Содержание к диссертации
Введение
1. Трансферрины в метаболизме железа 9
2. Структура и эволюция трансферрина 36
3. Медицинские аспекты изучения трансферрина 62
4. Материалы и методы исследования 69
5. Выделение и очистка трансферрина крысы 83
6. Физико-химические свойства трансферрина крысы 99
6.1. Молекулярная масса 101
6.2. Изоэлектрические точки 101
6.3. Спектр абсорбции 103
6.4. Седиментационное поведение У.-І 103
6.5. Аминокислотный состав трансферрина 105
6.6. №- концевые аминокислотные остатки белка 105
6.7. Получение моноспецифических антител к трансфер-рпну 106
7. Доменная организация трансферрина крысы 109
7.1. Условия насыщения трансферрина ионами железа 111
7.2. Триптический протеолиз трансферрина 113
7.3. Выделение моноферрифрагментов трансферрина 117
7.4. Физико-химическая характеристика моноферрифрагментов трансферрина 119
7.5. Внутренняя гомология моноферрифрагментов 128
8. Изучение пула трансферрина человека в норме и патологии 131
8.1. Получение препаратов трансферрина человека 132
8.2. Физико - химическое и иммунологическое сравнение траноферрина человека в норме и патологии 135
8.3. Метод количественного определения траноферрина в сыворотке крови человека 144
8.4. Количественное содержание траноферрина в норме и патологии 146
Заключение 149
- Структура и эволюция трансферрина
- Материалы и методы исследования
- Изоэлектрические точки
- Триптический протеолиз трансферрина
Введение к работе
основным переносчиком железа в организме позвоночных и донором железа для таких жизненно важных белков - гемопротеидов, как гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза и др. Трансферрин способен также подавлять развитие аэробных микроорганизмов ( Bezko-
rovainy,1980 ).
Генетические аномалии структуры и функции трансферрина могут играть важную роль в патогенезе наследственных заболеваний. Так,
при наследственной болезни - гемохроматозе выявлена как количественная недостаточность трансферрина, так и нарушение способности этого белка к связыванию ионов железа (Morgan,1974 ). Предполагается, что первичным дефектом при этом наследственном заболевании человека является мутационное изменение структуры гена кодирующего трансферрин, фенотипически проявляющееся в изменении структуры трансферрина и нарушении его способности к связыванию ионов железа. В литературе описаны и другие формы недостаточности экспрессии гена трансферрина, проявляющиеся в виде
наследственных или приобретенных гипо- или атрансферринемий (Pollycove,1972, Goya et al.,1972, Lorena et al,1974 )* Молекулярный дефект, лежащий в основе этой формы наследственной патологии, пока не выяснен.
В последние годы в связи с бурным развитием молекулярной биологии гена появилась возможность проследить взаимосвязь между структурой генов и кодируемых этими генами полипептидов, а так-
же механизмов генных перестроек, лежащих в основе эволюции. Благодаря фундаментальным работам, появившимся в последнее время,
сформировались современные представления о структурной организации трансферрина и о филогенезе этого белка у птиц (Jeltsch et al.,1982, Williams et al., 1982 ) и человека (Mazurier et al., 1983 ). По этим представлениям трансферрин является продуктом частичной дупликации предкового гена этого белка (Williams, 1982 ).
Однако, несмотря на большой фактический материал, накопленный в основном, в последние годы, целый ряд существенный вопросов
эволюции трансшерринов и кодирующих трансферрины генов остается невыясненным. Так, неясно, на какой стадии филогенеза произошла дупликация трансферрина. В то же время совершенно неизученными остаются вопросы о структурно- функциональных особенностях трансферрина млекопитающих, хотя исследования в этом направлении должны предетавить принципиальный интерес с точки зрения путей эволюции трансферрина и .других ме таяло протеидов, а также молекулярных механизмов патологии биосинтеза трансферрина при
наследственных и приобретенных заболеваниях.
Несмотря на то, что обмен железа при различных патологиях и,
в частности, при дефиците этого металла, при поражениях печени интенсивно изучается в последнее время, однако, динамика обмена
трансферрина, осуществляющего транспорт железа в организме, и его значение для диагностики тех или иных заболеваний остаются
еще малоизученными. Хотя количественное определение трансферрина при многочисленных формах патологии, включающих различные желе 3одефицитные анемии (Notelovitz et al., 1972, Rajamaki et al.,
1973, Левина и др.,1982), гепатиты и циррозы печени (Киенская, 1980, Иртьяков, 1980, Джалалов и др., I982,Vladutio et al.,
I981), при мешшгитах вирусной и бактериальной этиологии (Yura-do et а1,1982), у больных хронической почечной недостаточностью
(Mareckova et al.,1978 ), при нефрогенной анемии ( Graf et al., 1978 ) и других заболеваниях имеет несомненную диагностическую ценность. Изучение количественного содержания трансферрина приобретает большой интерес также в свете тлеющихся сведений об участии этого белка в антимикробном иммунитете ( Bezkorovainy, 1980 ), и о возможном влиянии трансферрина на репродуктивность
организмов ( Мирвис и др., 1972).
Все вышеприведенное в совокупности определяет актуальность проведенных нами исследований.
Цель и задачи работы. Целью работы являлось получение и изучение физико-химических и структурно-функциональных особенностей моноферрифрагментов трансферрина крысы, а такие характеристика пула трансферрина человека в норме и при
патологии.
В конкретные задачи работы входило:
Выделение и очистка препаратов трансферрина крысы и человека.
Физико-химическое и иммунологическое изучение трансферрина крысы.
Подбор условий насыщения трансферрина железом и протеолиза
трипсином, позволяющих расщепить молекулу трансферрина на структурно-функциональные домены.
4. Выделение структурно-функциональных доменов трансферрина,
образующихся в результате протеолиза и исследование их фи-
8 зико - химических и иммунологических свойств.
Проведение сравнительного физико-химического и иммунологического исследования трансферрина человека в норме и при патологии ( железодефицитная анемия, хронический гепатит, цирроз печени).
Разработка иммунохимического метода количественного определения трансферрина в сыворотке крови человека.
Проведение сравнительного анализа содержания трансферрина человека в норме и при патологии.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате исследовании были получены новые сведения, касающиеся доменного построения молекул трансферрина крысы. Полученные результаты позволяют предположить внутреннюю гомологию между структурно-фушщиональными доменами трансферрина, что в свою очередь, свидетельствует о происшедшей в ходе филогенеза дупликации гена этого белка. Изучение физико-химических и иммунологических характеристик трансферрина человека при ЖДА., хроническом гепатите и циррозе печени позволило получить данные, касающиеся качественного состояния этих белков при таких заболеваниях.
Разработан иммунохимический метод количественного определения трансферрина в сыворотке крови человека, основанный на принципе * радиальной иммунодиффузии в агаре. Предложенный метод отличается от других его вариантов более высоким титром антител к транс-феррину, что позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты при меньшем количестве используемой антисыворотки.
Проведенное на основе разработанного метода сравнительное изучение концентрации трансферрина позволяет рекомендовать этот показатель в качестве важного диагностического теста.
Структура и эволюция трансферрина
В последнее десятилетие в литературе опубликовано большое количество работ, посвященных изучению первичной структуры, а также исследованию более высоких уровней организации молекул сывороточного трансферрина, овотрансферрина и лактотрансферрина ( Phillips , Azari , 1971, Tsao, Azari, Phillips, 1974, Williams, 1974, 1975, MacGillivray, Brew, 1975, Metz - Boutigue et al., 1976, Brock, Arzabe, 1976, Brock et al., 1976, Joudrier , 1977, Evans, Williams, 1977, MacGillivray et al., 1977, Metz - Boutigue et al., 1978, Strickland, Hudson, 1978, Brune et al., 1978, Metz - Boutigue et al., 1981, 1982, Keung et al., 1982, Williams et al., 1982, Williams, 1982, MacGillivray et al., 1982,1983, Mazurier et al., 1983 ). Изучение аминокислотной последовательности трансферринов позволило пролить свет на структурную организацию этих белков, на процессы их филогенеза, на взаимосвязь между структурой и функцией трансферринов. В работах ( MacGillivray et al., 1977, Lineback - Zins, Brew, 1980 ) при исследовании первичной структуры сывороточного трансферрина человека было отмечено, что необходимо различать и -и С - концевые части в молекуле человеческого трансферрина, которые при сравнении их аминокислотных последовательностей оказываются в значительной степени гомологичными. Сравнение аминокислотных последовательностей N - и С - концевых частей молекулы серотрансферрина показывает, что почти 40$ аминокислотных остатков в них идентичны. В настоящее время известна полная аминокислотная последовательность сывороточного трансферрина человека ( 678 остатков ) ( MacGillivray et al., 1982 ), извес- тна также и полная структура овотрансферрина птиц ( 686 остатков ) ( Williams et al., 1982, Jeltseh , Chambon, 1982 ). В работах ( Metz - Boutigue et al., 1981,1982) исследовано 75% первичной структуры лактотрансферрина человека. Для всех трех типов трансферрина : серотрансферрина, овотрансферрина и лактотрансферрина отмечен феномен внутренней структурной гомологии ( Abernethy et al., 1980, MacGillivray et al., 1977,1982, Metz - Boutigue et al., 1978,1981, Williams et al.,1982 ). Исследования по кристаллографии трансферрина ( Gorinsky et al.,1978), а также эксперименты по ограниченному протеолизу трансферрина ( Y/illiams,1974, Brock,Arzabe, 1976, Evans,Williams,1977 ) Показали, что каждая полипептидная полуцепь этого белка складывается в больщуіо автономную компактную белковую субструктуру или домен. При этом в каждом домене обнаруживается специфический железосвязывающий центр. Характерной особенностью каждого домена является также то, что дисульфидные связи, стабилизирующие молекулу трансферрина, локализованы внутри N - и С -концевого доменов, между доменами белка не существует дисуль- фидных мостиков.
В более ранных работах, посвященных исследованию первичной структуры трансферрина, делался вывод о возможной дупликации или удвоения аминокислотной последовательности этого белка. Ряд полученных экспериментальных данных свидетельствовал, казалось бы, в пользу такой точки зрения. Так, исследование сигналов ЭПР указывает на присутствие в молекуле трансферрина двух идентичных металлосвязывающих центров ( Aasa,Aisen,l968). Далее, Jamieson,1971 были выделены из сывороточного трансферрина человека две идентичные углеводные цепи, что допускает также возможность того, что молекула трансферрина состоит из дуплицированных сегментов. Хорошо объясняли феномен дупликации первичной структуры трансферрина результаты экспериментов по полному триптическому гидролизу трансферрина, из которых видно, что при исчерпывающем гидролизе трансферрина человека, кролика и цыплят количество пептидов, определенное методом пептидных карт, оказывается гораздо меньше теоретически ожидаемого. Например исходя из аминокислотного состава человеческого трансферрина, при полном триптическом гидролизе следует ожидать выхода 76 пептидов, в том числе, если полипептидная цепь трансферрина не имеет повторяющихся последовательностей. Однако в эксперименте при проявлении пептидных карт обнаруживается не более 54 окрашенных нингидрином пятен. При этом картина не менялась при варьировании времени гидролиза и использовании различных систем растворителей имеющих целью исключить артефакты ( Mann et al., 1970 ). В дальнейшем более строгие доказательства дупликации первичной структуры овотрансферрина были получены ( Pnil ips, Azari, 1971 ), использовавшими цианогенбромид для расщепления овотрансферрина. При разделении гидролизата колоночной хроматографией эти исследователи получили максимально четыре бромциановых фрагмента, т.е. в четыре раза меньше теоретически ожидаемого.
При характеристике полученных фрагментов получалось, что их суммарная молекулярнвя масса составляет примерно половину молекулярной массы нативной молекулы овотрансферрина. Исходя из полученных результатов, эти авторы предложили модель белка с удвоенной аминокислотной последовательностью. Однако в дальнейшем появились работы, которые находились в несогласии с той моделью, которую предложили Phillips и Azari для молекулы овотраноферрина, а также с их гипотезой об эволюции такого типа белков. Так, Hudson et ai.,1973 определили только одну углеводную цепь в молекуле бычьего трансферрина,аналогичный результат был получен несколько ранее ( Williams , 1968 ) для овотраноферрина. При гидролизе трансферрина человека цианогенбромидом ( Bezkorovainy,Grolich,1972 ) получили все шесть фрагментов бромцианового расщепления. При этом суммарная молекулярная масса этих фрагментов была равна молекулярной массе нативного трансферрина. Более того, поздние работы ( Tsao, Azari,Phillips,1974 ) по изучению бромциановых фрагментов овотраноферрина такне не подтвердили их первоначальную модель этого белка с дуплицированной первичной структурой. В настоящее время в литературе существует гипотеза доменной структуры трансферрина, которая базируется на результатах рент-геноструктурного анализа этого белка ( Gorinsky et ai.,1979 ) и экспериментов по частичному протеолизу трансферрина. Каждый домен имеет независимый один от другого металлосвязывающий центр (Aisen,Listowsky,i980 ). Домены могут быть получены в результате ограниченного протеолиза, без заметных изменений спектроскопических свойств железосвязывающих центров ( Butterworth et al., 1975, Brock,Arzabe, 1976, Keung et al., 1982 )(Бу-гланов, Салихов, 1983 ). Железосвязывающие центры, находящиеся в двух доменах трансферрина, в значительной степени автономны, избирательная денатурация одного из них не влияет на способность другого центра обратимо связывать ионы железа (Aisen,Lis towsky, 1980, Evans, Williams, 1980 ). В самые последние годы опубликован ряд фундаментальных работ, посвященных изучению первичной структуры лактотрансферрина (Metz - Boutigue et al.,1978,1981, Mazurier et al., 1983 ), серотрансферрина ( MacGillivray et al., 1982,1983 ) и овотранс- феррина ( Williams et al., 1982, Jeltsch, Chambon, 1982 ). В 1975 году MacGillivray, Brew впервые опубликовали свои исследования по первичной структуре полученных бромциа- новых фрагментов траноферрина человека. В их работе проанализирована и сопоставлена аминокислотная последовательность девяти пептидных фрагментов серотрансферрина, полученных после исчерпывающего гидролиза бромцианом. При сравнительном анализе бром-циановых фрагментов, обозначенных си-1 ( пептид с молекулярной массой около 25 000 дальтон, лежащий в С - концевой части нати вного траноферрина ) и CN-7, CN-9, сж-4 : было показано, что определенные участки их аминокислотных последовательностей гомологичны.
Материалы и методы исследования
В экспериментах были использованы белые беспородные крысы - самцы весом около 150 - 200 г. Крыс предварительно наркотизировали внутрибрюшинным уколом I мл 1% раствора гексенала, приготовленного на физиологическом растворе. Кровь отбирали уколом в сердце в область предсердий в количестве примерно 20 - 25 мл. Кровь переносили в сухой центрифужный стакан и выдерживали в течение I часа при 37 С в термостате. После ретракции ( сжатия ) сгустка отбирали сыворотку низкоскоростным центрифугированием при 3 000 об/мин в течение 30 мин. Повторным центрифугированием при 6 000 об/глин в течение 20 мин освобождались от остатков эритроцитов. Сыворотку хранили при -20 С до использования. Донорскую кровь человека получали из Института гематологии и переливания крови МЗ УзССР. Кровь выдерживали в холодильнике при температуре + 4С в течение 12 часов. Сыворотку отсасывали, центрифугированием при 6 000 об/мин в течение 20 мин освобождались от остатков эритроцитов и хранили при - 20С до использования. Кровь больных с заболеваниями кроветворной системы и печени также получали из НИИГиПК МЗ УзССР и обрабатывали как указано выше. Для работы были использованы ионообменники: карбоксиметилце-ллюлоза КМ-32 (Whatman см-32 , Англия), диэтиламиноэтилсефа-декс ДЭАЭ-сефадекс А-50 (Pharmacea .Швеция), сефадексы G-25, G-ЮО (Pharmacea ,Швеция). В электрофоретических исследованиях применяли реактивы фирмы "Реанал" (Венгрия). Электрофокусирование проводили в акриламидных гелях с градиентом амфолинов от рН 3.5 до 10.0 фирмы иькв " (Швеция). В экспериментах по триптическому протеолизу трансферрина был использован трипсин фирмы " Serva " (ФРГ). При получении моноспецифических антител к трансферрину для иммунизации использовали кроликов породы шиншилла, полный адъ-ювант Фрэйнда фирмы " Caibiochem" и " Difco". В экспериментах по иммунодиффузии использовали агар фирмы " Bactoagar" (ФРГ). Все реактивы, использованные в работе, имели марку "ХЧ" или "ЧДД". Хроматография на КМ -целлюлозе. Подготовку ионообменника производили по общепринятым рекомендациям. КМ - целлюлозу замачивали в дистиллированной воде, несколько раз декантировали и суспендировали в 0.5 М растворе NaOH в течение 15 минут на мешалке; данную процедуру повторяли трижды, затем промывали дистиллированной водой до нейтральных значений рН, суспендировали в 0.5 М растворе соляной кислоты в течение 15 минут на магнитеой мешалке, данную процедуру также повторяли трижды.
Затем отмывали дистиллированной водой до нейтральных значений рН. Подготовленную таким образом КМ - целлюлозу уравновешивали натрий - ацетатным буфером 0.05 М, рН 5.0 на колонке 2.5 х 60 см. Диализат белка после солевого осаждения наносили на колонку с КМ - целлюлозой, промывали колонку натрий - ацетатным буфером 0.05 М,рН 5.0 до стабилизации фоновой линии на самописце Uvicord її ькви элюирова-ли натрий - ацетатным буфером 0.05 М,рН 7.0. Фракционирование и сбор фракций производили в холодной комнате при + 4С. Скорость элюции 60 мл/час. Хроматографию и сбор фракций производили при помощи хроматографического комплекса фирмы " ькв" (Швеция) при непрерывной автоматической регистрации содержания белка во фракциях на приборе "Uvicord її ". Фракции собирали по 20 мл автоматическим коллектором "ькв " (Швеция). Фракцию, содержащую трансферрин, полученную после ионообменной хроматографии на КМ - целлюлозе, обессоливали на сефадексе G - 25 ( колонка 2.5х60см)в0.05М ин4нсо3 и лиофильно высушивали. Хроматография на ДЭАЭ-сефадек-с е А - 5 0 . Подготовку ДЭАЭ - сефадекса А - 50 проводили по рекомендациям фирмы - изготовителя. ДЭАЭ -.сефадекс А - 50 замачивали в дистиллированной воде и оставляли набухать в течение 24 часов. Затем суспендировали в 0.5 М растворе соляной кислоты в течение 15 мин на магнитной мешелке при слабом перемешивании. Кислоту декантировали и процедуру повторяли трижды. Затем промывали дистиллированной водой до нейтральных значений рН, суспендировали в 0.5 М растворе едкого натрия в течение минут на магнитной мешалке. Отмывали дистиллированной водой до нейтральных значений рН. Подготовленный таким образом ДЭАЭ -сефадекс А - 50 уравновешивали трис - хлоридным буфером 0.05 М,рН 8.6 на колонке 2.5 х 60 см. Фракцию, содержащую трансферрин, после хроматографии на колонке с КМ - целлюлозой, растворяли в 3 мл трис - хлоридного буфера 0.05 М, рН 8.6 и наносили на колонку с ДЭАЭ - сефадексом А - 50. Элюцию проводили линейным градиентом ионной силы ( трис - НСІ 0.05 М, рН 8.6 и 0 - 0.5 М NaCi ). Фракционирование производили в холодной комнате при + 4С. Скорость элюции 60 мл/час. Хроматографию и сбор фракций осуществляли при помощи комплекса Uvicord її LKB ( Швеция). Фракции собирали по 20 мл на автоматическом коллекторе "LKB " (Швеция). Фракцию, содержащую трансферрин, обессоливали на колонке 2.5 х 60 см с сефадексом G-25 в 0.05 М кн.нсо- и лиофильно высушивали. Хроматография на ДЭАЭ - сефадек-с е А - 5 0 . Подготовку ДЭАЭ - сефадекса А - 50 производили как описано выше. Цельную сыворотку крыс насыщали ионами железа при помощи раствора 0.6 М FeCi , а затем добавляли следовые количества Жансо . Сыворотку диализовали в течение 12 часов при + 4С против натрий- фосфатного буфера 0.02 М, рН 6.5. Выпавший в ходе диализа осадок отделяли центрифугированием при 5 000 об/ мин в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, прозрачный супернатант наносили на колонку 2.5 х 50 см, заполненную ДЭАЭ - сефадексом А - 50, уравновешенным натрий - фосфатным буфером 0.02 М, рН 6.5. Фракцию трансферрина элюировали натрий - фосфатным буфером 0.04 М, рН 5.9. Процедуру хроматографии проводили при + 4С. Скорость элюции 50 мл/час. Хроматографию и сбор фракции производили при помощи комплекса " LKB " (Швеция). Фракции собирали по 15 мл. Фракцию, содержащую трансферрин, обессоливали на колонке 2.6 х 50 см с сефадексом G-25 в 0.05 Мшлккц и лиофильно высушивали.
Гельфильтрация на сефадексе G-100. Сефадекс G-100 " Pharmacea " (Швеция) замачивали в дистиллированной воде и оставляли набухать на 24 часа. Сефадекс G-ЮО уравновешивали трис - хлоридным буфером 0.1 М, рН 7.3, содержащим I м NaCi на колонке 3.3 х 100 см. Фракцию трансферрина, полученную после хроматографии на ДЭАЭ - сефадексе А - 50, растворяли в 3 мл трис - HCI буфера 0.1 М, рН 7.3, содержащим І М насіи наносили на колонку с сефадексом G-юо . Скорость протекания через колонку 25 мл/час. Гельфильтрацию и сбор фракций производили в холодной комнате при + 4С. Фракции собирали по 20 мл. Белок в элюате регистрировали по поглощению при 280 нм при помощи Uvicord II LEB (Швеция). Диск-электрофоре з проводили в двухкомпоне- нтных гелях с использованием Q% разделяющего и 3% концентрирующего геля в трубках из органического стекла 0.8 х II см по методу Fairbanks et ai,,1971 . В качестве электродного буфера использовали трис - глициновый буфер рН 8.6. Электрофорез вели в течение I часа при 4 мА на столбик геля, первые 10 минут при силе тока 2 мА на столбик геля. Гели фиксировали І час в 1% уксусной кислоте, затем окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R-250 (ФРГ) в течение 2 часов и отмывали от краски смесью ледяная уксусная кислота (ЛЖ) - изопропанол - вода в соотношеїши 1:5:5 в течение нескольких часов. Образец наносили на гель в количестве 150 - 200 мкг. Диск-электрофорез в П А А Г в при сутствии додецилсульфата натрия (Д Д С - Na ). Электрофорез в Q% ПААГ в присутствии ДЦС - Na осуществляли по методу, предложенному в работе Fairbanks et ai, 1971 . В качестве белков - маркеров использовали сывороточный бычий альбумин, овальбумин, трансферрин человека, химотрипси-ноген А, цитохром С (ФРГ). Электрофорез вели в течение 1.5 часов при силе тока 4 мА на столбик геля, первые 10 минут сила тока составляла 2 мА на столбик геля. Образцы наносили на гель в количестве 200 мкг на столбик геля. Гели после извлечения из трубок отмывали от ДЦС - На в течение 24 часов, фиксировали І час в 1% уксусной кислоте и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым R - 250 в течение 2 часов и отмывали от краски смесью ЛУК - изопропанол - вода в соотношении 1:5:5. Седиментационный анализ сывороточного трансферрина крысы проводили на аналитической ультрацентрифуге Spinco Model Е (США.).
Изоэлектрические точки
Метод изоэлектрического изофокусирования позволяет установить степень чистоты белков, а также определить их изоэлектриче-скую точку. Определение изоэлектрической точки трансферрина проводилось нами в полиакриламидных гелях с амфолином в градиенте рН 3.5 - 10.0. Наши результаты показали, что изоточки трансферрина находятся при рН 5.8 и 5.9 ( рис. 21 ). Наши данные, устанавливающие pi трансферрина крысы, равной соответственно 5.8 и 5.9, и свидетельствующие о кислых свойствах молекулы этого белка, согласуются с данными, приводимыми в литературе для этого белка у других позвоночных. Так,показано, что pi трансферрина из сыворотки крови кошек равна 4.9, 5.2 и 5.7 соответственно ( Stratil et al., 1971 ), в работах ( Das, 1974 ) приводятся значения pi для двух изоформ овотрансферри-на утки, равные 5.5 и 5.7 соответственно. 6.3. Спектр абсорбции Трансферрин относится к хромофорным (окрашенным) белкам.Связывающиеся с белком ферриионы железа обусловливают розовую окраску комплекса железо - трансферрин. Чтобы показать функциональную активность полученного трансферрина, его способность к связыванию железа, мы проводили насыщение его железом и запись спектров поглощения в видимой области. Как отмечалось выше, комплекс железо - трансферрин наиболее стабилен при щелочном рН. Поэтому насыщение трансферрина железом проводили при рН 8.0. При записи спектра поглощения отмечали, что комплекс железо -трансферрин обладает характерным спектром поглощения для этого белка с максимумом при 465 нм ( рис. 22 ). На основании установленного значения молекулярной массы трансферрина вычислен коэффициент молярной экстинкции при 465 нм, который оказался равным 2.1 х 10 М х см . Данный показатель хорошо согласуется с аналогичными данными, приводимыми в литературе для трансферрина других видов (Luk, 1971 ). 6.4. Седиментационное поведение Одним из критериев гомогенности получаемых белков является их седиментационное поведение при центрифугировании их в аналитической ультрацентрифуге. При седиментационном анализе крысиного трансферрина, проведенного на аналитической ультрацентрифуге Spinco Model Е , наблюдали один симметричный мирен - пик ( рис. 23 ).
Был рассчитан коэффициент седиментации, равный 5.6 s . Такой коэффициент седиментации характерен для полипептида с молекулярной массой 77 000 - 79 000 дальтон. 6.5. Аминокислотный состав трансферрина крысы и его изоформ Согласно данным аминокислотного анализа ( табл.5),полипвпти-дная цепь трансферрина содержит 595 аминокислотных остатков, а его изоформы соответственно 546 остатков ( быстромигрирующий трансферрин) и 587 остатков (медленномигрирующий трансферрин ). Среди них преобладают дикарбоновые аминокислоты ( 115 остатков), над основными аминокислотами ( 81 остаток), что находится в соответствии G величиной pi трансферрина. Для аминокислотного состава белка характерно также высокое содержание аланина ( 55 остатков на молекулу ), лейцина ( 54 остатка) и глицина ( 51 остаток ). 6.6. N - концевые аминокислотные остатки трансферрина крысы Однозначный критерий чистоты белков дает анализ N - концевых аминокислот. Так, в случае моносубъединичных белков учет количества N - концевых аминокислот позволяет судить о чистоте выделенных белков. Для определения N - концевого аминокисл- отного остатка полученного трансферрина его предварительно дан-силировали, а затем гидролизовали. При анализе N - концевого остатка дане ильным методом Gray,1962 мы обнаружили одно пятно на хроматограмме, что свидетельствует о гомогенности выделенного трансферрина. При проведенном качественном анализе N - концевой аминокислоты методом тонкослойной хроматографии на пластинках с полиамидом в присутствии свидетелей мы обнаружили в единственном пятне на хроматограмме аминокислотный остаток валина. Данные по количественному анализу и - концевой аминокислоты, на ряду с результатами по электрофорезу в денатурирующих условиях и седиментации белка, свидетельствуют в пользу моносубъединично-сти молекулы трансферрина. 6.7. Получение моноспецифических антител к трансферрину крысы К полученному препарату трансферрина крысы была получена кроличья антисыворотка, содержащая моноспецифичеокие антитела к трансферрину. Антисыворотку получали, иммунизируя кролика породы шиншилла очищенным трансферрином из расчета 250 мкг белка с полным адъювантом Фрэйнда на одну иммунизацию. Титр антител антисыворотки составлял I : 256 по данным двойной радиальной иммун-одиффузии в агаре ( Ouchteriony,l963 ) ( рис. 24 ). Для оценки специфичности антител к трансферрину также использовали метод двойной радиальной иммунодиффузии. При этом в центральную лунку помещали раствор антисыворотки, а в периферические - равные объемы растворов трансферрина. Исследуя реакцию иммунопреципитации в агаре для выделенного нами трансферрина крысы против кроличьей антисыворотки, содержа ащей моноспецифические антитела к трансферрину, получили одну единую зону преципитации ( рис. 25 ). При реакции иммунопреципи- тации в агаре полученной антисыворотки к трансферрину против цельной крысиной сыворотки также получили одну единую зону пре- цшштауш. Такой результат позволяет сделать вывод об иммунологической идентичности изотрансферринов, а также подтвердить наши утверждения о гомогенности полученных препаратов трансферри- на крысы. В контрольных опытах препараты трансферрина крысы не давали полос иммунопреципитации с антисыворотками к трансферрину человека.
Известно, что большинство белков с молекулярной массой больше 20 000 дальтон построены из индивидуальных глобулярных единиц - доменов. Ряд свойств трансферрина - относительно большая молекулярная масса, одноцепочечное строение, а также присутствие двух железосвязывающих центров в молекуле белка - все это напоминает свойства именно тех белков, которые имеют доменную структуру. Для молекулы трансферрина характерно присутствие двух железосвязывающих центров, однако до сих пор нет единого мнения относительно того, являются ли эти центры связывания металла эквивалентныгли или гетерогенными по своим функциям ( Aisen, Listowsky, 1980 ). В литературе отмечается, что эти центры связывания железа находятоя соответственно в двух доменах трансферрина ( MacGillivray et al.,1983, Williams et al., 1982 ). Это навело нас на мысль попытаться выделить протеолитические фрагменты белка, являющиеся структурно - функциональными доменами трансферрина и изучить каждый из доменов в отдельности. Кроме того, нашей целью было проследить, не существует ли в молекуле крысиного трансферрина внутренней структурной гомологии, т.е. явления, которого в данном белке этого вида животного до сих пор никто не отмечал. Благодаря особой чувствительности отдельных пептидных связей в молекуле трансферрина к действию протеолитических ферментов пооледние годы был найден эффективный подход к анализу строения трансферрина путем получения крупных фрагментов белка. В литературе имеются работы, описывающие возможность получения в результате ферментного протеолиза полностью насыщенного желе зом трансферрина отдельных пептидных фрагментов, содержащих центры Связывания металла (Brock,Arzabe,1976,Brock et al,1976). В то же время существуют работы, показывающие большую устойчивость насыщенного железом трансферрина к действию протеолитиче ских ферментов,в то время как ненасыщенный железом трансферрин, находящийся в апоформе, довольно быстро деградирует на мелкие пептидные фрагменты, не способные к связыванию железа (Tsao et ai.,1974 ). Протеолиз частично насыщенного железом трансферри на дает железосвязывающие пептидные фрагменты, однако тип пептидных фрагментов зависит от типа трансферрина, от степени на сыщения трансферрина железом, а также от природы протеолитичес- кого фермента ( Keung et al.,1982 ). Например, при протеолизе частично насыщенного железом трансферрина человека и овотранс- феррина птиц трипсином или химотрипсином ( Williams,1974 ) можно получить прешлущественно N - концевой фраплент белка,в случае триптического расщепления свиного или бычьего трансферрина можно получить оба и - и С - концевых пептидных фрагмента ( Keung et al.,1982 ).
Триптический протеолиз трансферрина
Мы предприняли попытку получить крупные пептидные фрагменты крысиного трансферрина, полностью насыщенного железом, используя в качестве протеолитического агента - трипсин фирмы VServa" (ФРГ), который предварительно обрабатывали, как описано (Дзвени, Гергэй, 1976), для того, чтобы удалить возможные примеси химотрипсина. Протеолиз проводили в 0.1$ ш.нсо-при рН 8.3 при различном фермент-субстратном соотношении. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение 5 и 10 часов. При эл-ектрофоретическом анализе в 8$ ЇЇААГ с 0.1$ ДЦС - Na триптичес-кого гидролизата, полученного через данные интервалы времени, мы не выявили крупных продуктов протеолиза. Единственной мажорной белковой зоной была зона, соответствующая полипептиду с молекулярной массой около 77 000 дальтон ( рис. 27 ). При протеолизе апотрансферрина последний деградирует на большое количество мелких пептидных фрагментов. Таким образом, полученные нами результаты не согласуются с данными Brock,Arzabe 1976 , которыми показано, что возможно триптическое расщепление трансферрина на крупные моноферрифрагменты, являющиеся структурно - функциональными доменами этого белка. При триптическом гидролизе трансферрина 40$ - го насыщения железом в фермент -субстратном соотношении 1:50 в течение 10 часов, при электрофорезе в 8% ПААГе с 0.1$ ДЦС -На мы отмечали присутствие 3 мажорных белковых зон, соответствующих полипептидам с молекулярной массой около 77 000, 38 000 и 36 000 дальтон (рис. 28 ). Таким образом, полученные нами результаты хорошо согласуются с результатами работ по триптическому протеолизу овотрансферри на ( Williams,1975 ) и серотрансферрина человека ( Evans et ai., 1977 ), частично насыщенных ферриионами железа. В работе ( Evans et ai., 1977 ) по триптическому протеолизу серотрансферрина человека при 30% насыщении отмечается получение пептидных фрагментов разных молекулярных масс в зависимости от различных донаторов металла. Так, при использовании в качестве донатора ферринитрилотриацетата эти исследователи получали пептид с молекулярной массой 43 000 дальтон, способный связывать железо. Когда донатором железа были лимоннокислое железо, аскорбат железа или (ш, ) 2S04 РеБОд » П и пРтеолизе трансферрина получали два крупных железосвязывающих пептидных фрагмента примерно равной молекулярной массы 33 500 и 36 000 дальтон ( Evans et ai.,1977 ). В нашей работе мы использовали в качестве донаторов железа при насыщении апотрансферрина РеСТ и (нНд ) 2S04 " FeS04 -Ри ЦРотеолизе трансферрина крысы, частично насыщенного железом при помощи этих донаторов, мы получили крупные пептидные фрагменты примерно одинаковой молекулярной массы. 7.3.
Выделение моноферрифрагментов трансферрина Для разделения полученных в ходе триптического протеолиза крупных пептидных фрагментов мы применили метод гельфильтрации на сефадексе G- 100 в трио - хлоридном буфере 0.1 М, рН 7.3, содержащем I М NaCi , мы получили две основные фракции А и В, как это показано на рисунке 29. Характерно, что элюаты пиков А и В имеют слаборозовую окраску. Электрофоретический анализ материала, содержащегося во фракциях пика А в Q% ПААГ в присутствии 0.1% ДДС -На , показывает присутствие в геле белковой зоны, соответствующей полипептиду с молекулярной массой около 77 000 дальтон, что позволяет предположить выход в этой фракции нативного трансферрина, не расщепленного трипсином. Электрофорез же материала, содержащегося во фракциях пика В в 8% ПААГ в тех же условиях, показывает присутствие в геле двух мажорных белковых зон, соответствующих полипептидам с молекулярной массой 36 000 и 38 000 дальтон. При идентификации материала, содержащегося во фракциях хроматогра- фического пика С, электрофорезом в ПААГ, обнаружили здесь присутствие низкомолекулярных пептидов, не представляющих для нас интереса. Для дальнейшего разделения крупных пептидных фрагментов, содержащихся во фракциях пика В, мы попытались провести рехрома-тографию этого материала на той же колонке, в тех же условиях гельфильтрации. Однако попытка разделить эти фрагменты рехрома-тографией объединенной фракции пика В на сефадексе G - юо была малоэффективной. По - видшлому, рехроматография этой фракции на сефадексе оказывается малоэффективной из-за того, что пептиды по размерам примерно одинаковы и гельфильтрация их в гранулах сефадекса идет с одинаковой скоростью. Поэтому для того, чтобы разделить эти пептиды, мы применили ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ - сефадексом А - 50 в трис - хлоридном буфере 0.05 М, рН 8.0 и градиенте ионной силы 0.01 - 0.1 М NaCi. При разделешш белков или пептидов одинаковых молекулярных масс ионообменная хроматография оказывается весьма успешной, так как разделение при этом происходит за счет ионных взаимодействий между активными группами ионообменника и белком или пептидом. В нашем случае применение этого метода оказалось успешным, мы достигали удовлетворительного разделения крупных пептидных фрагментов трансферрина ( рис. 30 ). Электрофоретический анализ в 8% ПААГ в присутствии 0.1$ ДДС - Na , полученных при ионообменной хроматографии фракций, показывает удовлетворительное разделение крупных пептидных фрагментов, которое достигается при применении этого метода ( рис. 31 ). Таким образом, нами была показана возможность расщепления молекулы крысиного трансферрина трипсином при 40$ насыщении трансферрина железом на два крупных пептидных фрагмента примерно одиноковой молекулярной массы. Чтобы показать, что данные Фрагменты являются структурно - функциональными доменами этого белка, мы проводили их физико - химическое и иммунологическое исследование .
