Введение к работе
Актуальность проблем. Генерация нервного импульса, его распространение и передача от одного нейрона другому - эти процессы, лежащие в основе функционирования нервной системы, являются предметом исследования современной физико-химической биологии и вейрохимии. Однако если первые два в настоящее время подробно изучаются уже на молекулярном уровне - достаточно сказать, что установлены первичные структуры и предложены модели пространственной организации ацетилхолино-вых рецепторов и потенциалчувствительных натриевых каналов - то механизм последнего, не смотря на впечатляющие успехи электрофизиологических, фармакологических и электронномикроскопических исследований, не выяснен до конца даже на функциональном уровне, а с точки зрения биоорганической химии является фактически "terra Incognita".
Передача нервного импульса осуществляется в синапсе - области близкого контакта двух возбудимых клеток, образованного пресинапти-ческой мембраной аксоналъного окончания нейрона, передающего сигнал, и постсинаптической мембраны воспринимающей клетки. Пресинаптичес-кая мембрана осуществляет секрецию нейромедиаторов, являющуюся важным звеном передачи нервного импульса. В настоящее время ведется интенсивный поиск белков, участвующих в выполнении этой специализированной функции нервного окончания.
Весьма плодотворными в этих поисках оказались иммунохимические, гвнноинженерные методы и исследования синаптических процессов фосфо-рилирования: благодаря им идентифицированы, выделены и частично охарактеризованы такие специфические для нервных окончаний белки, как синапсин, синаптофизин, синаптобревин, Р65, В-50. Установлены первичные структуры и некоторые функциональные свойства части из них, предложены модели их пространственной организации и высказаны гипотезы об их роли в выбросе нейромедиаторов.
Другим перспективным подходом в этом направлении явилось использование нейротоксинов, специфично воздействующих на секреторную функцию нервного окончания. Один из таких токсинов - а-латротоксин из яда паука каракурта - активирует нейросекреторный процесс в различных синапсах млекопитающих. С помощью меченного иодом-125 латроток-сина (ЛТ) были идентифицированы и изучены специфичные мембранные рецепторы из мозга ряда животных и культивируемых секреторных клеток PG-I2. Были получении данные, указывающие на локализацию рецептора ЛТ на внешней стороне пресинаптической мембраны, взаимосвязь с метаболизмом фосфоинозитидов, и возможную функцию кЕтионного, преимущес-
твенно кальциевого, канала, а также на существование эндогенного ли-ганда к ЛТ-рецептору. Высказывались гипотезы о связи рецептора ЛТ с системой цитоскелетных элементов нервного окончания, регулирующих транспорт синаптических везикул. В 1985 году Meldolesl с соав. осуществили солюбилизацшо рецептора и показали возможность использования аффинной хроматографии для выделения рецепторних молекул. Согласно данным этих исследователей, при хроматографии солюбилизирован-ных мембран из мозга быка на иммобилизованном ЛТ задерживаются белки с молекулярной массой 200 000 и 54 000, причем первый после восстановления дисульфидных связей образует полипептиды с молекулярной массой около 66 000. Согласно другим данным, рецептор ЛТ в синапто-сомзх из мозга крыс обладает молекулярной массой около 95 000 (Ушка-рев и Гришин, 1936). Однако, поскольку эти работы носили аналитический характер, окончательный вывод о молекулярных характеристиках рецептора сделать было сложно.
Цель работы. Настоящая работа является частью комплексных исследований, проводимых в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР, по изучению структуры и функции пресинаптического рецептора нейротоксина каракурта. Данная работа посвящена разработке метода препаративного выделения белков рецепторного комплекса, характеристике его состава, идентификации собственно рецептирующих компонентов, выделению отдельных белков комплекса в индивидуальном виде и их химическому анализу.
Научная новизна и. практическая ценность работы. Предложен простой эффективный метод выделения пресинаптического рецептора нейротоксина каракурта из мембран коры головного мозга быка, позволяющий получать рецепторные белки з препаративных количествах. Впервые показано, что в состав рецептора входят белки с молекулярной массой 200 000, 160 000, 79 000 и.45 000 в соотношении 1:1:2:2. Установлено, что функцию связывания с нейротоксином выполняют гликопротеины мол. массы 200 000 и 160 000; определены параметры связывания Я. и В С помощью пептидного картирования установлена существенная гомология в первичной структуре собственно рецептирующих белков. Впервые выделены в индивидуальном виде все компоненты рецептора, определены их аминокислотные и углеводные составы.
Разработка препаративного способа очистки рецептора и методов выделения его индивидуальных компонентов позволила приступить к иссле-
цованию первичной структуры этих белков и определению их эндогенных функций, что открывает широкие возможности для изучения и понимания зространственной организации и молекулярных механизмов функционирования как самого рецептора, так и пресинаптической мембраны в целом.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работ.
Апробация работы. Основные результаты докладывались на V и VI конференциях молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии ( Путино, 1988; Бехель, 1989); I испано-советском конгрессе по физико-химической биологии (Гранада, 1937); на V Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Рига, 1988); на XIX конгрессе Международного союза биохимиков (Прага, 1988); на I Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 1989); на 12 встрече Международного общества нейрохимиков ( Альгав, 1989).
Объем райотн. Диссертация изложена на i.ZS страницах машинописного текста. Она состоит из введения, обзора литературы "Специфические белки пресинаптических окончаний", главы, посвященной результатам и их обсуждению, из экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает < наименования.
