Введение к работе
Актуальность темы. Основным средством лечения и предотвращения развития сахарного диабета является парэнтеральное введение больным инсулина, потребность в котором в нашей стране исчисляется сотнями килограммов в год. Однако инсулин, выделяемый прежде из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиней, структурно отличается от инсулина человека и может вызывать аллергические реакции. Поэтому в настоящее время в употребление вводится инсулин, полностью идентичный инсулину человека, получаемый полусинтетическим способом из свиного инсулина или при помощи рекомби-нантных микроорганизмов, трансформированных плазмидой со встроенным экспрессирующимся геном инсулина человека. Получение инсулина из поджелудочных желез является процессом, требующим-больших- количеств исходного материала, и ощущается его нехватка в связи с увеличением инсулин7зависимых больных. Поэтому получение инсулина при помощи рекомбинантных микроорганизмов становится более актуальным. Однако в микроорганизмах инсулин обычно синтезируется в составе своего биотехнологического предшественника, и его получение является сложным процессом, включающим трансформацию и очистку ' промежуточных продуктов и характеризующимся большим числом стадий. Поэтому существенно возрастает значение разработки оптимальной технологической схемы получения, которая должна обеспечить высокий выход и чистоту конечного продукта, а также легко масштабироваться.
Цель работы. Настоящая работа посвящена разработке технологи-
Список сокращений:
ГБ - гибридный белок, в котором домен В белка А соединен с последовательностью проинсулйна через остаток метионина; ГБ' ' - гибридный белок;
ВПАК - сополимер винилпирролидона с акролеином; ПААГ - полиакриламидный гель; C-KR - (Lys, Агс)-С-пептид человека; Ins-R - (Arg В31)-инсулин человека;' Ins-RR - (Arg B31,Arg В32)-инсулин человека; desT-Ins - дез-(Тпг ВЗО)-инсулин человека.
ческой схемы получения генно-инженерного инсулина человека, использующей в качестве продуцента бактериальный штамм, в котором инсулин экспрессируется в составе ГБ, и позволяющей осуществить масштабную наработку продукта с высоким выходом и чистотой.
Научная новизна. Разработана новая технологическая схема получения генно-инженерного инсулина человека на основе новых способов трансформации биотехнологических предшественников инсулина в инсулин с широким применением мембранной фильтрации и частичным задействованием, отечественных материалов.
Практическая ценность работы. На основе разработанной схемы наработаны образцы субстанции инсулина человека для проведения испытаний и изготовления лекарственных форм, создан "Опытно-промышленный регламент на производство инсулина человека", спроектирована опытно-производственная линия получения инсулина производительностью 80 кг в год на СНОПЕ ПО "Прогресс" (Казахстан). .
Апробация работы и публикации. Результаты работы доложены на V Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Юрмала, 1990); III Всесоюзном семинаре "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически -активных соединений микробного происхождения" (Степногорск, 1991); II Российско-Израильском симпозиуме по петидам и белкам (Москва, 1992); 17 Международном симпозиуме по колоночной жидкостной хроматографии "ВЭЖХ 93" (Гамбург, 1993); 12 Международном симпозиуме по биомедицинскому применению хроматогроафии и электрофореза и 2 Международном симпозиуме по применению ВЭЖХ в химии ферментов (Верона, 1993). По материалам диссертации имеется 19 печатных работ, в том числе 5 авторских свидетельств.
'Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (179 наименований). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 14 рисунков, 3 таблицы и 4 схемы.
