Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Перекисное окисление липидов 8
1.1.1 Общие аспекты процесса окисления. Патологии, сопровождающиеся радикальными процессами 8
1.1.2 Процесс перекисного окисления липидов 10
1.1.3 Системы, используемые для изучения перекисного окисления липидов 12
1.1.3.1 Фосфолипидные системы 13
1.1.3.2 Липидные системы, содержащие липопротеины низкой плотности 14
1.1.3.3. Липи дные системы без индукторов окисления на основе триглицеридов животного происхождения 15
1.2. Антиоксидантный статус организма и антиоксиданты 16
1.2.1 Ферментативные антиоксиданты 16
1.2.2 Неферментативные антиоксиданты 17
1.2.2.1 Соединения, содержащие ОН- группу 17
1.2.2.2 Соединения, содержащие SH- группу 20
1.2.2.3 Соединения других классов 20
1.3 Флавоноиды 21
1.3.1 Распространение в природе 22
1.3.2 Структура и классификация флавоноидов 22
1.3.3 Основные методы получения и идентификации флавоноидов 24
1.4 Физико-химические свойства флавоноидов 26
1.4.1 Ионизация и гидрофобность флавоноидов 26
1.4.2 Способность флавоноидов к комплексообразованию с ионами металлов переходных валентностей 28
1.4.3 Электронодонорные и водорододонорные свойства флавоноидов 30
1.4.4 Внутримолекулярная водородная связь 36
1.5 Флавоноиды как ингибиторы перекисного окисления липидов 36
1.5.1 Кинетика ингибирования антиоксидантами перекисного окисления липидов 37
1.5.2 Антирадикальное действие флавоноидов 38
1.5.3 Антиоксидантное действие флавоноидов 39
1.5.4 Прооксидантное действие флавоноидов 41
1.5.5 Механизмы антиоксидантного действия флавоноидов 42
2. Результаты и обсуждение 45
2.1 Характеристика объектов исследования 46
2.1.1 Модельные системы перекисного окисления липидов 46
2.1.1.1 Система индуцированного окисления фосфолипидов 46
2.1.1.2.Система окисления триглицеридов 47
2.1.2 Флавоноиды 48
2.1.3. Выделение и очистка изофлавонов сои 50
2.1.3.1.Экстракция смеси ИФ- гликозидов 51
2.1.3.2. Получение агликонов 52
2.1.3.3. Получение и идентификация индивидуальных изофлавонов 53
2.2 Изучение антиоксидантной активности флавоноидов 54
2.2.1. Исследование антиоксидантной активности флавоноидов в системе окисления фосфолипидов 54
2.2.2 Зависимость АО-активности флавоноидов от минимальной величины энергии образования феноксильного радикала 56
2.3 Определение физико-химических свойств флавоноидов 59
2.3.1.Изучение способности флавоноидов к ионизации при изменени рН 60
2.3.2. Определение коэффициента распределения флавоноидов 65
2.3.3. Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами Fe3+ 68
2.3.4. Изучение антиоксидантной активности флавоноидов в системе окисления триглицеридов 69
2.4 Зависимость антиоксидантной активности флавоноидов от их физико-химических характеристик 71
3. Экспериментальная часть 75
3.1 Материалы и оборудование 76
3.2 Характеристика объектов исследования 77
3.2.1 Подбор системы индуцированного окисления фосфолипидов 77
3.2.2 Характеристика системы окисления триглицеридов животного происхождения 78
3.2.3 Выделение и очистка изофлавонов сои 78
3.3. Изучение антиоксидантной активности флавоноидов 80
3.3.1 Изучение АО-действия флавоноидов в системе индуцированного окисления фосфолипидов 80
3.3.2 Изучение АО-действия флавоноидов в системе триглицеридов животного происхождения без индукторов окисления 81
3.4 Определение констант ионизации флавоноидов 82
3.5. Определение коэффициента распределения (Кр) флавоноидов в системе липид/вода.82
3.6 Изучение комплексообразования флавоноидов с ионами Fe3+ 83
3.7. Проведение регрессионного анализа (метод QSAR) 83
Выводы 85
- Антиоксидантный статус организма и антиоксиданты
- Флавоноиды как ингибиторы перекисного окисления липидов
- Изучение антиоксидантной активности флавоноидов
- Характеристика объектов исследования
Введение к работе
Основной причиной возникновения и развития сердечно-сосудистых заболеваний, смертность от которых является наиболее высокой во всем мире, и ряда других, является нерегулируемое перекисное окисление липопротеинов низкой плотности плазмы крови и фосфолипидов биомембран. В норме окислительные процессы в клетке протекают по свободнорадикальному механизму с низкой скоростью, так как существуют специальные механизмы защиты: преобразование активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления под действием антиоксидантов и ферментов. В случаях нарушений защитных функций возникает необходимость восстановления антиоксидантного статуса организма в профилактических или терапевтических целях. Одним из возможных путей решения данной проблемы может быть поиск эффективных антиоксидантов среди природных и синтетических веществ.
Антиоксиданты - вещества, способные в малых дозах тормозить свободнорадикальное окисление. Они широко применяются в медицине для профилактики различных заболеваний, в пищевой промышленности для торможения процессов окислительной порчи жиров и в других областях. Основными требованиями к антиоксидантам являются их действие в низких концентрациях; они должны быть нетоксичными и дешевыми. В настоящее время в качестве антиоксидантов рассматриваются соединения, содержащие подвижный атом водорода с ослабленной связью с углеродом и способные образовывать радикал, обрывающий цепь окисления.
К этому типу веществ относят природные соединения - флавоноиды, которые способны ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и ДНК. За последние десятилетия проанализирована антиоксидантная активность большого числа как синтетических, так и природных флавоноидов в различных модельных системах, в том числе окисление ЛПНП в присутствии Си . Большое число такого рода исследований связано с тем, что терапевтический эффект ряда препаратов обусловлен их антиоксидантными свойствами.
В данной работе исследовали зависимость антиоксиданти ой активности ряда флавоноидов от их физико-химических свойств на примере систем, моделирующих биологические мембраны и представляющих собой мультиламеллярные везикулы фосфолипидов.
Необходимость экспериментального изучения таких физико-химических свойств флавоноидов, как способность к ионизации их гидроксильных групп, гидрофобность, энергия образования феноксильного радикала, способность к комплексообразованию с ионами Fe3+, была обусловлена, во-первых, отсутствием систематических данных об этих параметрах. Во-вторых, как показал обзор литературы, большинство работ посвящено изучению влияния лишь отдельных физико-химических свойств флавоноидов на их антиоксидантную активность. В нашей работе мы предприняли попытку комплексного исследования влияния нескольких физико-химических характеристик на способность ингибировать ПОЛ флавоноидами различной структуры.
В настоящее время проводятся интенсивные исследования по поиску и изучению антиоксидантной активности новых природных антиоксидантов, поэтому возможность предварительной оценки их эффективности с учетом выбранной модельной системы и влияния различных физико-химических факторов представляется весьма актуальной.
Антиоксидантный статус организма и антиоксиданты
В данную группу антиоксидантов входят высокомолекулярные соединения -ферменты. В процессе эволюции в клетках для защиты от АФК выработались специализированные системы ферментативных антиоксидантов, к которым относятся супероксиддисмутаза (СОД), катализирующая реакцию дисмутации 0 2 в перекись водорода, каталаза, разлагающая Н2О2, глутатион-зависимые пероксидазы и трансферазы, удаляющие органические перекиси [28]. Ферментативные антиоксиданты характеризуются высокой специфичностью действия, направленного против определенных форм АФК; специфичностью клеточной и органной локализации, которые зачастую перекрываются комплементарным образом; специфичностью использования металлов в качестве катализаторов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо (гемовое) и селен [28, 29]. Уровень внутриклеточных ферментативных антиоксидантов находится под генетическим контролем. Принцип данной регуляции наиболее хорошо изучен у бактерий [30,31,32]. Суммарная активность ферментативных антиоксидантов в пересчете на миллиграмм белка ткани у млекопитающих хорошо коррелирует со средней продолжительностью жизни [33]. У человека, в отличие от животных, в нормальных условиях содержание фер- ментативных антиоксидантов постоянно и мало зависит от пола, возраста, веса и других физиологических параметров [34, 35], в то же время ряд патологических состояний сопровождается изменением их концентрации и активности в клетках и тканях [36-38]. 1.2.2 Неферментативные антиоксиданты Ферментативные антиоксиданты - средство внутриклеточной защиты, в сыворотке, лимфе и других средах их содержание мало. Вместе с тем во всех, водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют низкомолекулярные антиоксиданты - перехватчики органических радикалов. Такими антиоксидантами принято считать соединения, которые способны в сравнительно более низких количествах, чем содержание окисляемого субстрата, значительно замедлять или полностью ингибировать его окисление. Среди низкомолекулярных соединений, способных ингибировать окислительные процессы, различают первичные антиоксиданты и вторичные (превентивные). Первичные антиоксиданты являются ингибиторами АФК на стадии инициации ПОЛ, а также ингибиторами активных кислородных метаболитов (в частности, пероксидных радикалов RO 2 при окислении липидов и ненасыщенных жирных кислот).
Вторичные (превентивные) антиоксиданты ингибируют окисление одним или несколькими способами: путем изменения структурной организации субстрата, замедляющего окисление; снижая концентрацию Ог; связывая или окисляя ионы металлов переменных валентностей, индуцирующих разложение пероксидов и образование радикалов; переводя пероксиды в стабильные продукты окисления - спирты, альдегиды, кетоны. Среди таких антиоксидантов можно выделить два больших класса соединений, содержащих функциональные ОН-группы или SH-группы. 1.2.2.1 Соединения, содержащие ОН- группу. Главным действующим началом, обеспечивающим соединениям, содержащим ОН-группы (фенолы), является гидроксильная группа, присоединенная к ароматическому ядру (рис. 3). Благодаря наличию в структуре ароматического кольца обобщенной системы п-электронов происходит смещение отрицательного заряда на кислород, результатом чего Генерация АФК - это процесс, сопровождающий жизнедеятельность эукариотических клеток в аэробной среде. Однако нормальное развитие и функционирование их без защитных антиоксидантных систем было бы невозможным. Постоянное образование высокоактивных прооксидантов в живых организмах уравновешивается их дезактивацией специализированными ферментативными и неферментативными системами, причем для поддержания гомеостаза требуется непрерывная регенерация их антиоксидантной способности. Нарушение или отсутствие регуляции процессов окисления ведет к накоплению окислительных повреждений и, в конечном итоге, к окислительному стрессу, который является составной частью многих патофизиологических состояний. Антиоксидантные свойства фенольных соединений существенно зависят от количества ОН-групп, их положения и степени экранирования (например, у распространенного антиоксиданта ионола) [39, 40], а также, как в случае токоферолов и убихинонов, от строения углеводородного "хвоста", обеспечивающего мобильность и ориентацию молекул в структурированных субстратах (липосомы, микросомы, митохондрии): активность токоферолов в этих условиях на 1-2 порядка выше по сравнению с окислением в жидкой фазе, что связано с ориентацией ОН-группы в сторону гидрофильной среды [41], повышение же степени ненасыщенности углеводородного "хвоста" приводит к усилению антиоксидантных свойств соединения [42].
Взаимодействие фенольных антиоксидантов с органическими радикалами приводит к образованию феноксильных радикалов (АгО ), которые в дальнейшем могут участвовать в реакциях диспропорционирования с образованием хинолидных перекисей: В настоящее время известно несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, ионол, а также большинство растительных и животных пигментов [44, 45]. В растениях фенольные антиоксиданты являются обязательным компонентом и присутствуют в значительных количествах (1-2% биомассы). Как правило, синтез ароматического кольца возможен только у высших растений и микроорганизмов, в то время как животные преимущественно только преобразовывают различные ароматические соединения, за исключением синтеза убихинона и эстрогенов. Поэтому многие из фенольных антиоксидантов входят в группу так называемых "пищевых антиоксидантов", то есть соединений, потребность организма в которых удовлетворяется поступлением с пищей. Недостаток в питании жирорастворимых витаминов Е и К приводит к развитию патологий, сопровождающихся свободнорадикальными процессами, с характерными клиническими проявлениями [46,47, 48]. Важную роль в антиоксидантной защите организма играют легкоокисляющиеся пептиды, в состав которых входят SH-содержащие аминокислоты (глутатион, цистеин, цистин). В сыворотке крови млекопитающих основными носителями SH-групп являются альбумины - простые гидрофильные белки с молекулярной массой около 65 кДа [49]. SH-содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите клеток от ОН" радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате разложения молекул воды под действием ионизирующих излучений. [50,51]. На основе SH-содержащих соединений создан целый ряд синтетических анти-оксидантов для защиты клеток от окислительного стресса [52]; радиопротекторов [51]; лекарственных препаратов, применяемых при терапии атеросклероза, ишемическои болезни сердца, интоксикаций [36, 53], для снижения токсических эффектов кислорода при гипербарической оксигенации [54]. 1.2.2.3 Соединения других классов. Кроме фенольных и тиоловых соединений антиоксидантная активность обнаружена у убихинона, каротиноидов, аскорбиновой кислоты Аскорбиновая кислота (витамин С) (рис.6) является одним из наиболее важных антиоксидантов плазмы человека, она может выступать в качестве донора и акцептора атомов водорода благодаря наличию в молекуле двух енольных групп: В биологических субстратах аскорбиновая кислота обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств, поскольку способна инактивировать большинство АФК и регенерировать другие антиоксиданты, например, а-токоферол и некоторые радикалы глутатиона [55,56,57]. В присутствии ионов железа или меди аскорбат становится мощным прооксидантом [58, 59, 60]: он переводит ионы в восстановленное состояние и тем самым индуцирует разложение органических перекисей.
Флавоноиды как ингибиторы перекисного окисления липидов
В последние время было установлено, что флавоноиды проявляют антиоксидантную активность как в индуцированных системах окисления, содержащих субстрат окисления, так и в системах прямого генерирования АФК, т.е. являются ловушкой радикалов на стадии их образования [138, 139]. В связи с этим обсуждаются такие механизмы антиоксидантного действия флавоноидов, как антиокислительный и антирадикальный. Эти данные представляют значительный интерес, поскольку позволяют рассматривать этот класс соединений в одном ряду с такими антиоксидантами, как аскорбиновая кислота, а-токоферол, каротиноиды, которые поступают в организм человека с пищей и являются средствами неферментативной защиты, т.е. способны ингибировать радикальные процессы на внеклеточном уровне в жидкостях организма — плазме крови, синовиальной жидкости и др. В условиях окислительного стресса роль низкомолекулярных антиоксидантов повышается, поскольку считается, что ферментативная антиоксидантная защита становится малоэффективной. Это связано с тем, что ферменты локализованы внутри клеток, в биологических жидкостях обнаруживаются лишь следовые их количества. Кроме того, при оксидативном повреждении происходит быстрая инактивация конститутивного пула ферментов свободными радикалами и необходимо значительное время для индукции их синтеза. В этих условиях повышается роль низкомолекулярных антиоксидантов. Все эти наблюдения привели к интенсивному изучению флавоноидов в качестве ингибиторов ПОЛ. Окисление органических веществ в жидкой фазе (в том числе и липидов) описывается следующей принципиальной схемой: Реакция фенольного антиоксиданта с перекисными радикалами (7) определяет способность фенольных соединений тормозить цепное окисление органических веществ. Главным доказательством такого направления реакции является непосредственное обнаружение феноксильных радикалов методом ЭПР. В настоящее время при рассмотрении антиоксидантного действия флавоноидов, в частности, их антирадикального действия, используют показатели реакции (8), которые характеризуют эффективность действия флавоноида как антиоксиданта. Установлено, что фенолы и их гомологи эффективно обрывают цепи по реакции (8) в концентрациях, которые на 4 - 5 порядков меньше, чем концентрация окисляющегося углеводорода [140]. Этому соответствует разница в К2 и К7 на несколько порядков. Такое большое различие не связано лишь с прочностью связей О-Н гидроксильных групп.
Вероятно, реакции R02 с фенолом предшествует образование водородной связи, что сказывается на скорости реакции [141]. 1.5.2 Антирадикальное действие флавоноидов Антирадикальное действие флавоноидов в организме человека, вероятно, связано с ингибированием ими радикалов во внеклеточных жидкостях. Это может способствовать значительному снижению количества радикальных атак на ЛПНП в плазме крови или на фосфолипиды мембран. Поэтому данному свойству флавоноидов посвящено большое число работ. Чаще всего подобные исследования проводятся в системах, не содержащих субстрат окисления и представляющих собой смесь радикалиндуцирующего агента и флавоноида в каком-либо растворителе. В табл. 3 представлены наиболее распространенные системы для изучения антирадикального действия флавоноидов. Как отмечалось выше, наибольшее практическое значение при изучении антирадикального действия флавоноидов имеет реакция (8). Существенным является то, что ее вклад в ингибирование ПОЛ зависит не только от реакционной способности АгОН и АгО , но и от условий окисления [106]. С помощью метода ЭПР было установлено, что флавон байкалеин и его гликозид байкалин способны улавливать гидроксильный и алкильный радикалы [142]. Методом люминесценции посредством измерения количества синглетного кислорода было показано антирадикальное действие флавоноидов [143]. Методом улавливающего ЭСР было показано антипероксидрадикальное действие флавоноидов и ингибирование ими дифенилпикрилгидразидного радикала. [144, 145]. Кверцетин и его гликозид рутин ингибировали супероксиданион радикал, количество которого измерялось до и после реакции спектрофотометрически [113, 148]. Изофлавон генистеин проявлял антирадикальную активность по отношению к гидроксид-радикалу [106]. Капсацин ингибировал пероксидьные радикалы в системе окисления метиллинолеата [149]. Таким образом, было показано, что флавоноиды являются эффективными перехватчиками разнообразных радикалов. 1.5.3 Антиоксидантное действие флавоноидов. Антиоксидантное действие флавоноидов — комплексный процесс, состоящий из антирадикального действия флавоноидов на стадии инициации и ингибирования ими пероксидных радикалов и других радикалов, образующихся на последующих стадиях цепной реакции окисления (рис 13). Исследователи отмечают, что в сложных индуцированных системах часто измеряют общий антиоксидантный эффект флавоноидов, поскольку они не реагируют в данных случаях с каким-то одним специфическим видом АФК [85]. В зависимости от инициатора окисления, субстрата и антиоксиданта было разработано большое число методов измерения антиоксидантной активности. В основе одних лежит прямое измерение свободно-радикальных продуктов и их ингибирование антиоксидантом [150]. В основе других - способы непрямого измерения эффективности антиоксиданта по промежуточным или конечным продуктам реакции. В табл. 4 представлены наиболее распространенные методы измерения антиоксидантной активности [150]. Антиоксидантная активность флавоноидов в последнее десятилетие изучалась в основном в липидных системах.
Большинство работ, посвященных изучению ингибирующих ПОЛ свойств флавоноидов, выполнено с использованием системы окисления ЛПНП. В данном обзоре мы ограничимся перечислением лишь некоторых из них. Так, было обнаружено, что флавоноиды красного вина ингибируют медь-индуцированное окисление ЛПНП. В этом исследовании а-токоферол проявлял лишь 60% -ную активность по сравнению с кверцетином и разбавленным красным вином [80]. Изучали ингибирование флавоноидами различных подклассов окисления ЛПНП, индуцированного ионами меди (II) или 2,2 -азобис-(2-амидинопропан) дигидрохлорида [151, 152, 153, 154], генистеин ингибировал окисление ЛПНП, индуцированное ионами меди (II) или супероксид-анион радикалом [155]. Риос и др. обнаружили, что гиполетин-8-глюкозид был наиболее эффективным ингибитором ПОЛ среди гликозидов, выделенных из Sideritis jav. [156]. Растительный экстракт другого вида Sideritis baicalensis проявил высокую антиоксидантную активность при окислении липосом из фосфатидилхолина, облученных УФ-светом [157]. Высокую антиоксидантную активность при окислении липидов мозга крыс проявили представители подкласса изофлавонов: изофлав-3-ены, леспедозолы [158, 159]. Методом люминесценции была показана антиоксидантная активность флавоноидов различных классов [160]. Изофлавоны генистеин и даидзеин ингибировали ПОЛ, индуцированное ионами Fe и Fe в липосомальной системе [161]. Антиоксидантную активность флавоноидов связывают с их способностью проникать в липидный бислой, что было показано А.Арора и др. методом флуоресценции [162]. 1.5.4 Прооксидантное действие флавоноидов Благодаря способности легко отдавать и захватывать электроны фенольные антиоксиданты могут выступать и в качестве восстановителей. Так, в условиях гипоксии при действии ряда дыхательных ядов в митохондриях убихинон окисляется кислородом с образованием супероксидного анион-радикала, то есть проявляет прооксидантные свойства. Взаимодействие фенольных антиоксидантов с пероксидами приводит к образованию алкоксильных радикалов, которые могут индуцировать окислительные реакции: Возможно, прооксидантное либо антиоксидантное действие проявляется в зависимости от соотношения реакционной способности радикалов. Было показано прооксидантное действие некоторых флавонов и флавонолов [123, 163]. При исследовании антиоксидантного действия комплексов флавоноидов с ионами железа (II) было обнаружено, что кемпферол-7-неогесперидозид обладает прооксидантным действием в системе окисления линолевои кислоты, индуцированного железо-аскорбатом [117]. 1.5.5 Механизмы антиоксидантного действия флавоноидов.
Изучение антиоксидантной активности флавоноидов
Способность флавоноидов ингибировать процесс ПОЛ изучали в системе №4 (см. табл. 6) при рН 5.5 (0.2 М ацетатный буфер) и рН 7.4 (0.05 М ТРИС-НС1 буфер). Для контроля процессов ПОЛ существует ряд методов. В данной работе АО-активность флавоноидов оценивали по ингибированию накопления ТБК-чувствительных продуктов, используя один из наиболее распространенных, быстрых и надежных методов — адсорбционную спектроскопию. Накопление ТБК-чувствительных продуктов в системе до инкубации и через 60 мин определяли спектрофотометрически при Хтах=532 нм и Х,=580 нм. Исследования проводили относительно контроля, который содержал фосфолипиды с индукторами окисления без флавоноидов. АО-активность для каждого вещества рассчитывали как % ингибирования по формуле [107]: где Сан и Скотр - концентрации ТБК- чувствительных продуктов в пробах с антиоксидантом и контрольных пробах соответственно; С0 и С6о - концентрации ТБК-чувствительных продуктов (нмоль/мл) в начальный момент и после 60 мин инкубации соответственно. Результаты представлены на рис. 22: Установлено, что при рН 5.5 большинство флавоноидов оказывает выраженное антиоксидантное действие. Исключением являлись кемпферол и байкалин, которые промотировали окисление (рис. 22). Причины этого будут обсуждены ниже. При рН 7.4 все флавоноиды, включая кемпферол и байкалин, проявляли антиоксидантное действие, за исключением даидзеина, который практически не ингибировал окисление. Результаты эксперимента согласуются с известными литературными данными о влиянии структуры на антиоксидантное действие флавоноидов. Так, увеличение числа гидроксильных групп в молекуле, наличие ОН-группы в 3-ем положении, двойная связь в кольце С способствуют увеличению АО-активности. Действительно, как показал эксперимент, при обоих рН наибольший ингибирующий эффект проявили флавон-3-олы мирицетин и кверцетин, в молекулах которых присутствуют все перечисленные структурные признаки. Кроме того, высокую ингибирующую способность проявили флавон байкалин и изофлавон генистеин: они имеют три гидроксильные группы, двойную связь в кольце С, но у этих соединений отсутствует ОН-группа в 3-ем положении. Меньшую АО-активность проявили дигидрокверцетин и гесперетин, у которых отсутствует двойная связь в кольце С и ОН-группа в 3-ем положении.у гесперетина.
При рН 5.5 менее интенсивно ингибировал ПОЛ катехин, в молекуле которого такое же количество ОН-групп, как у кверцетина, однако восстановлена двойная связь в кольце С и отсутствует 4-оксо-группа. Активность, сопоставимую с АО-действием дигидрокверцетина и гесперетина, проявил даидзеин, у которого только две ОН- группы и отсутствует ОН-группа в 3-ем положении, но имеется двойная связь в положении С2 - С3. Эти данные позволяют сделать вывод, что наиболее важной структурной особенностью для АО-активности флавоноидов является наличие двойной связи в кольце С, которая позволяет всей системе из трех колец перераспределять электронную плотность. Некоторые флавоноиды проявляли различный ингибирующий эффект при изменении рН: например, активность байкалеина и даидзеина снижалась при переходе к рН 7.4, а кемпферола, байкалина и катехина - увеличивалась. Кроме рассмотренных структурных особенностей, в литературе обсуждается влияние на ингибирование ПОЛ таких факторов, как наличие гликозидных и метоксильных групп в молекулах флавоноидов. Считают, что гликозилирование блокирует химически активные группы этих соединений и приводит к снижению их антиоксидантной активности. Действительно, при рН 5.5 мы наблюдали прооксидантный эффект гликозида байкалеина - байкалина, однако при рН 7.4 он оказывал высокое ингибирующее действие. Гесперетин, у которого метоксилирована 4 -ОН группа, при рН 5.5 проявил несколько большую антиоксидантную активность, чем дигидрокверцетин, представитель этого же подкласса, однако их активности были сопоставимы при рН 7.4. Полученные данные позволяют утверждать, что ингибирующая способность флавоноидов определяется не только их структурой, но и свойствами системы окисления. 2.2.2 Зависимость АО-активности флавоноидов от минимальной величины энергии образования феноксильного радикала. Одним из механизмов АО-действия флавоноидов является их способность взаимодействовать с пероксидами с образованием феноксильных радикалов. При рассмотрении этого процесса необходимо учитывать, что существование флавоноидов возможно как в виде нейтральной молекулы, так и в виде фенолят-иона (рис. 23). Соответственно, в липидны й бислой могут проникать и та и другая форма соединений. Таким образом, обсуждается два способа образования феноксильных радикалов: отдачи атома водорода из нейтральной молекулы или электрона из фенолят-иона [118]. Рассчитав минимальную величину энергии образования феноксильного радикала (АЕобр), можно сделать предварительную оценку антиоксидантной способности флавоноидов.
В данной работе были рассчитаны величины ДЕобр для всех исследуемых флавоноидов и сопоставлены с их АО-активностью. Первоначально были рассчитаны значения Еобр феноксильных радикалов при отрыве атома водорода по формуле: АЕобр = Еобр [ФЛАВ (О )] - Еобр [ФЛАВ (ОН)] (II) где Е0бР[ФЛАВ(0 )] - энергия образования феноксильного радикала, Еобр[ФЛАВ (ОН)] - энергия образования исходного флавоноида. Следовательно, наименьшее значение АЕобр будет характерно для флавоноидов, способных наиболее легко образовывать феноксильные радикалы. Для расчета основных состояний как в случае молекул, так и в случае радикалов была выбрана волновая функция UHF (неограниченный метод Хартри-Фока). После создания молекулы или феноксильного радикала проводили процедуру оптимизации их геометрии с учетом факторов, которые могут повлиять на энергию образования флавоноидов и их радикалов. Во-первых, это возможный поворот кольца В относительно плоскости колец А и С; во-вторых, это способность флавоноидов образовывать внутримолекулярные водородные связи. После введения указанных дополнительных параметров была произведена окончательная оптимизация геометрии молекул и радикалов, соответствующей глобальным минимумам их энергии. При расчете использовали метод сопряженного градиента Полака-Рибьера. Значение среднеквадратичного градиента устанавливали 0.0001 ккал/А моль. Как показало сопоставление структуры и величины Еобр, наиболее низкие значения характерны для флавоноидов, в молекуле которых присутствуют: а) 5-ОН - 4-кето группировка, образующая водородную связь, что облегчает отрыв атома водорода от 3-го положения; б) незамещенное вторым бензольным кольцом 3-е положение; в) наличие двойной связи по положению 2-3. Отсутствие хотя бы одной структурной особенности вызывает увеличение энергии образования феноксильного радикала. По результатам эксперимента и рассчитанным значениям ДЕобр был проведен корреляционный анализ (рис. 24) зависимости АО-активности от ДЕобр феноксильных радикалов и установлено, что антиоксидантное действие снижается при увеличении значения ДЕобр. При проведении анализа не учитывались данные для байкалин а (2), кемпферол а (5), поскольку эти соединения промотировали окисление, и генистеина (9) (рН 5.5); и для генистеина (9) (рН 7.4). Видно, что при рН 7.4 наблюдается несколько лучшая корреляция (1 =0,643), чем при рН 5.5 (1 =0,599). На рис. 24 также отмечены соединения, образующие комплексы с ионами железа (III): соответсвующие точки помещены в прямоугольники. Это свойство будет обсуждаться ниже. Из данных корреляционного анализа видно, что значения коэффициентов корреляции недостаточно высоки, чтобы характеризовать АО-активность флавоноидов только по величине АЕобр. Поэтому мы рассмотрели влияние на АО-активность флавоноидов и других физико-химических свойств этих соединений.
Характеристика объектов исследования
Навеску фосфолипидов (сФХ, препарат «Lipoid SI00", Германия), растворяли в 2мл этанола в количестве 50мг для систем №1-3 и 5 мг для системы №4, упаривали на роторном испарителе. Полученную липидную пленку растворяли в дистиллированной воде механическим диспергированием, трижды замораживали и оттаивали для получения однородных мультиламеллярных везикул, затем добавляли свежеприготовленные растворы Fe3+ и аскорбиновой кислоты и перемешивали. Для этого проводили реакцию образцов с тиобарбитуровой кислотой. К 0.5 мл липидной среды в начальный момент времени или после инкубирования (37С на водяной бане в течение бОмин при постоянном перемешивании) добавляли 3 мл препарата ТБК (раствор 15г СС13СООН и 0.67г ТБК 100 мл воды) и выдерживали на кипящей водяной бане 40 мин. После охлаждения отбирали верхний прозрачный слой и измеряли поглощение образцов при двух длинах волн: 532 нм и 580 нм; содержание ТБК-чувствительных продуктов рассчитывали по формуле [168]: С(нмоль/мл)=((А5з2-А58о)#\ Тбк)/(Уин»Б»1) где А - оптическое поглощение при соответствующей длине волны; V-гбк -объем тиобарбитуровой кислоты; VHH - объем липидной среды; є - молярный коэффициент поглощения малонового диальдегида (l.SSxlOSeMT CM"1) [113], / =1см. Накопление ТБК-чувствительных продуктов рассчитывали по формуле: А [С]=[С]60-[С]о; где [С]о и [С]бо — их содержание в нулевой пробе и после инкубации соответственно. 3.2.2 Характеристика системы окисления триглицеридов животного происхождения. В качестве модельной липидной системы использовали свиной спинной шпик, окисление которой оценивали по содержанию ТБК-чувствительных продуктов. 10 г жира подвергали термообработке (72С на водяной бане в течение 30 мин) и затем растирали в ступке с 50мл воды. Полученную смесь с помощью дистиллированной воды объемом 47,5 мл количественно переносили в колбу Кьельдаля. Туда же добавляли 2,5 мл ЗМ раствора соляной кислоты и производили дистилляционную отгонку в течение 10-15 мин, в ходе которой собирали 50 мл дистиллята.
Для проведения цветной реакции 5мл дистиллята помещали в пробирку с притертой пробкой, приливали 5мл 0,02М раствора ТБК в 90% ледяной уксусной кислоте. После перемешивания пробирку с содержимым помещали в кипящую водяную баню на 35мин. Раствор охлаждали в проточной воде в течение Юмин и затем измеряли оптическую плотность при А,=532-535 нм. Содержание ТБК-чувствительных продуктов рассчитывали по формуле: А=єЬс, где А-поглощение вещества, или его оптическая плотность; Ь- длина оптического пути (см); с - концентрация (обычно моль/л); є-молярная поглощательная способность вещества, чаще называемая молярным коэффициентом экстинкции [л/(мольсм)]. 3.2.3 Выделение и очистка изофлавонов сои. Изофлавоны выделяли из пищевой добавки "Nova Soy" фирмы ADM (США), содержащей 46% смеси гликозидов изофлавонов и их малонил- и ацетилпроизводных. Получение гликозидов ИФ Препарат "Nova Soy" последовательно экстрагировали кислым ацетоном (рН 3,0) и 90%-ным метанолом (препарат-растворитель, 1:10, по массе) 2 ч при комнатной температуре. Осадок отделяли фильтрацией, объединенные экстракты выпаривали досуха. Остаток растворяли при 50С в сухом метаноле и выдерживали 12 ч при минус 10С, после отделения образовавшегося осадка оставшийся раствор упаривали и еще раз высаживали смесь гликозидов. Объединенный осадок еще трижды растворяли-высаживали для дополнительной очистки. Выход смеси ИФ-гликозидов составил 18% по массе от исходного препарата. Значения Rf гликозидов дайдзина и генистина в системе А были равны 0.45 и 0.52 для соответственно. Спектры Н-ЯМР гликозидов генистеина и дайдзеина (5, м.д.) содержат следующие сигналы: фенольных колец - 6.4 (с, Н8); 6.79-6.83 (ее, НЗ7, Н51); 7.35-7.39 (ее, Н2 , Нб ), 8.00 (J 2,0 Гц, д, Н5), 8.38 (с, Н2), 9.6 (с, 7-ОН); а также сигналы 8.0, характерный для Н5 дайдзина, и 12.93., который относится к протону 5-ОН и характерен для генистина; сигналы в области 4.5-5.5 принадлежат протонам глюкозы, в том числе сигнал 5.3, относящийся к аномерному протону остатка глюкозы, указывает на / -конфигурацию гликозидной связи. УФ-спектр смеси в этаноле имеет максимум поглощения в области 258-260 нм и плечо в области 330 нм.
Получение агликонов. 1. Ферментативный гидролиз: 250 мг смеси ИФ-гликозидов в 5 мл 0,2 М ацетатного буфера, рН 5.0 инкубировали с 25 мг гликозидаз (КФ 3.2.1) из Aspergillus heteromorphous ЗОЮ в течение 1 ч при 50С. Выход смеси агликонов составил 5-10% (по данным ТСХ). 2. Кислотный гидролиз спиртового раствора ИФ-гликозидов: к раствору 500 мг ИФ-гликозидов в 5 мл этанола добавляли 45 мл 1.1 н. HCI. Раствор выдерживали на кипящей водяной бане 2 ч. с обратным холодильником. Выход смеси изофлавонов составил 5-10% (данные ТСХ). 3. Кислотный гидролиз порошкообразной смеси ИФ-гликозидов: проводили двумя способами. Первый способ: 500 мг гликозидов нагревали в 10 мл 1 н. НС1 в течение 2 ч на кипящей водяной бане с обратным холодильником. Гидролиз проходил не полностью: по данным ТСХ в системе Б, оставалось много негидролизованных ИФ- гликозидов (Rf 0), выход изофлавонов (Rf 0.12 и 0.4) составил 5-10%. Второй способ: 500 мг смеси ИФ-гликозидов и 10 мл 6 н. НС1 выдерживали 5 ч при 100 С, контролируя ход гидролиза ТСХ. После гидролиза порошок агликонов отфильтровывали на стеклянном фильтре под вакуумом, затем, не удаляя с фильтра, нейтрализовали 0,1 н. раствором NaHCC 3, и высушивали. Выход изофлавонов от содержания их в гликозидах составил 90%. Получение индивидуальных изофлавонов. Генистеин и дайдзеин выделяли из их смеси адсорбционной хроматографией на колонке с силикагелем (20x220мм) в системе Б при соотношении вещество-сорбент, 1:300, контроль ТСХ в этой же системе. Rf генистеина равен 0.4, дайдзеина 0.12 (ср. [90]). Спектры Н-ЯМР генистеина и дайдзеина (8, м.д.) содержат следующие сигналы: фенольных колец - 6.4 (с, Н8); 6.79-6.83 (ее, НЗ , Н57); 7.35-7.39 (ее, Н2;, Нб ), 8.00 (J 2,0 Гц, д, Н5), 8.38 (с, Н2), 9.6 (с, 7-ОН); а также сигналы 8.0, характерный для Н5 дайдзеина и 12.93., который относится к протону 5-ОН и характерен для генистеина. 3.3. Изучение антиоксидантной активности флавоноидов. 3.3.1 Изучение АО-действия флавоноидов в системе индуцированного окисления фосфолипидов. Для изучения антиоксидантного действия флавоноидов использовали кверцетин, дигидрокверцетин, байкалин и байкалеин (ООО «Реликт», Россия), кемпферол, мирицетин, гесперетин и катехин (SIGMA-ALDRICH, Германия), изофлавоны генистеин и дайдзеин были выделены из пищевой добавки "Nova Soy" (США). В качестве индуцированной системы окисления была выбрана система окисления №4. В связи с низкой растворимостью флавоноидов в воде, их растворяли в 96% этаноле. Исследования проводили при значениях рН 5.5 (0.2М ацетатный буфер) и рН 7.4 (0.05 М ТРИС-НС1 буфер), табл. 15.
