Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 14
1.1. Способы очистки волос 15
1.2. Способы разложения волос 20
1.2.1. Щелочное разложение 20
1.2.2. Кислотное разложение 23
1.2.3. Ферментативное разложение волос 24
1.3. Способы экстракции из волос 25
1.3.1. Способы экстракции из раствора после разложения волос 26
1.3.1.1. Жидкость-жидкостная экстракция 26
1.3.1.2. Твердофазная экстракция 29
1.3.1.3. Твердофазная микроэкстракция 32
1.3.2. Способы экстракции органических соединений без разложения волос 33
1.3.2.1. Жидкостная экстракция 33
1.3.2.2. Сверхкритическая флюидная экстракция 35
1.4. Способы улавливания органических соединений из потока сверхкритического флюида 37
1.5. Химическая модификация 39
1.6. Сравнение различных методов извлечения органических соединений из волос 42
ГЛАВА 2. Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента 46
2.1. Оборудование 46
2.2. Исходные вещества и реагенты 47
2.3. Методика эксперимента 47
2.3.1. Измельчение волос 47
2.3.2. Разложение волос 48
2.3.3. Жидкость-жидкостная экстракция 48
2.3.4. Экстракция органических соединений из волос метанолом 48
2.3.5. Сверхкритическая флюидная экстракция из волос 48
2.3.6. Сверхкритическая флюидная экстракция из раствора 49
2.3.7. Сбор экстракта 50
2.3.8. Газохроматографический анализ экстрактов 51
2.3.9. Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов 52
ГЛАВА 3. Исследование зависимости степени извлечения среднелетучих органических соединений из волос методом СФЭ от параметров эксперимента 54
3.1. Исследование зависимости степени извлечения от температуры флюида 59
3.2. Исследование зависимости степени извлечения от давления флюида 62
ГЛАВА 4. Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов человеческих волос 65
ГЛАВА 5. Сравнение различных способов извлечения среднелетучих органических соединений из человеческих волос 106
5.1. Экстракция органических соединений метанолом под действием ультразвука... 106
5.2. Разложение волос при помощи IMNaOHc последующей жидкость-жидкостной экстракцией из полученного раствора 110
5.3. Разложение волос при помощи 1МNaOH с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора 112
Заключение 120
Выводы 122
Список литературы 124
- Способы улавливания органических соединений из потока сверхкритического флюида
- Экстракция органических соединений из волос метанолом
- Исследование зависимости степени извлечения от давления флюида
- Разложение волос при помощи 1МNaOH с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора
Введение к работе
В настоящее время волосы являются третьим по важности биологическим объектом для медицинских и токсикологических исследований после крови и мочи, выгодно отличаясь от них простотой отбора, долговременностью хранения аналитов в матрице (можно зафиксировать однократное принятие наркотического вещества спустя 2-6 месяцев), а также возможностью отбора пробы в любое время суток.
Обычно работы ограничиваются определением одной группы заданных соединений (например, анаболические стероиды) и продуктами их метаболизма. Гораздо реже встречаются работы, в которых определяют 2-3 группы соединений (чаще всего опиаты и кокаин с продуктами их метаболизма), и для определения в волосах соединений различных групп необходимо проведение множества дорогостоящих анализов, нацеленных на определение конкретных групп соединений.
Существует два подхода к экстракции органических соединений из волос - экстракция без разложения волос и экстракция с частичным либо полным разложением. Наиболее широко используются деструктивные способы извлечения, которые можно разделить на три типа: разложение при помощи щелочей (0.1 - 5М NaOH), кислот (0.05 - ЗМ HCI, H2S04) НСІ/МеОН, ТФК/МеОН) и ферментативное разложение. После разложения проводят нейтрализацию и экстракцию определяемых соединений с помощью органических растворителей либо картриджей для твердофазной экстракции. Каждый из этих способов имеет свои ограничения. Так, щелочное разложение позволяет извлекать такие вещества, как морфин, амфетамины и каннабиноиды, но кокаин, героин, ацетилморфин и другие соединения, неустойчивые к действию щелочей, претерпевают деструкцию с образованием более простых производных. Кислотное разложение, особенно с использованием смесей ТФК/МеОН и НСІ/МеОН минимизирует разложение сложных эфиров и способствует эффективной экстракции кокаина и опиатов, но при извлечении, неустойчивых к действию кислот, например, бензодиазепинов, приводит к деструкции и образованию
6 множества побочных продуктов. Также при щелочном либо кислотном разложении происходит загрязнение пробы примесями из реагентов, используемых как для разложения волос, так и для нейтрализации полученного раствора. Ферментативное разложение позволяет извлекать вещества, неустойчивые к действию как кислот, так и оснований, но при этом требует дополнительной очистки раствора после экстракции, а также характеризуется большой стоимостью реагентов. После разложения определяемые соединения извлекают из раствора при помощи жидкость-жидкостной экстракции, твердофазной экстракции либо твердофазной микроэкстракции. Основным недостатком ЖЖЭ является необходимость использования больших объемов токсичных, а часто и горючих органических растворителей. Кроме того, их чистота редко превышает 99.7 %, и при упаривании происходит концентрирование примесей из растворителя, что приводит к искажению состава пробы. При этом для дальнейшего анализа используется 0.001-0.01 часть экстракта. Недостатком ТФЭ является использование органических растворителей, хотя и в количествах, меньших, чем в ЖЖЭ. При этом для анализа также используется малая часть экстракта. Преимущество ТФМЭ перед ЖЖЭ и ТФЭ - в отсутствии использования органических растворителей, недостаток
- в малых степенях извлечения.
Существуют также способы извлечения органических соединений из волос без их разложения, например, экстракции метанолом под действием ультразвука (обычно при определении бензодиазепинов, но возможно использование для извлечения каннабиноидов), инкубация в фосфатном буфере (KH2P04/Na2HP04/ NaOH, рН 7.6) с последующей экстракцией смесью диэтилового эфира и хлороформа (при определении бензодиазепинов), экстракция в аппарате Сокслета (толуол, при определении внешнего загрязнения экотоксикантами). Недостатки способа
- в использовании органических растворителей и в низких степенях
извлечения. При этом для анализа также используется малая часть
экстракта.
В последние годы возник интерес к сверхкритической флюидной экстракции (СФЭ) как к альтернативе классическим методам экстракции веществ из биологических матриц. В качестве преимуществ этого метода можно отметить:
s желаемая селективность экстракции может быть получена варьированием таких параметров, как давление, температура, модификатор; S хорошие диффузионные качества сверхкритических флюидов
способствуют быстрому проникновению и извлечению из образца; S использование низких температур позволяет извлекать без разложения термически лабильные соединения. Также преимуществом СФЭ из волос перед другими экстракционными методами является возможность одновременной экстракции соединений, извлечение которых другими методами невозможно из-за различных условий экстракции. Так, например, при экстракции кокаина и опиатов волосы обычно подвергают щелочному либо кислотному гидролизу, а бензодиазепины в этих условиях разлагаются с образованием различных соединений (например, бензофенонов). На настоящий момент в литературе описаны методики извлечения органических соединений (опиатов, кокаина, метадона, каннабиноидов, бензодиазепинов и барбитуратов), не включающие разложение волос.
Сверкритическую флюидную экстракцию органических соединений из волос обычно проводят, ограничиваясь 1-2 классами заданных соединений, при анализе лишь малой (0.001-0.01) части экстракта. Также встречаются редкие работы по определению некоторых экотоксикантов в волосах, но вопрос определения всех неизвестных органических соединений, включая экотоксиканты, в волосах с использованием СФЭ из волос и анализа всего экстракта в литературе не рассматривался.
После экстракции производят определение соединений с помощью иммуноферментативных методов, ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, ГХ-МС ВЭЖХ-МС. Основная сложность при этом заключается в низком содержании определяемых соединений - на уровне нг/мг, иногда - пг/мг.
8 ВЭЖХ и капиллярный электрофорез для определения органических соединений в волосах используются крайне редко ввиду низкой чувствительности и недостатком достоверности определения, иммуноферментативные методы обычно используются как скриннинговые из-за малой точности на данном уровне концентраций, и даже хромато-масс-спектрометрические методы зачастую ограничены применением "режима сбора отдельных ионов" в целях достижения большей чувствительности. Использование всего экстракта для анализа является одним из возможных путей решения данной проблемы.
Необходимо отметить, что в литературе отсутствуют работы по изучению состава неизвестных среднелетучих примесей, присутствующих в волосах. Кроме того, нет единого мнения о степени извлечения соединений, принадлежащих к различным классам, при использовании известных методов извлечения. Поэтому актуально исследование возможности обнаружения различных классов органических соединений, присутствующих в волосах, и их идентификации.
Целью настоящей работы являлось разработка способа определения состава среднелетучих органических соединений, присутствующих в волосах человека, основанного на СФЭ без использования растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта, и его сопоставление с существующими способами выделения примесей из волос и их определения.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Исследовать зависимости сверхкритической флюидной экстракции из волос от давления и температуры, а также от времени экстракции;
Разработать способ определения среднелетучих органических соединений различных классов в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и последующем ГХ-МС анализе всего экстракта;
В оптимальных условиях провести анализ волос различных людей с использованием перевода всего экстракта в ГХ-МС путем термодесорбции;
Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при использовании экстракции из волос органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта;
Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей экстракцией из реакционной смеси органическими растворителями с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта;
Провести сравнение результатов анализа волос при использовании разработанного способа и при разложении волос с последующей СФЭ из реакционной смеси и анализом всего экстракта методом ГХ/МС.
Научная новизна работы:
Исследована зависимость степени извлечения среднелетучих органических соединений из волос методом СФЭ без использования растворителя от времени экстракции, температуры и давления сверхкритического флюида;
В результате проведенных исследований разработан способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на сочетании СФЭ из волос с хромато-масс-спектрометрическим анализом всего экстракта без использования органических растворителей;
Исследован состав среднелетучих органических соединений в волосах различных людей при использовании разработанного способа определения. Диапазон содержаний определяемых соединений составил 0.002 - 99.6 нг/мг волос. Показано, что состав экстрагированных соединений и их количества схожи для различных образцов волос. В основном, различия между образцами волос проявляются на уровне менее 1 нг/мг волос;
Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных из одного из образцов волос жидкостной экстракцией без разложения и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным
10 способом. При использовании разработанного способа обнаружено 214 соединений, при использовании экстракции метанолом - 43, при этом 28 соединений обнаружено обоими способами. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании разработанного способа составило 223 нг/мг волос, при использовании экстракции метанолом - 123 нг/мг волос;
Исследован состав среднелетучих соединений, выделенных жидкостной экстракцией дихлорметаном из реакционной смеси после разложения волос и проведено сопоставление с данными, полученными разработанным способом. При использовании ЖЖЭ зарегистрировано 36 соединений, из них 11 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании экстракции дихлорметаном из реакционной смеси составило 37 нг/мг волос;
С использованием ГХ/МС и анализа всего экстракта исследован состав органических соединений, выделенных сверхкритической флюидной экстракцией без использования органического растворителя из реакционной смеси, полученной щелочным разложением волос, и проведено сопоставление с составом примесей, полученных при использовании разработанного способа, основанного на СФЭ из волос и ГХ/МС анализе всего концентрата. Обнаружено 151 соединение, из них 47 входят в число соединений, выделенных СФЭ из волос. Суммарное содержание извлеченных соединений при использовании СФЭ из реакционной смеси составило 188 нг/мг волос;
Показано, что в состав исследованных экстрактов входили соединения, принадлежащие к таким классам соединений, как алифатические углеводороды, альдегиды, кетоны, спирты, карбоновые кислоты и их эфиры. Наряду с ними в состав всех исследованных образцов волос входили различные фталаты, которые относятся к стойким органическим загрязнителям (СОЗ), подлежащим обязательному контролю.
Практическая значимость работы: Разработан способ определения неизвестных среднелетучих органических соединений в человеческих волосах на уровне 0.001 - 100 нг/мг волос, основанный на СФЭ из волос, улавливании соединений из потока СФ в сорбционный картридж, термодесорбции в газовый хроматограф и ГХ-МС анализе всего экстракта. Результаты работы использованы на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова. С использованием разработанного способа проведено определение состава среднелетучих органических соединений в волосах различных людей. Показано, что наиболее полная информация о составе неизвестных среднелетучих примесей в волосах может быть получена при сочетании различных способов выделения, рассмотренных в работе. Результаты работы могут быть использованы для оценки загрязненности внутренней среды организма человека стойкими органическими загрязнителями, а также для в медицине для ранней диагностики различных заболеваний путем определения в волосах соединений-маркеров заболеваний.
На защиту выносятся следующие положения:
Результаты исследования зависимости степени извлечения органических соединений методом СФЭ из волос без использования органических растворителей от параметров эксперимента.
Способ определения среднелетучих органических соединений в человеческих волосах, основанный на СФЭ из волос и хромато-масс-спектрометрическом анализе всего экстракта без использования органических растворителей.
Результаты определения среднелетучих органических соединений в волосах различных людей, полученные с использованием разработанного способа.
Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на
экстракции органическим растворителем из волос с последующим ГХ/МС анализом малой части экстракта.
Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и общепринятого способа, основанного на разложении волос раствором NaOH, жидкостной экстракции из реакционной смеси органическим растворителем и ГХ/МС анализе малой части экстракта.
Результаты сопоставления состава среднелетучих органических соединений, обнаруженных в волосах при использовании разработанного способа и предложенного нами способа, основанного на разложении волос раствором NaOH, прямой СФЭ из реакционной смеси без использования органического растворителя и ГХ/МС анализе всего экстракта.
Апробация работы:
Результаты работы были представлены на Тринадцатой европейской конференции по аналитической химии Euroanalysis XIII (Саламанка, Испания, 2004 г), на Втором международном симпозиуме по разделению и концентрированию в аналитической химии и радиохимии (Краснодар, Россия, 2005 г), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005 г.), на Двадцать восьмом международном симпозиуме по газовой хроматографии и капиллярному электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005 г.).
Публикации:
По материалам диссертации опубликовано 6 работ в виде статей и тезисов докладов.
Структура и объем работы:
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель работы, задачи, научная новизна, практическая значимость и положения, выносимые на защиту. Первая глава представляет собой литературный обзор методов анализа волос на
13 содержание следовых количеств заранее заданных органических соединений. Основное внимание уделено рассмотрению общепринятых методов пробоподготовки, используемых при анализе волос, их возможностям и ограничениям с точки зрения определения следовых количеств органических соединений различных классов. Рассмотрены ключевые источники существующих ограничений общепринятых методов пробоподготовки. В этой же главе рассматривается состояние одного из перспективных вариантов пробоподготовки, развивающихся сегодня -сверхкритической флюидной экстракции. Особое внимание уделяется основному источнику ограничений метода - способам улавливания соединений из потока сверхкритического флюида, рассматриваются их достоинства и недостатки. Здесь же дается критическая оценка состоянию дел в области использования СФЭ при определении следовых содержаний органических соединений в волосах.
Во второй главе описывается оборудование и методика эксперимента. В третьей главе представлены результаты разработки способа определения среднелетучих органических соединений в волосах, основанного на сочетании СФЭ из волос с газохроматографическим анализом всего экстракта. Приведены результаты исследования условий сверхкритической флюидной экстракции из волос соединений, присутствующих в экстракте в наибольших концентрациях. В четвертой главе представлены результаты использования разработанного способа для анализа ряда образцов волос. В пятой главе представлены результаты использования различных способов анализа волос, а также проведено сопоставление с результатом, полученным при использовании разработанного способа.
В заключении проводится обобщение полученных результатов и рассматриваются возможности дальнейшего развития предлагаемого метода.
Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 31 рисунок, 22 таблицы и список литературы из 123 наименований.
Способы улавливания органических соединений из потока сверхкритического флюида
Различные химические вещества могут попадать в волосы двумя путями - из организма (включение во внутреннюю структуру волос в процессе их роста - соединения, попавшие в волосы таким путем, называют эндогенными) и напрямую из окружающей среды (сорбция из атмосферы, из воды при купании, из шампуней и т.д. - экзогенные соединения). Количество сорбированных веществ может сильно варьироваться в зависимости от их концентрации в окружающей среде -причем вплоть до диффузии во внутреннюю структуру волос при больших концентрациях [1]. Однако в большинстве случаев определяются соединения, попавшие в волосы из организма - наркотические и медицинские препараты, стероиды, экотоксиканты и др. Задача определения соединений, попавших в волосы таким путем, осложнена наличием огромного числа факторов, влияющих на концентрацию различных соединений в волосах. Так, различные соединения при одинаковых концентрациях в крови могут отличаться по содержанию в волосах в сотни, иногда в тысячи раз. Для исключения этого фактора вводят коэффициент перехода соединений в волосы, равный отношению концентрации соединения в волосах к площади кривой концентрация в плазме крови - время (Area under the plasma-concentration curve, AUC). Так, в работе [2] определялись коэффициенты перехода 20 веществ различных классов в волосы. Крайние значения коэффициента составили 3.6 для кокаина и 0.001 для 11-нор-тетрагидроканнабинол-9-карбоновой кислоты. Эти коэффициенты приблизительны, так как содержание органических веществ в волосах зависит от скорости роста волос. В среднем, скорость роста волос в верхней части головы составляет 0.38-0.48 мм в день для мужчин и 0.4-0.55 мм для женщин (однако, может варьироваться для людей различного возраста, расы и т.д). В целом можно предсказать большие значения коэффициента перехода для основных соединений, чем для кислотных. Причина подобного феномена в том, что рН волос близок к 6 (однако даже цвет волос имеет значение - у темных волос рН немного меньше, чем у светлых, соответственно, темные волосы включают в свою структуру основные соединения эффективнее, чем светлые, и наоборот, светлые волосы включают в свою структуру кислотные соединения эффективнее, чем темные). Также возможны потери соединений при повреждении волос (вследствие отбеливания, завивки и других косметических воздействий). Так, в работе [3] при определении опиатов в волосах, подвергавшимся косметическим воздействиям и УФ-облучению, в некоторых случаях фиксировали падение содержания определяемых веществ ниже предела обнаружения (в 100-1000 раз относительно начального содержания).
Концентрации различных соединений в волосах также могут зависеть от множества других факторов, таких, как пол, возраст, раса, рацион питания и др., поэтому возможно лишь приблизительное предсказание содержания соединений в организме при анализе волос. Также это причина, по которой можно проводить многократные анализы только для волос одного человека, либо проводить статистические анализы (соответственно, сравнение между собой результатов анализов волос различных людей также относительно). В целях достижения хорошей воспроизводимости результатов анализа пробоотбор следует проводить из одной области тела (обычно - из затылочной части головы, в случае отсутствия либо слишком малой длины - из подмышечных либо паховых областей), на одном расстоянии от основания волос (особенно важно для секционного анализа волос), в количестве не менее 200-250 мг (однако, из эстетических соображений, в некоторых случаях количество может быть уменьшено до 10-50 мг).
Необходимость первоначальной промывки волос связана со степенью загрязнения образца, селективностью последующего метода определения и решаемой в данной работе проблемой. Обычно в волосах определяют соединения, которые попали в волосы из организма (эндогенные соединения), т.е. включенные во внутреннюю структуру волос. Для удаления мешающих соединений и во избежание ложных положительных результатов необходимо сначала очистить волосы от внешних загрязнителей (т.е. соединений, сорбированных на поверхности волос), а также жировых и потовых выделений. При использовании высокоселективных метдов анализа (ВЭЖХ-МС-МС [4, 5], ГХ-МСВР [6]) стадией очистки зачастую пренебрегают. Наибольшее количество способов очистки волос исследовалось для определения кокаина в волосах.
Применяются три типа жидкостей (детергентов) для отмывания волос от внешних загрязнений - растворы поверхностно-активных веществ в воде (табл. 1), гидрофильные органические растворители (табл. 2) и гидрофобные органические растворители (табл. 3). Иногда в процессе очистки волос используются последовательно несколько типов детергентов (табл. 4). Среди поверхностно-активных веществ чаще всего используется додецилсульфат натрия (0,1-5% раствор в воде).
Большинство работ, связанных с изучением изменениея концентрации содержащихся в волосах соединений в результате внешних загрязнений, проводилось с использованием растворов ДСН в качестве средства для промывания волос. Так, в работе [1] определяли эффект удаления внешних загрязнений 0,1% ДСН под действием ультразвука. Волосы предварительно выдерживали в водном растворе метамфетамина 24 часа. Определили, что при концентрации метамфетамина в водном растворе 10 мкг/мл волосы легко очищаются 0.1% ДСН, а при концентрации метамфетамина в водном растворе более 20 мкг/мл можно определить его в волосах даже после длительного промывания.
Экстракция органических соединений из волос метанолом
Так как существует два подхода к извлечению органических соединений из волос - с разложением волос и без разложения - то способы экстракции также делятся на две группы - экстракция из раствора, полученного после разложения волос, и экстракция непосредственно из волос. При этом в первом варианте возможны различные методы экстракции из водного раствора - жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ), твердофазная экстракция (ТФЭ), твердофазная микроэкстракция (ТФМЭ) и сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ). В большинстве работ используется метод ЖЖЭ, второй по популярности - метод ТФЭ, третий - ТФМЭ. Работ по СФЭ из раствора после разложения волос в литературе не найдено.
Во втором варианте возможны различные способы экстракции из твердой матрицы - жидкостная экстракция, в том числе экстракция в аппарате Сокслета, экстракция в ультразвуковом либо микроволновом поле, либо сверхкритическая флюидная экстракция. Наиболее популярна традиционная экстракция в течение длительного времени (2-72 ч), вторая по популярности экстракция в ультразвуковом поле, затем идет экстракция в микроволновом поле. В последнее время появились также работы, в которых используется метод СФЭ, но эти работы крайне немногочисленны.
Наиболее распространенным способом экстракции из раствора после разложения волос является ЖЖЭ. При этом перед экстракцией в зависимоси от класса определяемых соединений может проводиться нейтрализация водного раствора.
После экстракции в ряде случаев проводят очистку раствора с помощью ТФЭ с последующим элюированием определяемых соединений. Так, в работе [82] при определении пестициов (ДДТ, ДДЭ, ДДД, ПАУ, ПХБ) в волосах жителей различных стран (Греция, Италия, Бельгия) навески (200 мг) волос помещали в колбу с 2 мл ЗМ HCI и оставляли на ночь при температуре 40С. Затем дважды проводили экстракцию смесью гексан/СН2С12 (4/1, 3 мл), органические фазы объединяли и внесли в картридж, заполненный последовательно (от дна) 250 мг деактивированного оксида алюминия 70-230 Меш (10% воды), 500 мг подкисленного силикагеля 60-200 Меш (27 мл конц. H2S04 на 50 г силикагеля), 250 мг безводного Na2S04 и предварительно промытый 3 мл гексана. Определяемые соединения элюировали 4 мл гексана, элюат упарили до 50 мкл. Объем введенной в ГХ-МС пробы составлял 2 мкл. Предел обнаружения различных пестицидов составил 0.3-2 нг/г волос при степени извлечения 85%.
Иногда очистку проводят перед экстракцией - так, в работе [22] при определении полиаминов после разложения с помощью ЗМ раствора соляной кислоты провели экстракцию н-пентаном. При этом из водной фазы удалялись только мешаюшие соединения, а полиамины при низком рН находились в протонированном состоянии, и эффективность их экстракции была крайне низка. После этого рН повысили до 11-12 добавлением 2М раствора NaOH и экстрагировали полиамины 1 мл диэтилового эфира, содержащего 20 мкл этилхлороформиата.
Недостатком ЖЖЭ является необходимость использования больших объемов токсичных, а часто и горючих органических растворителей. Кроме того, их чистота редко превышает 99.7 %, и при упаривании происходит концентрирование примесей из растворителя, что приводит к искажению состава пробы. В ряде случаев для извлечения определяемых соединений из раствора после разложения волос используют твердофазную экстракцию (ТФЭ). Этот метод удобен тем, что есть возможность совместить экстракцию с очисткой от мешающих соединений, промыв картридж с сорбированными соединениями растворителем, элюирующим мешающие соединения, но не смывающим определяемые соединения. Так, в работе [66] при определении декстропропоксифена и норпропоксифена волосы (50 мг) разлагали HCI (700 мкл 0.1 М раствора) в течение 18 часов при температуре 56С, затем нейтрализовали 120 мкл 1М NaOH, оставили на 5 минут, затем прибавили 1 мл бикарбонатного буфера (рН 8.6) и поместили в картридж, заполненный 100 мг силикагеля с привитой фазой С18, предварительно промытый 2 мл метанола и 1 мл бикарбонатного буфера. Картридж промыли дважды 0.5 мл воды и 0.5 мл 10% метанола, затем картридж высушили, продувая воздух в течение 10 минут. Определяемые соединения элюировали 600 мкл 0.5% раствора уксусной кислоты в метаноле, раствор упарили, остаток растворили в 40 мкл метанола. Для последующего хромато-масс-спектрометрического определения использовалось 2 мкл раствора. Предел обнаружения составил 0.05 нг/мг для декстропропоксифена и 0.04 нг/мг для норпропоксифена. Степени извлечения составили 86.5% для декстропропоксифена и 85.2% для норпропоксифена.
Очистка особенно актуальна в случае ферментативного разложения волос - при этом очистка в процессе ТФЭ особенно эффективна - во многих работах при ТФЭ после ферментативного разложения картридж с сорбированными соединениями в целях очистки дополнительно не промывают - по всей видимости, крупные молекулы ферментов не элюируются при вымывании определяемых соединений и остаются в картридже.
Исследование зависимости степени извлечения от давления флюида
Жидкостную экстракцию без разложения волос удобнее всего использовать для определения экзогенных соединений (чаще всего -пестициды либо другие экотоксиканты, окислительные компоненты шампуней), однако существует множество примеров применения жидкостной экстракции для извлечения эндогенных соединений. Степени извлечения эндогенных соединений при этом ниже, чем в случае предварительного разложения волос, однако сильно уменьшается количество мешающих соединений, образовывающихся в результате разложения структуры волос. Существует два метода жидкостной экстракции из волос - экстракция органическими растворителями и экстракция различными буферами (чаще всего - фосфатными). Широко применяется экстракция в аппарате Сокслета и экстракция в ультразвуковом поле. Гидрофильные соединения извлекаются из волос тяжелее, чем гидрофобные, поэтому в ряде случаев степени извлечения гидрофильных соединений бывают настолько малы, что после экстракции органическим растворителем гидрофобных соединений оставшиеся волосы разлагают и извлекают гидрофобные соединения. Так, в работе [62] при одновременном определении анаболических стероидов и их эфиров очищенные волосы измельчили, прибавили 1.5 мл МеОН и проводили экстракцию под действием ультразвука в течение 2 часов при температуре 50С, затем центрифугировали и декантировали. Таким способом извлекли эфиры анаболических стероидов. Оставшиеся волосы разлагали при помощи 2 мл 1М NaOH, затем экстрагировали 2 мл этилацетата. Метанольную фракцию упарили и растворили в 2 мл 0.005М NaOH, экстрагировали 2 мл этилацетата, затем фракции этилацетата (после экстракции метанолом и после разложения) объединили, очищали на картридже NH2 500 мг/3 мл (Isolute), смыли 1 мл этилацетата, затем на картридже Silica 500 мг/3 мл (Isolute), смыли 1 мл хлороформа (эфиры) и 2 1 мл хлороформ/этилацетат (3/1), упарили, прибавили 20 мкл N-метил-Ы-триметилсилилтрифторацетамида и выдерживали в течение 20 минут при температуре 80С. Для последующего хромато-масс-спектрометрического определения в режиме селективного ионного детектирования использовали 2 мкл раствора. Степени извлечения составили 61 - 94% для стероидов и 77 - 81% для их эфиров при концентрациях 20 - 50 пг/мг. Пределы обнаружения составили 0.07 - 6.20 пг/мг для стероидов и 0.86 - 4.8 пг/мг для их эфиров. Основные недостатки жидкостной экстракции органических соединений из волос без предварительного разложения - в использовании больших объемов органических растворителей, а также в большом времени экстракции(обычно 16-72 часа, реже -1-4).
Сверхкритическая флюидная экстракция (СФЭ) основана на экстракции органических соединений из различных матриц сверхкритическим флюидом (СФ). Сверхкритический флюид - состояние вещества при температурах и давлениях выше критических. В качестве СФ используются различные соединения - С02, N20, CH3CI, CH2CHF, NH3 (CH3)2NH, CHF3, CCI2F2) CCIF3, SF6, CO [97], CH2CICH2CI, CHCI2CH2CI, CCL2CCL2 [98] и др., но чаще всего используется С02 благодаря своей нетоксичности и негорючести, т.е. возможности декомпрессирования в атмосферу. Преимуществом использования СФЭ с С02 в качестве флюида, перед классическими экстракционными методами, является возможность уменьшить количество примесей путем использованияС02 в особо чистом состоянии (чистота более 99.996%), тогда как в органических растворителях чистота редко превышает 99.7%. Экстрагируемые вещества легко отделить от флюида путем резкого снижения давления. Далее, С02 можно декомпрессировать в атмосферу - он нетоксичен, негорюч. СФЭ также легко сочетается с такими высокочувствительными методами определения, как капиллярная газовая и сверхкритическая флюидная хроматография с различными вариантами детектирования (пламенно-ионизационное, электроно-захватное и масс-спектрометрическое детектирование).
При анализе волос выявляется еще одно преимущество СФЭ перед классическими методами - уменьшение времени экстракции. Так, методы извлечения органических соединений из волос, основанные на щелочном либо кислотном разложении, требуют нескольких часов выдерживания волос в щелочном либо кислом растворе - а уменьшение времени разложения путем повышения температуры может привести к разрушению определяемых соединений. Методы экстракции без разложения волос требуют 16-18 часов выдерживания в экстрагенте, хотя время экстракции может быть сокращено до 1 - 2 часов при помощи экстракции в ультразвуковом поле. Экстракцию сверхкритическим флюидом проводят в течение 10-30 минут.
Для СФЭ возможна селективная экстракция благодаря зависимости растворяющей способности от давления. Существует мнение, что сверхкритический С02 имеет растворяющую способность, схожую с растворяющей способностью углеводородов - гексана, гептана и др. [99]. Это свойство ограничивает круг веществ, экстрагируемых С02, неполярными соединениями. Модификация С02 небольшим количеством (1 - 20 %) органического растворителя (обычно МеОН или Н20) резко увеличивает полярность СФ, что приводит к расширению круга экстрагируемых веществ. Большинство работ по СФЭ из волос посвящено определению опиатов - при этом изначально использовались смеси C02/MeOH/Et3N (90/8,5/1,5) [100], а позднее - C02/MeOH/Et3N/H20 (85/6/6/3) [92, 101]. При экстракции полярных соединений модифицированным СФ низкая полярность чистого СОг может обернуться преимуществом, так как существует возможность дополнительной очистки волос от мешающих неполярных соединений, попавших в волосы эндогенным путем (что невозможно при стандартной очистке волос органическими растворителями перед экстракцией). Так, в работе [102] очищенные и измельченные волосы (50 мг) поместили в 7-мл экстракционную ячейку и провели дополнительную очистку от мешающих эндогенных соединений, пропуская С02 (0.68 г/мл, 100С) 10 минут в статичном и 15 в динамическом (2 мл/мин) режимах. После этого в ячейку поместили 1 мл смеси MeOH/Et3N/H20 (2/2/1) и 200 нг внутреннего стандарта (кодеин-сіз, морфин-сіз, 6-моноацетилморфиH-d3) и проводили экстракцию в течение 20 минут улавливанием на сорбент (Тепах). С сорбента определяемые соединения элюировали 1.8 мл хлороформа, упарили и провели химическую модификацию, прибавив 30 мкл БСТФА (1% ТМСХ) и выдерживая при 70С в течение 20 минут. Для последующего хромато-масс-спектрометрического определения в режиме селективного ионного детектирования использовали 1 мкл раствора. Степени извлечения составили 61%, 53%, 96%, пределы обнаружения -0.3, 0.2, 0.1 нг/мг для кодеина, морфина и 6-моноацетилморфина, соответственно.
Разложение волос при помощи 1МNaOH с последующей сверхкритической флюидной экстракцией из полученного раствора
Существуют два основных способа улавливания определяемых веществ из СФ - улавливание в органический растворитель и улавливание в сорбционную ловушку. В первом случае СФ после экстракции в процессе декомпрессии пропускается через небольшой объем (2 - 10 мл при потоке газа 250 - 500 мл/мин) органического растворителя (МеОН, гексан, дихлорметан, толуол, ацетонитрил), который потом может быть упарен до 0.5 - 1 мл [103-106]. Для последующего хроматографического анализа используется около 1 мкл экстракта.
Так, в работе [101] при определении опиатов волосы (50 мг) поместили в ячейку объемом 430 мл и экстрагировали смесью C02/MeOH/Et3N/H20 (85/6/6/3) 30 минут при температуре 40С и скорости потока 0.7 мл/мин. Улавливали в растворитель, упарили, прибавили 100 мкл пиридина иЮО мкл пропанового ангидрида, выдерживали 30 мин при температуре 60С, упарили, растворили в 50 мкл этилацетата. Для последующего хромато-масс-спектрометрического определения в режиме селективного ионного детектирования использовали 1 мкл раствора. Степень извлечения составила 93.5%, предел обнаружения - 0.1 нг/мг.
Во втором случае случае СФ после экстракции в процессе декомпрессии пропускается через сорбционную ловушку. В качестве сорбентов используют силикагель, Флорисил, Порапак Q, стеклянные или металлические шарики, а также смеси этих материалов [107-109]. В некоторых случаях экстрагированные вещества улавливают с помощью капилляра с нанесенной на него неподвижной фазой [110,111]. После улавливания определяемые вещества смываются с помощью небольшого количества органического растворителя (1 - 4 мл ацетонитрила [106], метанола [112], этилацетата [113], смеси гексан/хлороформ 4:1 [114]).
Существуют также две возможности улавливания определяемых веществ без использования растворителя: - сбор экстракта в режиме "on line", когда экстрактор непосредственно соединен с прибором для анализа экстракта (ГХ, СФХ, редко ЖХ). Основные недостатки такого метода - трудность улавливания всего экстракта на предколонке, ограничение скорости потока газа или СФ (соответственно, ограничение скорости экстракции в целом), размывание хроматографических пиков, иногда - необходимость деления потока [115]. - сорбирование экстракта в сорбционную ловушку и перевод всего вещества в газовый хроматограф с помощью термодесорбции. Этому направлению посвящен ограниченный ряд работ, так как метод разработан сравнительно недавно, и имеющиеся работы посвящены СФЭ неполярных и слабополярных соединений из вод и почв [116-121]. Это направление является перспективным благодаря отсутствию органических растворителей и возможности анализировать весь экстракт. Таким образом, оптимальным методом извлечения органических веществ из волос является СФЭ с улавливанием экстрагированных веществ в сорбционную ловушку и последующим переводом всего вещества в газовый хроматограф с помощью термодесорбции. Существует ряд причин, по которым химическая модификация гидрофильных групп определяемых веществ желательна, а иногда и необходима:
Повышение степени извлечения определяемых соединений. По существующему правилу "подобное растворяется в подобном" гидрофильные соединения, содержащие гидрофильные функциональные группы, хорошо растворяются в протонных полярных растворителях и плохо - в апротонных и неполярных. Химическая модификация гидрофильных групп увеличивает растворимость в неполярных веществах (в органических растворителях и сверхкритических флюидах) [122].
Селективное выделение определяемых веществ из различных матриц. Так, чтобы добиться приемлемой степени извлечения, сверхкритический С02 модифицируют органическими растворителями (или увеличивают их содержание в СФ). При этом начинают экстрагироваться различные полярные примеси, которые в случае химического модифицирования определяемых соединений экстрагироваться не будут [99]. Необходимо только правильно подобрать реагент, с которым определяемые вещества будут реагировать, а с мешающими примесями - нет (т.е. реагент должен быть селективным по отношению к определяемым веществам).
Повышение летучести. Для газохроматографического определения необходимым условием является летучесть определяемых веществ. Полярные соединения, содержащие подвижные протоны или протоноакцепторные группы (карбоксильные, гидроксильные, амино- и тиогруппы), имеют низкую летучесть из-за тенденции к самоассоциации, ассоциации с полярной жидкостью или твердой гидрофильной фазой через образование водородных связей. Химическая модификация снижает протонодонорные и протоноакцепторные свойства гидрофильных групп, исключая образование водородных связей, повышая таким образом летучесть определяемых соединений [122].
Повышение чувствительности детектора. Химическая модификация функциональных групп определяемых соединений может привести к веществам, по отношению к которым чувствительность различных детекторов будет выше, чем к исходным соединениям. Так, перевод соединений в галогенопроизводные может повысить чувствительность таких детекторов, как детектор электронного захвата, масс - спектроскопия отрицательных ионов. С помощью химической модификации можно также получить из определяемых соединений, не обладающих свойствами, необходимыми для некоторых детекторов (УФ - детектор, флуорометрический детектор), соединения, обладающие этими свойствами [122].
Обычно в случае ЖЖЭ химическую модификацию проводят после упаривания экстракта, в случае ТФЭ - после упаривания элюата, в случае СФЭ - упаривают растворитель, в который проводили улавливание из потока флюида [100] либо которым смывали соединения с сорбента, на который производили улавливание [102].
