Введение к работе
Повсеместное присутствие патогенных микроорганизмов является одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, и способность противостоять их воздействию является ключевым моментом в жизни биологического вида. В ходе эволюции растения и животные выработали ряд эффективных защитных механизмов. Важнейшим компонентом защитной системы высших животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма и наличием иммунной памяти. Для растений описаны такие характерные только для них защитные стратегии как гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или сокращенно PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием.
Среди всех имеющихся в арсенале у растений защитных механизмов особый интерес у исследователей вызывает синтез PRP. Стресс-индуцируемые белки растений подразделяются на 17 классов и синтезируются только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитопатогенов, дефицит влаги, механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Общим для PRP является относительно низкая молекулярная масса, устойчивость к воздействию протеаз и сред с низкими значениями рН, наличие сигнальной последовательности в структуре предшественника, преимущественно внеклеточная локализация и антимикробная активность. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое число PRP из различных растений. Однако механизмы антимикробного действия большинства растительных антибиотиков до конца не исследованы и находятся в стадии изучения.
Интерес исследователей к PRP растений обусловлен возможностью их применения в сельскохозяйственной отрасли, которая несет огромные убытки из-за потери урожая культурных растений, поражаемых патогенными микроорганизмами, вирусами и
насекомыми-вредителями. Традиционные методы борьбы, основанные на искусственной селекции растений, в последнее время становятся неэффективными вследствие опережающей автоселекции патогенных микроорганизмов. Применение пестицидов и инсектицидов имеет такие негативные последствия как загрязнение окружающей среды, гибель непатогенной микрофлоры, насекомых и птиц, а также появление устойчивых патогенных микроорганизмов и насекомых. В этой ситуации перспективным представляется создание трансгенных растений, имеющих низкую себестоимость и повышенную устойчивость к фитопатогенам.
Второе направление для возможного применения растительных PRP связано с их способностью наряду с фитопатогенами также эффективно подавлять рост патогенных для человека микроорганизмов. Такие характеристики как высокая специфичность действия и отсутствие токсического воздействия на животные клетки также свидетельствуют в пользу того, что растительные антимикробные белки и пептиды могут стать альтернативной заменой современных антибиотиков, эффективность использования которых постоянно снижается в связи со стремительно распространяющейся резистентностью бактерий и грибов.
Многие PRP растений имеют аллергенную природу и являются причиной развития аллергических реакций на пыльцу, растительные пищевые продукты и латекс. Обнаружение и изучение свойств новых растительных аллергенов является важным направлением экспериментальной медицины, которое не только способствует пониманию причин и механизмов развития аллергии, но и имеет важное прикладное значение. Широко используемые для проведения аллергодиагностики экстракты растительных тканей представляют собой многокомпонентные смеси, сложность стандартизации которых зачастую является причиной ложно положительных или ложно отрицательных результатов. В то же время, для лечения аллергии используются различные фармакологические препараты, направленные в основном на устранение аллергических симптомов. Природные и рекомбинантные белковые растительные аллергены могут стать основой для создания новых диагностических тест-систем, а
также использоваться для специфической аллерговакцинации, направленной на снижение реактивности организма.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в поиске, выделении и структурно-функциональном исследовании новых белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения. В качестве объекта исследования была выбрана распространенная во многих странах, но малоизученная культура - чечевица обыкновенная Lens culinaris subsp. culinaris [семейство - бобовые (Leguminosae, Fabaceae), род - чечевица (Lens)]. Предметом исследования были разработка методик выделения и очистки, изучение структуры и биологических свойств антимикробных белков и пептидов, содержащихся в проращённых семенах чечевицы обыкновенной.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
поиск новых антимикробных белков и пептидов;
разработка методик их выделения и очистки;
- определение полных аминокислотных последовательностей и структур кДНК,
кодирующих предшественники антимикробных белков и пептидов;
- функциональная характеристика выделенных веществ.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В настоящее время выделены и охарактеризованы PRP представителей различных ботанических семейств. Среди бобовых растений наиболее изученными культурами являются горох и фасоль. В ходе проведенной работы нами были обнаружены белково-пептидные антибиотики, обеспечивающие устойчивость к заболеваниям малоизученной бобовой культуры - чечевицы обыкновенной. Из проращённых семян чечевицы нами были выделены представители двух классов PRP, а именно: новый растительный дефенсин (PRP-12), подавляющий рост фитопатогенных грибов, и восемь новых липид-транспортирующих белков (Lipid Transfer Proteins или сокращенно LTP) (PRP-14), обладающих антимикробной активностью и проявляющих свойства аллергенов.
Полученные сведения обогащают наше преставление о врожденном иммунитете растений и могут стать основой для дальнейших структурно-функциональных исследований PRP белков и молекулярных механизмов их действия, а также для более детального изучения их антимикробных и аллергенных свойств с целью практического применения в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве.
Апробация работы и публикации.
Результаты исследования были представлены на VII и VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2006); на IV и V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009); Международной научно-практической конференции "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008); XVI-XXII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2010); III Российском симпозиуме "Белки и пептиды (Москва, 2007); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы", конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2008), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009). По теме диссертации опубликовано 20 работ.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа изложена на 170 страницах; содержит 16
рисунков и 10 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной
части, обсуждения результатов, выводов и библиографического списка,
включающего 378 наименований.
