффективного метода выделения белка Est3p и функциональное изучение его биохимических свойств.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые разработан эффективный метод выделения активного in vitro компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae белка Est3p. Показана способность этого белка образовывать гомодимер in vitro. Впервые обнаружены и исследованы новые свойства белка Est3p: ОТРазная и АТРазная активности, способность взаимодействовать с рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидами, уникальная способность специфически узнавать и раскручивать РНК/ДНК гибридные дуплексы.
Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, позволяющие сделать выводы о функционировании белка Est3p в составе теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: Международной конференции им. В.А. Энгельгардта по Молекулярной Биологии, Московская область, Россия, 2006 г.; Международной конференции "Теломеры и Теломераза", Нью-Йорк, США, 2007 г.; Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2007", Москва, Россия, 2007; Международной конференции "Биокатализ-2007", Москва, Санкт-Петербург, Россия, 2007.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текса и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 222 цитированные работы.
