Введение к работе
Актуальность проблемы. На концах линейных хромосом эукариот находятся теломеры - ДНК-белковые структуры, которые защищают концы хромосом от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Репликативный аппарат клетки не обеспечивает полную репликацию концов. У большинства организмов основным механизмом поддержания длины теломер является достраивание теломерных повторов ДНК ферментом теломеразой. Этот фермент представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс. Коровый фермент включает в себя теломеразную обратную транскриптазу и теломеразную РНК, содержащую матричный участок для удлинения ДНК. В теломеразный комплекс входит еще целый ряд вспомогательных компонентов, необходимых для функционирования теломеразы in vivo.
Нарушения в работе теломеразы и теломер приводят к целому ряду возрастных патологий человека (повреждение костного мозга, остеопороз, фиброз легких, цирроз печени и др.). Активация теломеразы наблюдается в большинстве опухолевых клеток млекопитающих и иммортализованных клеточных линиях. Поэтому изучение строения, состава и механизмов функционирования теломеразных комплексов различных организмов и их сравнение, помимо фундаментального, имеет и важное прикладное значение. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.
Несмотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не известен точный состав теломеразного комплекса. Опубликованные данные о четвертичной структуре теломеразы дрожжей противоречивы. Данная работа посвящена изучению структуры и состава теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса.
Цель работы. Одной из основных задач работы было изучение вопроса о том, в какой форме - мономерной или димерной - функционирует теломераза дрожжей. Для этого необходимо было разработать метод выделения теломеразы дрожжей с помощью аффинной хроматографии с использованием аптамерной вставки в теломеразной РНК (TLC1 РНК), а также создать систему для удобного тестирования функциональности TLC1 РНК с аптамерной вставкой и проверки возможности димеризации активной теломеразы. Еще одной задачей работы было изучение обнаруженного взаимодействия теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae с биотинилированным компонентом.
Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе был разработан метод выделения теломеразы дрожжей с помощью аффинной хроматографии с
использованием РНК-аптамерной вставки в TLC1 РНК. При этом использовалась вставка в TLC1 РНК, являющаяся аптамером к стрептавидину. Эта вставка была введена в два различных района в TLC1 РНК. В работе была создана система для тестирования функциональности модифицированной теломеразной РНК на основе метода замены плазмид в дрожжах, подходящая для изучения возможности димеризации теломеразы. Показано, что теломераза, содержащая TLC1 РНК с одной из вставок, функциональна in vivo и может быть выделена in vitro. В препарате теломеразы, полученной из штамма, экспрессирующего две различающиеся молекулы TLC1 РНК (с аптамерной вставкой и без нее), обнаружен активный фермент, содержащий только TLC1 РНК со вставкой. Таким образом, в работе показано, что теломераза дрожжей активна in vitro в мономерной форме.
В работе впервые показана возможность вхождения биотинилированного компонента в состав теломеразного комплекса дрожжей. Теломераза, содержащая биотинилированный белок, активна in vitro. Она составляет менее половины общего количества активной теломеразы, выделенной из клеток, а именно, легкую фракцию теломеразных комплексов.
Таким образом, в данной диссертационной работе получены важные результаты, позволяющие делать выводы о строении и составе теломеразного комплекса дрожжей.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: международные конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2005», 12-15 апреля, г. Москва, Россия, 2005 и «Ломоносов-2008», 9-10 апреля, г. Москва, Россия, 2008; 8th International Engelhardt Conference On Molecular Biology «RNA-protein interactions», 19-24 августа, г. Сергиев Посад, Россия, 2006; IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая, г. Новосибирск, Россия, 2008; ЕМВО conference «Replication and Segregation of Chromosomes», 16-20 июня, г. Гейло, Норвегия, 2008.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 3 таблицами. Библиографический указатель включает 352 цитированные работы.
