Введение к работе
Актуальность проблемы.
Инсулин является одним из наиболее изученных гормонов. Этот полипептид синтезируется специализированными кластерами Р-клеток поджелудочной железы, называемых островками Лангерганса. Инсулин выполняет в организме ряд важных функций контроля метаболизма и гомеостаза глюкозы, оказывая влияние на экспрессию генов, вовлеченных в эти процессы [Saltiel A.R., PessinJ.E. eds I Mechanism of Insulin Action. // Springer NY 2007. P. 214]. Дефицит инсулина, который может быть вызван различными факторами, сопровождается развитием тяжелых патологических состояний организма, характеризующихся повышением уровня глюкозы в плазме крови, получивших название сахарного диабета (diabetes mellitus). По оценкам ВОЗ, более 220 млн. человек во всем мире больны диабетом
[]. К 2030 году эта цифра, вероятно, более чем удвоится.
Инсулиновая терапия интенсивно применяется для лечения больных инсули-нозависимым сахарным диабетом типа I (около 10% от общего числа больных сахарным диабетом), а также используется для коррекции тех больных диабетом типа II, у которых нарушена секреция инсулина. Исходя из того, что средняя ежедневная доза инсулина в терапии сахарного диабета типа I лежит в пределах ~1.4 - 2.1 мг (40-60 ME), легко подсчитать, что ежегодная потребность в инсулине составляет как минимум 11 тонн, и эта потребность ежегодно увеличивается на ~3 - 4% [Kjeldsen Т. / Yeast secretory expression of insulin precursors II Appl Microbiol Biotechnol. 2000. V.54(3). P.277-286.]. В связи с этим до на-
стоящего времени проводятся интенсивные исследования, направленные на оптимизацию технологии получения инсулина, получение производных с требуемыми потребительскими свойствами и совершенствование средств и способов направленной доставки гормона к клеткам-мишеням. В нашей стране исследования в области генной инженерии и молекулярной биологии позволили Институту биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук при финансовой поддержке Правительства города Москвы, впервые выпустить на фармацевтический рынок наиболее востребованные лекарственные формы инсулина.
В настоящее время предпринимаются попытки повысить эффективность процесса получения инсулина, однако высокий уровень биосинтеза рекомбинантного белка в Е. coli приводит к образованию нерастворимых и неактивных агрегатов, называемых телами включения (ТВ) [MiddelbergA.P.J. /Preparative protein refolding// Trends Biotech. 2002. V.20(10). P.437-443], в состав которых входят не только целевые рекомбинантные белки (РБ), но и ряд бактериальных («балластных») белков. Поэтому для получения целевого компонента в на-тивном виде требуются определенные шаги для растворения таких агрегатов, выделения из них белка и его ренатурации. Способы проведения этих процедур во многом определяют специфику всего производства биофармацевтических белков и имеют существенное влияние на производственные затраты.
Цель исследования.
Основной целью данной работы была разработка эффективной отечественной технологической схемы выделения РБ проинсулина человека из ТВ E.coli, ее оптимизация и разработка соответствующего метода контроля.
Задачи исследования.
-
Разработать и валидировать метод контроля содержания мономера РБ в растворах.
-
Изучить и оптимизировать процесс денатурации рекомбинантного белка из ТВ.
-
Определить тип хаотропного агента;
-
Определить оптимальное значение рН среды и тип буферной системы;
-
Определить концентрацию восстанавливающего агента и концентрацию РБ.
3. Исследовать и оптимизировать процесс ренатурации восстановленного РБ.
-
Определить максимальный выход нативного РБ;
-
Определить влияние внешних факторов (температура, рН);
-
Определить оптимальную концентрацию РБ;
-
Исследовать влияние низкомолекулярных добавок (L-аргинин, ЭДТА);
-
Исследовать влияние окислительно-восстановительных пар;
4. Масштабировать полученные результаты от аналитического до препара
тивного уровня.
Научная новизна.
-
Разработан метод внутрипроизводственного контроля содержания мономера РБ проинсулина человека в растворах восстановленного и рена-турированного РБ. Метод позволяет точно, правильно, специфично и воспроизводимо контролировать содержание и чистоту белка с молекулярной массой от 10 до 30 к Да и может использоваться для контроля и других биофармацевтических процессов.
-
Разработан эффективный процесс восстановления РБ проинсулина человека с использованием дитиотреитола и NH4OH в качестве источника свободных аминогрупп.
-
Разработана эффективная схема ренатурации РБ проинсулина человека, в которой минимизирована агрегация белка за счет добавления ЭД-ТА в раствор и максимизировано образование целевой нативной мономерной формы.
Практическая значимость работы.
Разработана эффективная технология выделения мономера рекомбинантного предшественника проинсулина человека из ТВ E.coli, состоящая из этапов денатурации и восстановления РБ с последующей его ренатурацией. Оптимизация восстановления позволила увеличить количество выделяемого из ТВ целевого белка со 110 до 165 г с 1 кг ТВ, минимизировать образование агрегатов РБ во время ренатурации и увеличить максимальный выход ренатури-рованного РБ с 70 до 85%, что привело к суммарному увеличению количества получаемого ренатурированного мономера РБ на 30%. При этом выход АФС инсулина увеличился с 220 до 300 г / мЗ культуральной жидкости. Разработанная технология в настоящее время успешно реализуется на Опытном биотехнологическом производстве Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова.
Разработан и валидирован метод контроля содержания мономера РБ проинсулина человека в растворах на основе SEC. Метод обладает значительной мобильностью (ведение цикла определения при скорости 0.5 мл/мин; время цикла 25 минут), воспроизводимостью результатов, селективностью определения чистоты мономерной формы РБ внутри диапазона концентраций РБ в образце (2^-8) мг/мл.
Апробация работы.
Результаты исследований были изложены на XVI Менделеевской конференции молодых ученых (Уфа, Россия, 2006), Пятом Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009) и Международной научной конференции SPICA2010 (Стокгольм, Швеция, 2010).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 9 статей в научных журналах.
Объем и структура диссертации.
