Введение к работе
Актуальность проблемы. На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Недорепликация концов хромосом при каждом клеточном делении приводит к укорочению теломер, в результате которого клетка перестаёт делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, например в раковых, стволовых и эмбриональных клетках млекопитающих, а также в одноклеточных эукариотических организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер с помощью достраивания теломерных повторов ферментом теломеразой. Изучение работы и регуляции теломеразного комплекса вызывает большой интерес во всем мире, так как открывает возможности для лечения онкологических заболеваний путём восстановления контроля числа клеточных делений в раковых клетках. Работы по созданию противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразную активность, в частности, за счёт стабилизации квадруплексов на теломерных повторах, ведутся уже много лет. Очевидно, что для дальнейшего развития этого направления необходимо детальное понимание механизма работы теломеразного комплекса in vivo.
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являясь одноклеточными эукариотами и одновременно одним из наиболее изученных организмов, в геном которого легко вносить необходимые изменения, представляют собой удобную модельную систему для изучения теломеразного комплекса. В теломеразный комплекс дрожжей входят 4 незаменимых in vivo компонента: теломеразная обратная транскриптаза Est2, теломеразная РНК tlcl и два регуляторных белка - Est3 и Estl. Est3 является наименее изученным компонентом теломеразного комплекса, его структура и функция остаются неизвестными. Только в последние несколько лет стали известны некоторые его биохимические свойства, в частности, взаимодействие Est3 с теломерными олигонуклеотидами, однако основная функция белка Ets3 до сих пор не ясна. Основой для данной работы стала гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами на концах теломер и необходимости этого взаимодействия для регуляции теломеразной активности в дрожжах.
На сегодняшний день известно несколько белков, входящих в теломеразный комплекс других организмов, и взаимодействующих с квадруплексами. Например, структурный гомолог Est3 - TEBPbeta простейших - в паре с TEBPalfa способствует их формированию in vivo. В то же время, другой структурный гомолог Est3 - ТРР1 человека - образует димер Potl/TPPl, который расплетает ДНК-квадруплексы и является фактором процессивности для теломеразы человека. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым in vivo белком теломеразного комплекса -Estl. Кроме того, недавно было показано, белок Estl способен формировать ДНК-квадруплексы. Подтверждение предполагаемого взаимодействия Est3 с ДНК
квадруплексами будет означать, что регуляция теломеразной активности за счёт формирования квадруплексов является консервативным механизмом.
Целью работы являлась проверка гипотезы о взаимодействии Est3 с ДНК-квадруплексами, поиск возможной роли этого взаимодействия в функционировании теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae, и определение связи с ГТФазной активностью и димеризацией белка Est3 S.cerevisiae.
Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые показано, что белок Est3 способен взаимодействовать с ДНК- и РНК-квадруплексами, образованными теломерными повторами. Получены и охарактеризованы белки Est3 S.cerevisioe с заменами аминокислотных остатков, подтверждающими важность взаимодействия белка Est3 с ДНК-квадруплексами для работы теломеразного комплекса in vivo. Показана специфичность взаимодействия с межмолекулярными квадруплексами, определены константы диссоциации с различными типами квадруплексов. Обнаружено, что в узнавании и связывании ДНК-квадруплексов белком Est3 важную роль играет не только структура квадруплекса, но и нуклеотидная последовательность между гуаниновыми трактами, образующими G-квартеты. Также определена связь между взаимодействием Est3 с ДНК-квадруплексами, ГТФазной активностью белка Est3 и его способностью димеризоваться.
Результаты данной работы в комплексе с анализом литературных данных указывают на то, что в дрожжах S.cerevisioe система Est3-Estl аналогична системе TEBPalfa-TEBP-beta О.novo. Таким образом, полученные в ходе работы результаты указывают на существование консервативного механизма регуляции теломеразной активности с помощью формирования ДНК-квадруплексов и проясняют некоторые аспекты работы теломеразного комплекса.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 21st IUBMB and 12th FAOBMB International congress of Biochemistry and Molecular Biology (Шанхай, Китай, 2009), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009), Международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, Республика Коми, 2010), Первый симпозиум по химии высокомолекулярных соединений для наук о жизни и материаловедения (Новосибирск, Россия, 2010).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 73 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 297 процитированных работ.
