Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1 Основные виды анатидиабетических средств 10
1.1.1. Инсулин. Общая характеристика 10
1.1.1.1. Строение инсулина 11
1.1.1.2. Способы получения 11
1.1.1.3. Физикохимические свойства инсулина 16
1.1.1.4. Лекарственные препараты 19
1.1.2. Модифицированные аналоги инсулина 20
1.1.2.1. Инсулиноподобные аналоги 21
1.1.2.2. Химически модифицированные инсулины 23
1.1.2.2.1. Пэгилированные инсулины 23
1.1.2.2.2. Гликозилированные инсулины 24
1.1.2.2.3. Ацилированные инсулины - 28
1.2. Методы исследования и анализа инсулина и его модофицированных аналогов -30
1.2.1. Методы разделения и определения места присоединения модифицирующего агента 30
1.2.2. Методы определения первичной структурыинсулина и его аналогов 39
1.2.2.1. Определение N-концевых аминокислоти последовательностей 41
1.2.2.2. Опеделение С-концевых аминокислот 43
1.2.2.3. Масс-спектрометрическое секвенирование 45
2. Экспериментальная часть 50
2.1. Реактивы и материалы 50
2.2. Приготовление рабочих растворов 51
2.3. Приборы и оборудование 52
2.4. Общая методология работы 53
2.4.1. Анализ инсулина, дисахаридилинсулина и ПСА-инсулина методами ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрии 53
2.4.2. Анализ инсулина, Lys-Pro-инсулина и Asp-инсулина методами ОФ ВЭЖХ и масс-спектрометрии58
3. Результаты и обсуждения 62
3.1. Химически модифицированные инсулины 62
3.1.1. Анализ дисахаридилинсулина 63
3.1.2. Анализ полисиалированного инсулина 72
3.2. Инсулиноподобные аналоги 79
Выводы 95
Список литературы 96
- Физикохимические свойства инсулина
- Методы исследования и анализа инсулина и его модофицированных аналогов
- Приборы и оборудование
- Анализ полисиалированного инсулина
Введение к работе
Актуальность работы. Сахарный диабет является социально значимым заболеванием и устойчиво занимает третье место в мире по смертности после сердечнососудистых и онкологических заболеваний. Помимо тяжелого характера протекания, он опасен тем, что является причиной возникновения других тяжелых заболеваний, приводящих в лучшем случае к инвалидности, а часто и к летальному исходу. Инсулинозависимый диабет (диабет 1-го типа) в последние десятилетия устойчиво «молодеет», поражая даже детей. Поэтому борьба с диабетом, является приоритетом для органов здравоохранения всех стран.
В настоящее время для терапии диабета 1-ого типа чаще всего используют генно-инженерный инсулин человека (ГИИЧ). Крупномасштабное производство и поставки этого препарата в нашу страну осуществляет ряд крупных иностранных фирм. В России его производство началось в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (ИБХ РАН). К сожалению, ГИИЧ не всегда идеально регулирует уровень глюкозы в организме человека. Кроме того, его применение сопровождается рядом негативных явлений, включая протеолиз в потоке циркулирующей крови, преждевременное выведение, иммуногенность, небольшое время действия и т.п. По этой причине, наряду с производством рекомбинатного инсулина, идут разработки и внедрение в практику его модифицированных аналогов, которые отличались бы меньшей токсичностью и тем же самым, как минимум, или лучшим терапевтическим эффектом.
Модифицированные аналоги инсулина получают, используя два основных подхода. В одном случае проводят изменение первичной структуры полипептидной цепи ГИИЧ, удаляя определенный её фрагмент или изменяя часть аминокислотной последовательности. Достаточно удачными примерами осуществления этого подхода являются такие препараты как инсулин-аспарт, глулизин, инсулин-лизпро. В другом случае проводят химическую модификацию ГИИЧ, введением дополнительной боковой группы, используя для этого ряд соединений (сахара, полиэтиленгликоль, органические кислоты и т.п.). Целью таких модификаций является получение производных инсулина человека, обладающих большей устойчивостью к гидролизу в организме человека и меньшими побочными эффектами, присущими инсулинам предыдущих технологических поколений.
В ходе разработки указанных новых препаратов возникает ряд проблем, связанных с их синтезом, контролем качества, биодеградацией, определением их структуры. Решение данных проблем позволило бы найти эффективные пути
совершенствования их качества и производства. В настоящее время не существует типовой (универсальной) схемы анализа инсулинов данного типа, позволяющей их объективно сопоставить с ГИИЧ. Актуальность темы данной диссертации заключается в разработке, с одной стороны, общей аналитической методологии, а с другой, конкретных методик определения строения новых производных инсулина человека, перспективных в качестве новых отечественных антидиабетических лекарств. Разработка таких отечественных препаратов позволила бы, во-первых, создать инсулины нового поколения с улучшенными терапевтическими свойствами, во-вторых, обеспечить пациентов необходимыми им лекарствами, в-третьих, уменьшить зависимость от импортных поставок, т.е. провести импортозамещение, что в условиях экономического кризиса является крайне актуальным, и, в-четвертых, обеспечить медицинскую и технологическую безопасность России.
В данной работе исследован ряд модифицированных аналогов инсулина, имеющих как неизмененные, так и измененные инсулиновые цепи. Эти соединения обладают пролонгированным действием, менее иммуногены, чем сам ГИИЧ. На их основе возможно создание ингаляционных лекарственных форм.
Цель работы заключается в разработке общих принципов и методологии изучения и анализа химически модифицированного ГИИЧ (дисахаридилинсулина, ПСА-инсулина) и инсулиноподобных аналогов с измененными инсулиновыми цепями (инсулина-аспарта и инсулин-лизпро), аналитическом обеспечения разработки с применением комплекса отечественного оборудования.
Задачи исследования.
Разработка типовой схемы анализа упомянутых препаратов;
Отработка аналитических методик и режимов анализа, позволяющих проводить эффективный и рациональный аналитический контроль с использованием комплекса отечественного оборудования;
Проверка эффективности разработанных методик на смесях пептидов -являющихся фрагментами образцов сравнения и инновационных разрабатываемых препаратов;
Исследование структуры модифицированных инсулинов (аминокислотной последовательности, определение места присоединения и числа молекул модифицирующих агентов в структуре инсулинов).
Научная новизна.
1. Разработана типовая схема анализа химически модифицированных ГИИЧ с
применением пептидного картирования, ВЭЖХ, ESI- и MALDI-MC.
Разработан способ установления аминокислотной последовательности цистеин-содержащих инсулиноподобных аналогов, основанный на использовании комплекса химических (восстановление дисульфидных связей, модификация SH-rpynn с последующим ферментативным гидролизом выделенных пептидных цепей) и инструментальных методов (ВЭЖХ, МС-секвенирование).
Установлена структура гликозилированных инсулинов (ПСА-инсулина, дисахаридилинсулина), определены точки модификации полипептидных цепей ГИИЧ этими сахаридами.
На защиту выносятся:
типовая схема анализа химически модифицированных (гликозилированных) инсулинов с неизмененными инсулиновыми цепями;
результаты исследования пробоподготовки и анализа гликозилированных инсулинов, определения точки модификации полипептидных цепей ГИИЧ;
- способ установления аминокислотной последовательности инсулинов с
измененной пептидной цепью, включающий комплекс химических (денатурация,
восстановление дисульфидных связей, модификация SH-групп, ферментативный
гидролиз и выделение модифицированных цепей) и инструментальных (ВЭЖХ и МС-
секвенирование) методов анализа;
- результаты применения разработанного способа установления аминокислотной последовательности к образцам сравнения, для которых она надежно установлена.
Практическая значимость заключается в создании аналитического обеспечения процесса разработки модифицированных инсулинов с применением комплекса отечественного оборудования. Необходимость такого вида исследований обусловлена практической потребностью разработки и их внедрения в практику. Гликозилированные полипептиды представляют интерес как новые терапевтические средства. Методики разделения и определения структуры цистеин-содержащих пептидов являются универсальными и могут быть применены как для изучения инвертированных аналогов инсулина и образующихся в ходе получения ГИИЧ родственных инсулиноподобных примесей нормируемых фармакопейной статьей, так и для анализа любых двухцепочечных цистеин-содержащих пептидов.
Апробация работы. Результаты исследований нашли отражение в докладах на: II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, (Россия, Санкт-Петербург,
2005); XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2007», (Россия, Москва, 2007); Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», (Россия, Москва, 2007); 34-ом международном симпозиуме «HPLC 2009 - High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques» (Германия, Дрезден, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Казань, 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Россия, Самара, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в научных рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации.
Физикохимические свойства инсулина
Инсулин человека занимает промежуточное место между белками и пептидами, его среднеизотопная молекулярная масса составляет 5806 Да, изоэлектрическая точка (рК) - 5,3-5,5 [7]. Состояние и поведение инсулина сильно зависит от среды раствора, в котором он присутствует. В растворах НС1 протекает дезамидирование по таким аминокислотным остаткам как GlnA5, GlnA15, AsnA18, AsnA21, GlnB4. В щелочной среде (рН 10) происходит разрушение дисульфидных мостиков, что приводит к потере биологической активности. Лучше всего инсулин растворяется в растворах с 4 рН 7. Количественного осаждения его из разбавленных растворов можно добиться, создавая рН 2-3 и добавляя 2М NaCl. Состояние инсулина в растворе сильно зависит от его концентрации и присутствия ряда веществ. Они определяют характер равновесия между его мономерной, димерной, тетрамерной и гексамерной формами [7]. При низких концентрациях, близких к концентрациям в крови, он существует в мономерной форме, которая является биологически активной в силу своей способности взаимодействовать с инсулиновым рецептором [23]. С повышением концентрации и в кислой и в щелочной среде (рН 8), в отсутствиие ионов Zn , в результате самоассоциации образуются димеры. 94 В нейтральной и слабощелочной среде в присутствии Zn протекает агрегация белка с образованием гексамеров [9, 24].
Эта особенность поведения инсулина обеспечивает его компактное накопление в больших количествах в 3-клетках поджелудочной железы, эффективное превращение препроинсулина в инсулин и способствует защите белка от физических и химических денатурации [25, 26]. Установлено, что гексамер существует в трех конформациях (Т6, R6 и T3R3) - напряженном (tense,T6-состояние); ослабленном (relaxed, К6-состояние) и смешанном (T3R3-состояние). Какая из указанных конформаций реализуется при упаковке неизвестно [27]. В большинстве фармацевтических препаратов инсулин присутствует в виде димера [7, 23, 28]. Как правило, инсулин используют в сочетании с рядом добавок, благодаря чему облегчается переход из Т6 в R6. Связывание инсулина с этими добавками происходит по определенным участкам, которые называют гидрофобными карманами. В состоянии R6 имеется шесть, а T3R3 - три таких кармана. Добавки в значительной мере определяют стабильность, время действия и форму существования инсулина, характер дезинфицирующего эффекта, буферные свойства препарата, устойчивость к термической денатурации и полимеризации и ряд других важных параметров [23]. Обычно для увеличения времени действия (пролонгирования) препаратов инсулина применяют соединения цинка, сурфен (аминометилхинолил-мочевину), протамин-сульфат и некоторые другие вещества [10]. При их использовании с помощью буферов (фосфатного или ацетатного) поддерживают требуемое значение рН раствора. Состояние и размер инсулиновых кристаллов влияют на время действия гормона в организме человека [29]. Используя различные сочетания аморфной и кристаллической форм, получают препараты инсулина различного времени действия - сверхбыстрого, быстрого, промежуточного и пролонгированного характера. С увеличением размеров кристаллов инсулина и концентрации ионов цинка при определённом содержании высокоосновных полипептидов в препарате возрастает длительность сахаропонижающего эффекта. Указанная пролонгация характерна для таких форм инсулина, как инсулин-НПХ среднего времени действия (NPH, neutral protamin Hagedorn); суспензия, кристаллического цинк-инсулина в изофановом отношении к протаминным белкам), длительного (Ленте) и пролонгированного (Ультра-Ленте) действия. В последнем сверхдлительный сахаропонижающий эффект обеспечивается высокой концентрацией ионов цинка [31].
Одним из способов продления времени действия препарата инсулина является совместное осаждение его кристаллов с протаминовыми полипептидами при нейтральных значениях рН. В результате такой процедуры образуется суспензия комплекса протамин-цинк-инсулина. Обычно она дополнительно стабилизируется соединениями фенольного ряда. Указанный сложный комплекс протамин-цинк-инсулина под действием фибринолитических ферментов организма пациента деградирует с очень низкой скоростью, высвобождая инсулин из структуры так медленно, что гормон образует мономерную форму, которая и проявляет биологическую активность [30, 32]. Установлено, что протаминовые полипептиды часто иммуногенны, их использование в медицинских целях сопровождается образованием антител. Более того, доказано, что протаминовый комплекс с инсулином также вызывает образование антител при длительной терапии НПХ-инсулином [33]. Другим способом пролонгирования действия является использование растворимых форм инсулина, не порождающих проблем, связанных с иммуногенностью.
Длительность действия препарата этого типа обусловлена явлениями, протекающими при его введении. После инъекции такого препарата инсулин попадает в среду с более высоким значением рН и осаждается, выпавший осадок затем в токе крови медленно растворяется [35]. Необходимо иметь в виду, что введение раствора с низким рН представляет достаточно болезненную процедуру для пациента. В настоящее время в качестве препарата пролонгированного действия используется НПХ-инсулин, а короткого действия - раствор инсулина в димерной форме. Средний по продолжительности эффект проявляет кобальт(Ш)-инсулиновый комплекс в растворе [36]. К сожалению, биодоступность его недостаточно высока. Некоторые из веществ, используемых при получении инсулина, обладают дезинфицирующим действием и вследствие этого играют роль антибактериальных консервантов [36]. Концентрации, в которых они присутствуют в его препаратах, не оказывают заметного отрицательного влияния на организм человека. Веществами такого типа являются фенол, крезол, метилпарабен. Метилпарабен используют вместо фенола в инсулин-цинковых суспензиях (ИЦС). Ионы цинка, содержащиеся в этих препаратах, также оказывают антимикробное действие. Благодаря такой
Методы исследования и анализа инсулина и его модофицированных аналогов
Характерные для ГИИЧ негативные свойства можно значительно уменьшить или даже устранить, проводя его модификацию соответствующим способом с получением инсулиноподобных соединений с определенными свойствами. Такого типа соединения получают при условии строгого соблюдения определенных условий синтеза и аналитического контроля всех стадий его осуществления. Если первая задача в определенной мере решена, то вторая находится только в начале пути своего решения, требуется ее детализированная разработка. При ее решении задача анализа модифицированного аналога инсулина сводится или к определению его аминокислотного состава и последовательности, или места связывания инсулина с модифицирующим агентом. Чаще всего для исследования и анализа пептидов применяют микрометоды. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность, селективность, воспроизводимость и не требуют больших количеств анализируемого образца. К этим методам относятся, прежде всего, хроматография в сочетании с масс-спектрометрией. Из хроматографических методов наиболее хорошо зарекомендовала себя гельфильтрационная, ионообменная и обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография. Полезны также капиллярный электрофорез и электрофорез в гелях. Комплекс этих методов позволяет разделить и охарактеризовать сложные многокомпонентные смеси инсулиноподобных веществ. Гелъ-филътрационная хроматография (эксклюзионная). Данный метод разделения особенно эффективен для разделения инсулиноподобных соединений, имеющих значительные различия в размерах молекул.
Известно его применение для определения ди- и полимерных продуктов распада гексамерного Zn-инсулина [81], а также для разделения моно- и димерных инсулинов [82]. Имеются сведения о его применении для характеризации гомогенности, точнее мономерности, инвертированных инсулиновых препаратов [83]. Этот метод хорошо зарекомендовал себя при очистки белков, в первую очередь, при отделении от них низкомолекулярных примесей, в том числе солей [84]. Данный вид хроматографии не позволяет отделить сопутствующие инсулину соединения. Одной из возможных причин этого является образованием высокомолекулярных инсулиновых агрегатов. Агрегация проявляется в виде небольшого плеча на хроматографическом пике, соответствующего инсулину. Минимизировать потери инсулина при гельфильтрационной очистке можно за счет рационального подбора параметров проводимого процесса. В целом, разрешающая способность метода невысока. С его помощью нельзя отделить инсулин от его близких аналогов, например дезтреонилинсулина, дезамидоинсулина или инсулина-лизпро. Положительной его стороной является простота и мягкость условий проведения. Ионообменная хроматография (ИОХ) широко используется при анализе пептидных препаратов. Она особенно полезна при очистке и анализе веществ с разной полярностью и сродством к ионногенным группам. Исследована возможность использования данного метода для анализа состава полисиалированных пептидных компонентов гомогената куриного мозга [86, 87]. Указаний в литературе на применение ИОХ для разделения полисиалированных производных инсулина человека не имеется. Известно её использования для определения эндогенной ПСА, известной как коломиновая кислота («colominic acid») [85]. Анионообменная хроматография позволяет разделить сложную многокомпонентную смесь ПСА с числом мономерных звеньев от 5 до 90 в составе [86], например, при анализе полисиалированных инсулинов с различным числом пришитых звеньев сиаловой кислоты. ИОХ находит применение для отделения инсулина от С-пептида, трипсина и карбоксипептидазы после ферментативного гидролиза предшественника, а также остаточных количеств проинсулина.
В производстве ее применяют также для финального удаления остаточных иммуногенных примесей. При этом обычно используют сульфопропильныекатионообменники. Существенными недостатками ИОХ является эффект разбавления, достаточно продолжительные циклы очистки, недостаточно высокие выходы, ограниченная применимость при анализе образцов биологического происхождения. Предел обнаружения, достигаемый этим методом, составляет несколько пикомоль. ИОХ заметно уступает обращенно-фазовой хроматографии по многим характеристикам, в частности, по способности концентрировать и воспроизводимости. Несмотря на отмеченные недостатки ИОХ находит успешное применение как метод предварительной очистки. Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) является самым широко распространенным методом количественно разделения на составляющие и очистки сложных смесей белков. В основе её лежит различие в полярности компонентов смеси. ОФ ВЭЖХ имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с другими известными хроматографическими методами, применяемыми при исследовании инсулина и его аналогов. Её отличает высокая селективность процесса сорбции, относительно небольшая продолжительность цикла очистки, большие выхода вьщеляемого инсулина [105]. В настоящее время
Приборы и оборудование
Микроколоночный хроматограф «Милихром А-02» («ЭкоНова», Новосибирск, Россия), оснащенный двумя микрошприцевыми насосами объемом 2,5 мл каждый, что позволяло изменять скорость потока в пределах 5-999мкл/с, програмированным автосамплером на 46 образцов, фотометрической кюветой (1,2 мкл), УФ-спектрофотометром (190-360 нм) и программной поддержкой «МилиХром». Масс-спектры были получены на MALDI TOF масс-спектрометре Vision 2000 (Brucker, Германия), а также на ESI масс-спектрометрах МХ5303 и MX 5311 (ИАнП РАН, Санкт-Петербург, Россия). Для измерения рН использовали цифровой рН-метр рН 525 (Wissenschaflichechnische Werkstatten, Германия). Для центрифугирования образцов использовали микроцентрифугу Eppendorf 1540 (Eppendorf, Германия). Перемешивание проводили с помощью ультразвукового перемешивающего устройства (Heat systems-ultrasonic Inc., N.Y., США). Для концентрирования применяли лиофильную сушилку Alpha 2-4 Loc-1 (Christ, Германия), оснащенную масляным насосом 2НВР-5Д-М (Казань, Россия). Для взятия навески использовали электронные аналитические весы (Sartorius Research, Германия). Выделение дисахаридгшинсулина из реакционной массы. Обработку реакционной массы проводили в описанной хроматографической системе. Для этого 25 мкл анализируемого раствора инжектировали с помощью автосамплера в микроколонку Prontosil 120-5C18AQ (размер колонки - 2x75, диаметр пор - 120 мкм, диаметр частиц - 5 мкм). Колонку термостатировали при 35 С. УФ-фотометрическое детектирование проводили при длинах волн 210 нм и 280 нм. Условия градиентного элюирования: Элюент А - 0,2% муравьиная кислота; Регенерацию колонки между анализами проводили раствором, содержащим 7% об. Б в течении 7 мин при скорости потока 200 мкл/мин.
Выделенный из реакционной массы дисахаридилинсулин лиофильно концентрировали. Выделение ПСА-инсулина из реакционной массы. Для выделения ПСА-инсулина использовали выше указанную хроматографическую систему. Реакционную массу (25 мкл) инжектировали с помощью автосамплера в микроколонку Prontosil 120-5C18AQ (размер колонки - 2x75, диаметр пор -120 мкм, диаметр частиц - 5 мкм). Колонку термостатировали при 35 С. УФ-фотометрическое детектирование проводили на длинах волн 210 нм, 260 нм и 280 нм. Условия градиентного элюирования: Элюент А - 0,1% трифторуксусная кислота; Элюент Б - 100% ацетонитрил. Регенерацию колонки между анализами проводили, пропуская 0,1% об. раствор трифторуксусной кислотой в течении 7 мин при скорости потока 200 мкл/мин. Выделенные из реакционной массы ПСА-инсулин лиофильно концентрировали. Гидролиз инсулина и его гликозилированных производных (дисахаридил- и ПСА-инсулиное) глутаминовой эндопротеиназой. 200 мкл раствора инсулина с концентрацией 1 мг/мл в 100 мМ гидрокарбонате аммония (рН 7,8) отбирали в закрывающуюся полипропиленовую пробирку для центрифугирования (Eppendorf) и добавляли 50 мкл водного раствора глутаминовой эндопротеиназы с концентрацией 0,1 мг/мл. Пробирку закрывали, раствор интенсивно перемешивали и инкубировали при температуре 37 С в течение 5 часов. Пробирку центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин. 10 мкл образца использовали для проведения ОФ ВЭЖХ.
По этой же методике проводили анализ выделенных из реакционной массы и лиофильно сконцентрированных образцов ПСА-инсулина и дисахаридилинсулина. Хроматографический анализ продуктов гидролиза инсулина, дисахаридилинсулина и ПСА-инсулина. 10 мкл анализируемых образцов наносили с помощью автосамплера на микроколонку Prontosil 120-5C18AQ (размер колонки - 2x75, диаметр пор - 120 мкм, диаметр частиц - 5 мкм). Колонку термостатировали при 35 С. УФ-фотометрическое детектирование проводили на длинах волн 210 нм и 280 нм. Условия градиентного элюирования: , содержащим 7% об. Б в течении 7 мин при скорости потока 200 мкл/мин. Масс-спектрометрический анализ. Фрагменты гидролизатов инсулина и дисахаридилинсулина анализировали, используя электрораспылительный времяпролетныи масс-спектрометр MX 5311 с наноспрейным ортогональным вводом пробы (анализатор типа oOF). Анализируемый раствор подавали со скоростью 3-6 мкл/мин через капилляр с внутренним диаметром 20 мкм. Поступающий в прибор поток жидкости вводили в систему ввода ионов, формирующую из этого потока непрерывный ионный пучок необходимой формы и энергии. Между капилляром и расположенной напротив него диафрагмой сопла приложено постоянное, регулируемое при необходимости от 0 до 5000 вольт, электрическое поле напряжением от +3000 до +3100 вольт. При работе в режиме регистрации молекулярных (родительских) ионов напряжение на входном сопле составляло от + ЮОдо +110 вольт, на скиммере + 33 вольта. Микрокапли раствора, попавшие в пространство между соплом и скиммером, проходят через квадрупольную транспортирующую систему, находящуюся под радиочастотным напряжением (RF) + 700 вольт. Напряжение, выталкивающее ионный пучок + 760 вольт, вытягивающее напряжение — 616 вольт. Программное обеспечение масс-спектрометра выполнено в виде программного комплекса, состоящего из двух основных программ: «TOF Controle" и «TOF Acquisor», работающих под управлением операционной системы Microsoft Windows ХР.
Программа TOF Controle обеспечивает управление и контроль низко- и высоковольтных источников питания, контролирует состояние вакуумной системы, устанавливает порог уровня шумов системы регистрации масс-спектров. Программа TOF Controle является основной частью системы управления прибором. Программа TOF Acquiser обеспечивает контроль и необходимую форму представления масс-спектра и общего ионного тока на детектор, осуществляет запись спектров на внешние устройства памяти. Программа TOF Acquiser осуществляет выделение изотопных пиков спектра и расчет аналитических характеристик (в частности, разрешения прибора и ширины изотопных пиков). Системы управления и регистрации спектров времяпролетного масс-спектрометра взаимосвязаны через компьютер. Хроматографически выделенные фрагменты гидролизатов инсулина и ПСА-инсулина анализировали на времяпролетном MALDI масс-спектрометре Vision 2000 в режиме рефлектрона, используя в качестве матрицы 2,5-дигидроксибензойную кислоту. Объем образца, наносимого на мишень, составлял 0,2-0,4 мкл. Для ионизации и десорбции сокристаллизованных с матрицей молекул исследуемых образцов использовали азотный лазер (337 нм) с энергией импульса 47-55 мВт (120 мкДж). Для получения приемлемых спектров требовалось от 10 до 100 импульсов лазера. Продолжительность лазерного импульса составляла 3 нсек. Ускоряющее напряжение составляло +5000 В.
Анализ полисиалированного инсулина
Среди других гликозилированных производных инсулина привлекает к себе внимание полисиалированный инсулин (ПСА-инсулин). С практической точки зрения важно знать, насколько применима к этому производному вышеизложенная методика анализа. Молекула ПСА значительно отличается от дисахарида размерами и строением и тем, что содержит большое число карбоксильных групп, затрудняющих детектирование молекул ПСА в режиме регистрации положительных ионов при использование ESI-MC. Как следствие этого, требуется другой источник ионизации, другие элюирующие реагенты. Эти изменения могут затрагивать любую из стадий анализа, включая пробоподготовку (выделение ПСА-инсулина из реакционной массы), идентификацию конъюгата и его ферментативную фрагментацию, вьщеление образующихся фрагментов и их МС-анализ. При проверке разработанной ранее для дисахаридилинсулина схемы, применительно к ПСА-инсулину, в качестве объекта исследования использовали конъюгат инсулина с ПСА с Мг 14,5 кДа. Выбор ПСА с указанной молекулярной массой обусловлен рядом причин - наличием надежных образцов сравнения ПСА, выходом при синтезе конъюгата и характером его терапевтического эффекта, установленными разработчиками. Конъюгаты с ПСА с большой Мг (23 кДа) образуются с заметно меньшим выходом по сравнению с конъюгатом с меньшей Мг (6,7 кДа) Наблюдаемые различия, по-видимому, обусловлены пространственными факторами используемых молекул ПСА.
Применённая ПСА имеет значение Мг промежуточное между Мг рассмотренных полисиаловых кислот. Выделение конъюгата ПСА-инсулина из реакционной массы проводили методом ОФ ВЭЖХ на той же аппаратуре, что и в случае дисахаридилинсулина, т.е. на хроматографе Милихром А-02 с фотометрическим детектированием и колонкой Prontosil 120-5С18. В качестве элюентов вместо муравьиной кислоты использовали трифторуксусную кислоту, поскольку она обеспечивала лучшее разделение инсулина и ПСА-содержащих компонентов исследуемой системы. Лучшее разделение достигается при использовании в качестве подвижной фазы ацетонитрила и 0,1 % об. трифторуксусной кислоты. Хроматограмма реакционной массы показывает, что в ней содержатся три фракции (рис. 25). Первая фракция представляет собой непрореагировавший ПСА, а третья - ГИИЧ, поскольку хроматографическое время выхода содержащихся в них веществ 1 и 3 совпадает с таковым для стандарта ПСА и ГИИЧ. Это обстоятельство позволило сделать предположение о том, что фракция 2 представляет собой соединение, являющееся конъюгатом ПСА-инсулин. Для проверки этого предположения данная фракция 2 была исследована методом MALDI-MC (рис. 26), поскольку ESI-MC, применённый ранее к дисахаридилинсулину, не позволяет это осуществить в случае конъюгата с ПСА ввиду слабовыраженной способности к его и ПСА к протонированию. Из полученного масс-спектра следует, что эта фракция представляет ПСА-инсулин. Присутствующий в нем пик с m/z 6176 свидетельствует о наличии в молекуле конъюгата одного остатка полисиаловой кислоты. Наблюдаемое явление может быть результатом разрыва связей в молекуле ПСА при проведении масс-спектрометрических измерений в режиме положительных ионов. Использованный метод позвилил зафиксировать коньюгат, содержащий только одно звено ПСА.
В основу определения строения ПСА-инсулина, как и в случае дисахаридилинсулина, был положен метод пептидного картирования с применением протеиназы V8 из Staphylococcus aureus в качестве расщепляющего фермента. За образец сравнения был взят хорошо изученный флуоресценилтиокарбамоил-инсулин (ФЛ-инсулин). Полученные продукты ферментативного гидролиза изучали, используя хроматографию в условиях, аналогичных для дисахаридилинсулина (рис. 27). Обращает на себя внимание заметное различие времени удерживания фрагментов ФЛ-инсулина и ПСА-инсулина, II и Па, соответственно. Кроме того, пик Па значительно уширен по сравнению с пиком П. Причиной наблюдаемого различия, очевидно, является присутствие углевода в составе фрагмента Па. Всё это позволяет предположить, что связывание инсулина с полисиаловой кислотой в коньюгате происходит по N-концевому фенилаланину B-цепи инсулина. Фрагменты гидролизатов ФЛ-инсулина и ПСА-инсулина были изучены методом MALDI-масс-спектрометрии. Результаты МС- анализа приведены в табл. 7.
