Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор
Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования 8
2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий 8
2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных бактерий 9
2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов 9
2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий 10
2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий 11
2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков 11
2.3.2. Пространственная организация молекул поринов 15
2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры -баррельных белков 19
2.4. Способы получения изолированных поринов 22
2.5. Конформационные переходы изолированных поринов 24
2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий 28
2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами 28
2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант 30
2.7. Регуляция экспрессии OmpF и OmpC поринов грамотрицательных Бактерий 32
2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri 34
3. Обсуждение результатов 39
3.1. Получение неспецифических (OmpF- и OmpC- подобных) поринов наружной мембраны Y. ruckeri 40
3.1.1. Первичная структура OmpC– и OmpF поринов из Y. ruckeri 40
3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы 40
3.1.2.1. Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом 41
3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции пориновых белков 42
3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и OmpC-подобных поринов и их идентификация 44
3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 47
3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина Y. ruckeri 47
3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и OmpC поринов 49
3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и OmpC поринов из НМ Y. ruckeri 49
3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri 50
3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и OmpC
поринов Y. ruckeri 52
3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры 52
3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 56
3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri 59
3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri под действием температуры 66
3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и OmpC поринов в процессе термоденатурации 66
3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры 69
3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика OmpF порина Y. ruckeri 76
3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина Y. ruckeri 76
3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri 78
3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из
НМ Y. pseudotuberculosis 78
3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина Y. ruckeri 80
3.6. Взаимодействие OmpF порина Y. ruckeri с клетками эукариот
4. Экспериментальная часть 87
4.1. Материалы 87
4.2. Приборы и оборудование 87
4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов 87
4.4. ПЦР амплификация и секвенирование ompC и ompF генов 88
4.5. Получение изолированных поринов иерсиний 88
4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов 89
4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью техники БЛМ 90
4.8. Построение теоретических моделей поринов 91
4.9. Иммунохимические методы 91
4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот 92
5. Выводы 94
Список сокращений 95
Список литературы .
- Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий
- Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий
- Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом
- Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Yersinia ruckeri – грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз у рыб лососевых пород, известный также как «энтерит, сопровождающийся покраснением рта». Ежегодно этот микроорганизм является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним.
Известно, что порообразующие белки наружной мембраны (порины) играют важную роль в адаптация бактерий к условиям окружающей среды и межклеточных взаимодействиях. Бактериальные порины - интегральные мембранные -структурированные белки, образующие поры для пассивной диффузии гидрофильных молекул через наружную мембрану (НМ). Особенности структуры и локализация в НМ бактериальной клетки обуславливают наличие у поринов и других функций, отличных от транспортной. Экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, формируют потенциальные сайты взаимодействия с клетками организма-хозяина, в том числе с клетками иммунной системы. Показано, что порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий. Антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов.
Известно также, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с Toll-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ бактерий до сих пор изучены недостаточно.
Кроме вышеназванных задач, имеющих прикладное значение, структурно-функциональные исследования поринов НМ бактерий важны для химии мембранных -структурированных белков в целом: для выяснения особенностей их пространственной организации, для установления участков структуры, ключевых для поддержания стабильности молекулы этих белков, а также для выяснения механизмов их сборки и денатурации под действием температуры и химических агентов.
Цели и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции неспецифических поринов бактерий рода Yersinia. Она посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры и функциональной активности OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri, исследованию процесса денатурации OmpF порина под действием температуры и изучению его иммунобиологических свойств.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
-
выделить и идентифицировать OmpF и OmpC порины Y. ruckeri;
-
изучить влияние условий культивирования на экспрессию неспецифических поринов;
-
установить их первичную и пространственную структуру;
-
сравнить физико-химические свойства и функциональную активность этих белков;
-
исследовать процесс термоденатурации OmpF порина методами оптической спектроскопии, микрокалориметрии и компьютерного моделирования;
-
изучить иммуногенные свойства OmpF порина, установить в антигенной структуре белка наличие детерминант, общих с поринами других видов иерсиний;
-
исследовать характер взаимодействия OmpF белка с клетками эукариот.
Научная новизна исследования. Впервые выделены индивидуальные OmpF и OmpC порины Y. ruckeri, установлена их первичная и пространственная структура, охарактеризована функциональной активность. Впервые показана зависимость экспрессии этих белков от условий окружающей среды. Впервые показано, что олигомеры OmpF порина являются более устойчивыми к действию температуры по сравнению с поринами других видов иерсиний. Впервые показано, что термоденатурация OmpF порина проходит поэтапно на различных уровнях организации белковой молекулы. В антигенной структуре OmpF порина Y. ruckeri выявлены антигенные эпитопы, общие с поринами других видов иерсиний. Впервые исследовано влияние поринов Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток крови человека и нормальных клеток тканей рыб.
Практическая значимость работы. Данные о высокой иммуногенности OmpF порина Y. ruckeri при относительно низкой его цитотоксичности, позволяет рассматривать этот белок как перспективный протективный антиген для борьбы с инфекцией, вызываемой Y. ruckeri.
Разработан исключающий стадию гель-хроматографии технологичный способ получения высокоочищенного OmpF порина, основанный на использовании препарата ДНКазы из гепатопанкреаса крабов, содержащего примесь протеаз.
Основные положения выносимые на защиту. 1) OmpF и OmpC порины Y. ruckeri подобно неспецифическим поринам наружной мембраны иерсиний имеют различные физико-химические характеристики, отличительные особенности первичной и пространственной структуры и образуют в искусственном бислое разные по размеру каналы.
2) Экспрессия исследуемых поринов зависит от условий
культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в
бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в
среду NaCl и повышение температуры приводит к увеличению содержания в
бактериальных клетках OmpC порина.
3) Структура OmpF порина обладает аномально высокой для
неспецифических поринов термостабильностью и способностью
восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя даже после инкубации при 85 оС, температуре необратимого конформационного перехода.
4) Процесс термоденатурации тримера OmpF порина имеет несколько
стадий, сопровождающихся на начальных этапах обратимыми изменениями в
структуре наружных петель, а в дальнейшем перестройками на уровне
третичной и четвертичной структуры белка, приводящими к образованию
термостабильных мономеров порина. Различия в спектрах триптофановой
флуоресценции исследуемых поринов обусловлены особенностями положений
Trp212 в OmpF и Trp184 в OmpC порине.
5) В петлях L1 и L4 молекулы OmpF порина локализованы
иммунодоминантные В-эпитопы, перекрёстно реагирующие с АГ
детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.
6) OmpF порин Y. ruckeri имеет низкую цитотоксичность и оказывает
влияние на клеточный цикл как злокачественных, так и нормальных клеток. В
низких концентрациях белок ингибируют S-стадию клеточного цикла для обоих
типов клеток, а высокие концентрации вызывают апоптоз злокачественных
клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде статей в материалах Международных заочных научно-практических конференций, Новосибирск, 1 февраля и 4 июля 2012 г; в Сборнике трудов Международной научной конференции «Математическое им компьютерное моделирование в биологии и химии», Казань, 28-30 мая 2012 г.; на XIV Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 11-18 сентября 2012 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в российских журналах и 1 в международном журнале, рекомендованных ВАК РФ, 4 статьи в сборниках трудов Международных и отечественных конференций и 2 тезисов докладов в материалах отечественных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 18 апреля 2014 г.
Личный вклад соискателя в проведение исследования.
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий ТИБОХ ДВО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Структура и обьем диссертации. Диссертация содержит разделы: Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы и методы, Выводы и Список литературы, включающий 185 наименований. Диссертация изложена на 110 страницах. Результаты представлены в 12 таблицах и иллюстрированы 40 рисунками.
Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий
Собственная белковая флуоресценция. Флоуресцентная спектроскопия является одним из самых высокочувствительных методов, позволяющих детектировать очень низкие концентрации веществ и отличать одно вещество от другого. Основные преимущества флуоресцентных методов, например, при исследовании разворачивания белков заключаются в чувствительности сигнала к микроокружению флуорофора, возможность использования различных характеристик флуоресцентных сигналов, возможность работать широком диапазоне концентраций, в котором отношение сигнал : шум является достаточно высоким, в быстром ответе и возможности приспособления этого метода к различным типам проб и кювет [32]. В связи с этим, флоуресцентная спектроскопия является чрезвычайно информативным методом, позволяющим получать данные о структурных свойствах, конформационной подвижности, положениях флоуресцирующих остатков в анализируемой биомолекуле, а также другие сведения о межмолекулярных взаимодействиях.
В белках флоуресцирующими аминокислотами являются триптофан, тирозин и фенилаланин. При поглощении фотона хромофорной молекулой в ней происходит перераспределение электронной плотности и возрастает дипольный момент. В возбуждённом состоянии молекула может взаимодействовать с растворителем или другими близко расположенными в пространстве АК остатками. Эти взаимодействия специфически изменяют спектр излучаемой энергии, фиксируемый спектрофлуориметром. Полученные таким образом в ходе экспериментов спектры несут информацию о положениях остатков флоурофоров по отношению к другим группам боковых цепей аминокислот. Используя эти спектры можно судить об изменениях третичной и четвертичной структуры белка в процессах его взаимодействия с другими молекулами или под действием денатурирующих агентов, включая температуру [33].
При исследовании денатурации белков наиболее широко используемым флуорофором являются остатки триптофана. Несмотря на то, что индольная группа триптофана характеризуется относительно невысокими значениями коэффициента поглощения и квантового выхода флуоресценции, тем не менее, ее флуоресцентные свойства достаточно чувствительны к микроокружению. И эти преимущества с избытком перекрывают недостатки этого флуорофора при изучении разворачивания белков. В случае нативных белков квантовый выход флуоресценции индивидуальных остатков триптофана в белке, содержащем один остаток триптофана на одну молекулу, колеблется в широком диапазоне 0.01 – 0.40 [34]. Максимум эмиссии таких белков колеблется от 308 нм в случае азурина до приблизительно 350 нм в случае полностью доступного растворителю остатка триптофана [34 - 36]. Флуоресцентные свойства развернутых белков различаются в значительно меньшей степени. Все авторы, которые определяли его получали величину около 0.1, максимум эмиссии триптофановых остатков развернутых белков близок к 350 нм. Таким образом, при разворачивании эмиссия белка обычно сдвигается в сторону больших значений длин волн, а квантовый выход может как снижаться, так и повышаться.
Широкий диапазон квантовых выходов и положений максимума эмиссии триптофановых остатков в белках обусловлен различными типами взаимодействий возбужденных индольных групп с микроокружением в разных белках. Значительное внимание уделялось разработке подходов к интерпретации флуоресцентных характеристик триптофановых остатков в белках, а также связи получаемых данных со структурными особенностями [37 - 40]. Наиболее широко распространенной точкой зрения является предположение о том, что эмиссия триптофановых остатков сдвинута сильнее в область более коротких волн, если индольную группу окружают другие неполярные боковые цепи аминокислот, а батохромный сдвиг объясняется взаимодействием возбужденного состояния с полярными молекулами растворителя или другими полярными функциональными группами. Крайне низкий квантовый выход триптофановых остатков в нативном белке указывает на наличие каких-либо внутримолекулярных реакций тушения. В работах ряда авторов [41 - 43] было показано, что пептидная связь и боковые цепи ряда аминокислот выступают в роли тушителей при непосредственном контакте. Что касается положения максимума флуоресценции, предполагается, что оно может быть связано со степенью электростатической стабилизации и дестабилизации возбужденной индольной группы (в возбужденном состоянии разделение зарядов выше, чем в невозбужденном), а также с наличием заряженных групп в микроокружении флуорофора.
Анализ многочисленных спектров триптофановой флоуресценции белков и данных по тушению флоуресценции внешними факторами позволило Бурштейну с соавторами [44, 45] сформулировать модель дискретных состояний остатков триптофана в белках. Эта модель выделяет пять наиболее вероятных спектральных форм остатков триптофана. Спектральная форма А соответствует излучению невозмущённого индольного хромофора в нейтральном гидрофобном окружении внутри белковой глобулы. Это очень редко встречающаяся в белках форма, обнаруженная пока лишь у двух белков – азурина и бактериородопсина. Она наблюдается, когда непосредственно около индольного кольца нет ни одной полярной группы боковых цепей АК. Спектральная форма S соответствует излучению индольного хромофора, локализованного внутри белковой глобулы и образующего эксиплекс 1:1 с какой-то ближней полярной белковой группой. В чистом виде такая форма не встречается, сопровождаясь вкладом спектра класса I (см. ниже). Спектр класса S характеризуется максимумом при 316 нм, и довольно редко встречается на практике. Спектральная форма I соответствует излучению индольного хромофора, локализованного внутри белковой молекулы, образующего эксиплекс 2:1 с ближайшими полярными группами белка [45]. Максимум такого спектра находится на 330 нм. Спектральная форма II соответствует излучению хромофора на поверхности белка в контакте с молекулами связанной воды, подвижность которых ниже чем подвижность свободных молекул. Соответствующий спектр имеет максимум при 340 нм, и очень часто встречается в белках. Спектральная форма III соответствует излучению индольного хромофора, локализованного на поверхности белка в контакте с молекулами свободно релаксирующей воды. Спектр триптофановых остатков класса III почти совпадает со спектром излучения свободного триптофана в воде и имеет максимум при 350 нм. Такие остатки наиболее часто встречаются в развёрнутых белках и лишь иногда в нативных.
Модель дискретных состояний триптофановых остатков является статистической, т. е. нахождение остатков триптофана в окружении, приводящем к реализации выше перечисленных спектральных форм, является более вероятным, чем нахождение в другом окружении. Тем не менее, анализ формы спектров флуоресценции белков на основе этой модели часто даёт полезную информацию о локализации триптофановых остатков. Такой анализ проводится с помощью компьютерной программы, которая аппроксимирует суммарный спектр спектрами триптофанилов классов S, I, II, III путём вариации их относительных вкладов [46].
Основным принципиальным вопросом, который необходимо решить исследователю, изучающему разворачивание белка, является ли этот процесс одно- или многостадийным. Одностадийная модель является самой простой для описания конформационных переходов в белках. Однако для двух- или многостадийных переходов необходимо сравнение двух или более различных типов данных, регистрируемых в процессе разворачивания белка. Это является классическим способом разграничения одно- или многостадийного процесса. Например, описан такой подход, который включает совместное использование КД и флуорометрии, эти параметры регистрируются одновременно на одном приборе [47].
Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны граморицательных бактерий
Изучение патогенных для человека иерсиний показало, что важным фактором для развития инфекции является способность бактерий выживать и размножаться в макрофагах. Было выяснено, что Y. pseudotuberculosis и Y. pestis содержат пигментационный сегмент, входящий в состав нестабильного pgm-локуса (размером в 102-kb) вместе с так называемым островком патогенности НРI (high-pathogenicity island), который несет ген вирулентности. Этот пигментационный сегмент необходим для репликации бактерий в активированных макрофагах и ингибирует также синтез оксида азота в макрофагах, заражённых этими бактериями. Никаких исследований о взаимодействии Y. ruckeri с макрофагами не проводилось.
Одним из немногих исследованных факторов вирулентности Y. ruckeri является система захвата железа рукербактин. Захват железа важен для многих патогенов, так как позволяет успешно конкурировать с организмом хозяина за ионы Fe3+, необходимые для роста и размножения. Он осуществляется с помощью сидерофоров - низкомолекулярных веществ имеющих высокое сродство к ионам Fe3+. Было показано, что гены, ответственные за синтез сидерофора у Y. ruckeri, активируются во время инфекции. Они также регулируются температурой окружающей среды, способствуя максимальной экспрессии рукербактина при 18 оС, температуре инфекции, и замедляя ее при 28 градусах, оптимальной температуре роста. Химическая структура и путь биосинтеза рукербактина не исследован. В результате анализа нуклеотидной последовательности рецептора рукербактина показано Анализ нуклеотидной последовательности рецептора рукербактина показал его большее сходство с рецептором феррихризобактина известного патогена растений Erwinia chrysantemii, чем с соответствующими рецепторами родственных иерсиний. Более того, для протеазы Yrp1, чьё участие в процессе патогенеза Y. ruckeri было доказано, обнаружена высокая степень гомологии с PrtG протеазой E. сhrysantemii, что позволяет сделать вывод о большей близости Y. ruckeri к E. сhrysantemii в плане механизмов патогенеза, чем к другим патогенным иерсиниям [146].
Yrp1 протеаза является 47–kDa металлопротеазой, которая продуцируется в клетках на стадии окончания экспоненциального роста. Исследования показали, что Yrp1 расщепляет различные виды внеклеточной среды и мускульные ткани, что может приводить к изменениям в мембранах и порах капилляров. Предполагается, что это, в свою очередь, вызывает кровотечения и типичные для ERM симптомы [148]. Применение технологии экспрессии в естественных условиях (IVET) к Y. ruckeri позволило идентифицировать два соседних гена, которые представляют бактериальную систему, участвующую в поглощении и деградации L-цистеина. Было показано, что обнаруженный оперон, названый cdsAB, учавствует в патогенезе Y. ruckeri [151].
Участие порообразующих белков НМ в патогенезе иерсиниозной инфекции, вызываемой Y. ruckeri, пока не рассматривалось. Однако данные, основанные на предыдущих исследованиях поринов различных патогенных грамотрицательных бактерий, свидетельствуют о том, что эти белки являются высоко иммуногенными компонентами НМ иерсиний. Показано, что антитела к ним обнаруживаются как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. Порины представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета организма-хозяина, а также выступают в качестве эффекторов патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в макрорганизме. Всё это позволяет предполагать значимую роль поринов в процессе развития инфекции и в случае Y. ruckeri.
Выяснение роли поринов Y. ruckeri в процессе патогенеза, а также взаимосвязи их структуры и функциональной активности расширит представления о механизмах патогенеза для многих грамотрицательных бактерий.
Бактерии рода Yersinia играют существенную роль в инфекционной патологии человека. Этим объясняется внимание исследователей к изучению антигенов, входящих в состав НМ этих микроорганизмов, в частности порообразующих белков. Сведения о структуре, функциональной активности и иммунобиологических свойствах неспецифических поринов рода Yersinia, представлены в серии работ, выполненных в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ им.Г.Б. Елякова. Так, для некоторых представителей микроорганизмов рода Yersinia (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. frederiksenii и Y. kristensenii) определен полипептидный состав НМ бактерий и идентифицированы порообразующие белки [152 - 154].
Существование недавно открытого порина Y. pseudotuberculosis OmpY было предсказано в результате анализа генов этого микроорганизма. Этот новый порин был экспрессирован как рекомбинантный белок в порин-дефицитном штамме E. сoli. Анализ пространственной структуры OmpY, проведённый с помощью методов оптической спектроскопии, показал его значительное сходство с OmpF порином Y. pseudotuberculosis. С помощью техники бислойных липидных мембран (БЛМ) была исследована порообразующая активность OmpY. Показано, что данный белок встраивается в мембрану в виде тримеров. Наиболее вероятный уровень проводимости каналов OmpY равен 180 пСм, что сравнимо с проводимостью OmpC порина Y. pseudotuberculosis [155].
Данные о поринах НМ других представителей рода Yersinia в литературе отсутствуют.
Известно, что иерсинии обладают широкими адаптационными возможностями, что позволяет им существовать как в паразитическом, так и в сапрофитическом состояниях [156]. Учитывая это, значительный интерес представляет изучение структурно-функциональных особенностей поринов тех видов иерсиний, которые обитают в условиях отличных от условий обитания патогенных для человека иерсиний, таких, например, как Y. ruckeri, являющейся патогеном для холоднокровных организмов (лососевых пород рыб).
Поскольку порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий, антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов, имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов. Представляет также интерес способность поринов взаимодействовать с клетками эукариот. Так, известно, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с Toll-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ иерсиний до сих пор остаются мало изученными.
Экстракция поринов неионным детергентом октилполиоксиэтиленом
Для характеристики пространственной организации исследуемых белков в растворе использовали методы оптической спектроскопии: круговой дихроизм и собственную белковую флуоресценцию. Для солюбилизации образцов поринов использовали 0.25% раствор SDS, в котором, как было показано ранее [165] не происходит денатурации OmpF порина из псевдотуберкулезного микроба.
Круговой дихроизм. Спектр КД OmpF порина в ближней УФ-области (240 - 310 нм), области поглощения остатков ароматических хромофоров и дисульфидных связей, имеет достаточно выраженную тонкую структуру, обусловленную остатками фенилаланина в области 260-270 нм, остатками тирозина в области 275-285 нм и триптофана в области 285-305нм (рис. 18, А кривая 1).
В спектре КД OmpC порина в этой УФ-области те же характеристичные полосы менее выражены и имеют меньшую эллиптичность (рис. 18, Б кривая 1). Полученные данные указывают на то, что третичная структура OmpF Y. ruckeri более жестко фиксирована в этих условиях, нежели структура OmpC белка.
Спектры КД исследуемых поринов в далекой УФ-области (190 - 240 нм), области поглощения пептидных связей, существенно различаются. OmpF белок имеет в этой области отрицательную полосу небольшой эллиптичности с «плечами» при 215 и 202 нм и положительную полосу малой эллиптичности при 195 нм (рис. 18, А кривая 2). Форма спектра КД этого порина указывает на достаточно высокое содержание -структуры и присутствие небольшого количества -спиральных участков в полипептидной цепи белка. Спектр КД OmpC порина в этой области имеет отрицательную полосу при 220 нм и положительную полосу большой эллиптичности при 197 нм, что свидетельствует о высоком содержании -спирали во вторичной структуре белка. (рис. 18, Б кривая 2).
Собственная белковая флуоресценция. Спектры суммарной флуоресценции OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri имеют различное положение максимумов. В случае OmpF порина максимум суммарной эмиссии находится при 323±1 нм, а в случае ОтрС белка - при 339±1 нм. Максимумы триптофановой флуоресценции обоих поринов находятся, соответственно, при 335±1 и 340±1 нм. Аппроксимация суммарной эмиссии исследуемых белков спектральными формами излучения остатков триптофана и тирозина (рис. 14) показала, что в случае OmpF порина 24% остатков триптофана приходится на долю III формы (максимально доступной растворителю), а в случае ОтрС белка это значение достигает 45%.
Для анализа полученных данных нужно отметить, что подобно поринам других видов иерсиний OmpF и ОтрС порины Y. ruckeri содержат по три остатка Тгр, два из которых одинаково расположены в полипептидной цепи (Тгр56 - в 3-ем -тяже, Тгр105 - в петле L3). Положение третьего остатка Тгр существенно различается: в ОтрС белке Тгр 184 входит в состав периплазматической петли Т9, а в OmpF порине Тгр212 находится в 10-ом -тяже. Моделирование положений различающихся остатков триптофанов в исследуемых белках показало (табл. 4), что Тгр 184 ОтрС порина при температуре 27 оС полностью доступен растворителю, в отличие от Trp212 OmpF порина. Данный факт хорошо обьясняет вышеописанные особенности спектров суммарной и триптофановой флуоресценции исследуемых белков при нормальных условиях.
Анализ аминокислотных последовательностей поринов Y. ruckeri OmpF (код Uniprot E2FHC9) и OmpC (идентичная на 100% последовательности с кодом C4UFZ3) проведен с помощью модуля поиска прототипов программы МОЕ 2013.08 [166]. Для поринов Y. ruckeri в качестве прототипа была выбрана кристаллическая структура осмопорина (ompk36) Klebsiella pneumoniae (код PDB 1OSM) [167]. Степень идентичности аминокислотных последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа составляют 63.5% и 75.4%, а степени подобия 72.0% и 83.0% соответственно. Выравнивание аминокислотных последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа, на основе которого построены 3D-модели мономеров поринов показано на рис. 20.
Рис. 20. Выравнивание АК последовательностей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri и прототипа осмопорина K. pneumonia (код PDB 1OSM). Внешние петли и элементы вторичной структуры указаны в соответствии с кристаллической структурой прототипа: - спиральные участки отмечены красным, -структура –синим цветом. Рисунок выполнен с помощью программы Maestro 9.3 ( )
На рис. 21 показана суперпозиция пространственной структуры мономеров исследуемых поринов и прототипа. Качество построенных моделей проверено программой МОЕ. Суперпозиция всех С-атомов 3D-моделей поринов Y. ruckeri и прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения для OmpC и OmpF поринов составляет 0,68 и 0,77 соответственно. Основные отличия в структуре мономеров OmpC и OmpF поринов Yersinia ruckeri от прототипа наблюдаются в области внешних петель (рис. 21).
3D-суперпозиция моделей мономеров OmpС (А) и OmpF (Б) поринов Y. ruckeri и осмопорина Klebsiella pneumonia (код PDB 1OSM). Структуры белков показаны в виде ленточных диаграмм. OmpС и OmpF порины Y. ruckeri показаны оранжевым цветом и осмопорин Klebsiella pneumonia показан розовым цветом. На рисунке отмечены положения N-и C-концов и внешних петель.
Теоретические модели пространственных структур OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri построены методом сравнительного моделирования с помощью программы МОЕ 2013.08 (рис. 22). После 3D-протонирования окончательной модели проводилась оптимизация структуры молекул методом минимизации энергии с потенциалом сил Amber12:EHT. Величина потенциальной энергии 3D-моделей OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri составляет -17794,8 кДж/моль и -19882,6 кДж/моль соответственно.
Структуры мономеров Y. ruckeri по аналогии с прототипом представляют собой -баррель (бочонок), образованный 18-ю -тяжами, связанными восемью короткими периплазматическими петлями Т1-Т8 и восемью петлями различной длины L1-L8 (Рис. 22 и 23). Петля L2 участвует в образовании олигомерной структуры поринов. Петля L3 поринов направлена к центру поры, где она образует сужение канала. Петли L1, L4 - L8 направлены во внеклеточное пространство.
Теоретические модели пространственных структур мономерв OmpF (а, в) и OmpС (б, г) поринов Y. ruckeri (а, б - вид сбоку, в, г – вид сверху). Структуры белков показаны в виде ленточной диаграммы (-структура отмечена желтым цветом, -спирали красным цветом, изгибы синим цветом и неупорядоченная структура –белым цветом). На рисунке отмечены положения N- и C-концов и внешних петель L1-L8.
3D-суперпозиция моделей мономеров OmpС и OmpF поринов Y. ruckeri. Структуры белков показаны в виде ленточных диаграмм желтого (OmpС) и розового (OmpF) цвета. Остатки триптофанов показаны в объемном виде. Остаток Trp 212 OmpF порина показан розовым цветом и остаток Trp 184 OmpC порина – желтым цветом. На рисунке отмечены петли L4-L7, для которых наблюдаются наибольшие различия в структуре.
Однако, несмотря на сходство основных элементов пространственной структуры, OmpC и OmpF порины Y. ruckeri у этих обнаружены некоторые различия, например, в локализации одного из остатков остатков Trp (рис. 23). Так, Trp212 в 10-м -тяже в OmpF белка входит в состав так называемого гидрофобного пояса (гирлянды), расположенного на внешней стороне барреля, что предполагает его взаимодействие с другими расположенными вблизи ароматическими остатками. Trp184 находится в цитоплазматической петле Т5, не имеет такого гидрофобного окружения и «выходит» на поверхность молекулы порина. Петли L4, L5 и L6 OmpC порина более длинные, а петля L7 более короткая, чем соответствующие петли OmpF порина. Остальные элементы пространственной структуры проявляют значительное сходство в строении. Анализ контактов в структуре мономеров показал, что структура порина стабилизирована водородными связями, гидрофобными контактами и ионными связями (табл. 5).
Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов
Для разрушения бактерий Y. ruckeri их обрабатывали с использованием ультразвукового дезинтегратора (УЗДН-2Т, Россия) при 44 мГц на ледяной бане 10 раз по 1 мин с перерывом на охлаждение смеси 1-2 мин. Не разрушенные клетки удаляли центрифугированием в течение 5 мин при 5 тыс g. Супернатант центрифугировали в течение 1 ч при 18 тыс g. Затем полученную фракцию «сырых» мембран последовательно экстрагировали 5 раз 0.5%-ным раствором POE и 4 раза - 3%-ным раствором POE. После каждой экстракции образцы центрифугировали в течение 5 мин при 12 тыс. g и отбирали супернатант.
Экстракция ионным детергентом SDS Микробную массу обрабатывали 0.5%-ным раствором саркозилата натрия в течение 12 ч, затем последовательно центрифугировали: не разрушенные клетки удаляли в течение 5 мин при 5 тыс g, для удаления белков цитоплазматической мембраны супернатант центрифугировали ч при 18 тыс g. Осадок обрабатывали ДНКазой в течение ночи и центрифугировали 1 ч при 18 тыс g. Затем осадок суспендировали в буфере А, содержащем 2%-ный SDS, перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем центрифугировали 1 ч при 18 тыс g для выделения комплекса пептидогликан (ПГ)-белки НМ. Фракцию, содержащую ПГ-ассоциированные белки экстрагировали в течение 1 ч буфером А, содержащим 1% SDS и 0.5М NаCl, центрифугировали в течение 1 ч при 18 тыс. g и отбирали супернатант. Полипептидный состав фракции контолировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза.
Очистка тримеров порина. Очистку поринов проводили с помощью гель-хроматографии на Сефакриле S-300. Для элюирования белков использовали буфер А содержащий 0.25%-ный SDS. Степень очистки полученных образцов порина анализировали с помощью SDS, ПААГ-электрофореза [326] и N-концевым анализом.
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Cecil CE 7200 (Англия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при ширине щели 1 нм. Поправку на светорассеяние раствора белка проводили, как описано в работе [180]. Удельный коэффициент поглощения А 0,1%/1 см порина принимали равным 1.00.
Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре Jasco-500А (Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 мм для пептидной и 1 см для ароматической областей спектра. В пептидной области спектра эллиптичность считали как эллиптичность среднего остатка, принимая среднюю молекулярную массу аминокислотного остатка равной ПО Да, в единицах град-см2/дмоль по формуле: [] = набл"8-110/10-c-1, где S - чувствительность шкалы прибора, с - концентрация белка, мг/мл, 1 -длина оптического пути, мм. В ароматической области спектра эллиптичность считали как молярную эллиптичность []М с молекулярной массой мономера порина, равной 40 кДа и тримера порина, равной ПО кДа. Шкалу спектрополяриметра калибровали по 0.06%-ному водному раствору аммониевой соли 10-сульфоната-D-камфорной кислоты. Отношение эллиптичностей полос при 191 и 290 нм составляло 2.05.
Спектры флуоресценции поринов измеряли на спектрофлуориметре Hitachi 850 (Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Возбуждение флуоресценции проводили светом с длинами волн 280 и 296 и 305 нм. Спектры флуоресценции, корректированные по родамиду В (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буферного раствора. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм. Разложение экспериментальных спектров на компоненты [181] соответствующие излучению спектральных форм остатков триптофана в белке, проводили, используя программу оптимизации, основанную на методе Марку ардта [182].
БЛМ получали из 1%-ного раствора 1-моноолеоилглицерина в н-гептане. Способ формирования бислойных липидных мембран (БЛМ), а также описание установки и методика измерения электрических параметров в БЛМ приведены в работе [179].
Образцы порина (в заданных концентрациях) добавляли в водную фазу до формирования БЛМ. Все эксперименты проводили при одинаковых стандартных условиях: 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.8 при комнатной температуре (22С). Для определения термоустойчивости функционально активной конформации исследуемого белка образцы порина инкубировали при температуре 85 и 95С и использовали для рекострукции в бислой. Через 5 мин и 1 ч после формирования БЛМ регистрировали ток через бислой при мембранном потенциале -20 или -50 мВ.
Микрокалориметрические методы исследования. Температурную зависимость избыточного удельного теплопоглощения растворов порина в буфере А, содержащем 0.25 % SDS, регистрировали с помощью дифференциального адиабатного микрокалориметра ДАСМ-4 (ИБП РАН, Пущино, Россия). Для измерения базовой линии обе калориметрические ячейки заполняли растворителем. Для измерения теплоемкости одну из ячеек заполняли раствором исследуемого образца порина. Ошибка измерения составляла не более 5%. Все измерения проводились со скоростью нагревания 1 К/мин. Все измерения проводили при скорости прогрева 1 К/мин. Температуру термоиндуцированных переходов (при данной скорости сканирования) определяли в точке максимума температурной зависимости избыточного теплопоглощения. Точность определения температуры соответствовала 0.1С. Температура, при которой наблюдалось максимальное теплопоглощение, регистрировалась как температура фазового перехода (Tmax). Экспериментальные термограммы обрабатывали согласно [183].
Анализ аминокислотных последовательностей поринов Y. ruckeri OmpF (код Uniprot E2FHC9) и OmpC (идентичная на 100% последовательности с кодом C4UFZ3) проведен с помощью модуля поиска прототипов программы МОЕ 2013.08 [166]. Для поринов Y. ruckeri в качестве прототипа была выбрана кристаллическая структура осмопорина (ompk36) Klebsiella pneumoniae (код PDB 1OSM) [167]. Теоретические модели пространственных структур OmpF и OmpC поринов Y. ruckeri построены методом сравнительного моделирования ( ) с помощью программы МОЕ 2013.08. После 3D-протонирования окончательной модели проводилась оптимизация структуры молекул методом минимизации энергии с потенциалом сил Amber12:EHT. Пространственные структуры неспецифических OmpC и OmpF поринов Y. ruckeri использовали для расчета содержания элементов вторичной структуры с помощью программы VEGA ZZ.
