Введение к работе
Актуальность проблемы. В течение последних десятилетий достигнуты значительные успехи в изучении топогенеза митохоидриальных белков, синтезируемых как в цитозоле, так и в самих органеллах. Детально изучен транслокационный аппарат митохондрий (белковые транслоконы ТОМ, TIM23, TIM22), механизмы прохождения импортируемых полипептидных цепей через митохондриальные мембраны. Установлены общие принципы импорта белковых предшественников в митохондрии, их распределение по субмитохондриальным компартментам (хотя и для достаточно ограниченного числа традиционных белков-моделей). Вместе с тем, в топогенезе митохоидриальных белков остается множество проблем, решение которых требует дополнительных исследований. В частности, это касается механизмов встраивания белков в митохондриальные мембраны и, особенно, во внутреннюю мембрану, в которой сосредоточены компоненты, отвечающие за эксклюзивные функции митохондрий. Особый интерес представляет включение в митохондриальные мембраны белков, не имеющих отчетливо выраженных топогенных сигналов. К числу таких белков относится цитохром P450scc (CYP11A1), который содержится во внутренней мембране митохондрий стероидогенных органов и отвечает, в сопряжении с адренодоксином и NADPH: адренодоксин-оксидоредуктазой, за ключевую стадию синтеза всех стероидных гормонов млекопитающих (превращение холестерина в прегненолон). Особенностью CYP11А1 как субстрата для импорта является так же то, что он является гемопротеином и, следовательно, в процессе своего топогенеза должен связывать гем.
Изучение топогенеза митохондриального цитохрома CYP11A1, который в силу отсутствия характерных топогенных сигналов не может встраиваться в мембрану ни по одному из охарактеризованных к настоящему моменту молекулярных механизмов, должно способствовать расширению современных представлений о митохондриальном белковом импорте.
Целью работы является экспрессия в дрожжевых клетках гибридных форм CYP11A1 с различными адресующими сигналами для изучения особенностей его топогенеза в митохондриях и выбор гибридного белка для использования в штамме трансгенных дрожжей, способных осуществлять ключевую стадию синтеза стероидных гормонов.
Научная новизна и практическая значимость работы. В основе данной работы лежат два основных подхода. Во-первых, использование дрожжевых клеток для экспрессии различных рекомбинантных форм цитохрома P450scc (CYP11A1) в качестве модельной системы, позволяющей прояснить критические моменты топогенеза этого белка. Во-вторых,
конструирование рекомбинантных форм CYP11A1 с различными топогенными сигналами, позволяющими управлять его импортом в митохондрии и митохондриальной компартментализацией.
Были сконструированы и исследованы гибридные белки с сигналами котранслокационного встраивания в мембрану митохондрий AAC-mCYPllAl, DLD(l-72)-mCYPHAl и Bcsl(l-83)-mCYPllAl. Для того чтобы стимулировать перенос гибридного белка в матрикс был сконструирован гибрид с предшественником матриксного белка стероидогенных митохондрий - адренодоксина - preAd-mCYPHAl. Также проводилось изучение гибридов CoxIV(l-25)-mCYPllAl и Su9((l-112)-mCYPHAl. Сравнение внутримитохондриальной локализации и ферментативной активности различных гибридных белков, экспрессированных в дрожжевых клетках, позволило сделать предположение о том, что наиболее вероятным для природного топогенеза CYP11А1 является котранслокационный способ встраивания во внутреннюю митохондриальную мембрану, а не механизм реэкспорта. Для гибрида CoxIV(I-25)-mCYPllAl показано, что при импорте в дрожжевые митохондрии с дефицитными по компоненту РАМ-комплекса (Рат17) происходит более эффективное формирование холофермента, что также свидетельствует в пользу котранслокационной модели встраивания цитохрома.
Наиболее активные варианты гибридных белков-AAC-mCYPllAl и Bcsl(l-83)-mCYPllAl могут быть использованы для создания трансгенных микроорганизмов, выполняющих критическую стадию стероидогенеза млекопитающих, а именно, превращение холестерина в прегненолон, что представляет значительный интерес для биотехнологии.
Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, касающиеся механизма встраивания цитохрома P450scc (CYP11A1) во внутреннюю митохондриальную мембрану и созданы активные гибридные белки на основе CYP11A1, которые возможно использовать для создания трансгенных дрожжей, способных осуществлять ключевую стадию синтеза стероидных гормонов.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», четвертом съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006 г.) и на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.). Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 107 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы и выводы. Материал иллюстрирован 31 рисунком и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 127 цитированных работ.
Похожие диссертации на Конструирование и изучение топогенеза гибридных белков на основе цитохрома P450scc (CYP11A1) в гетерологических системах
