Введение к работе
Актуальность проблемы.
Метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами (МТазами), играет важную роль в регуляции многих биологических процессов, таких, как репарация ДНК, защита клетки от проникновения чужеродной ДНК, регуляция транскрипции некоторых генов, конденсация хроматина и др. Одним из типов МТаз являются С5-МТазы, которые переносят метальную группу от кофактора ^-аденозил-ь-метионина (AdoMet) на атом углерода С5 остатка цитозина, образуя 5-метилцитозин. В процессе реакции AdoMet превращается в ^-аденозил-ь-гомоцистеин (AdoHcy). К настоящему времени большая часть информации о структуре С5-МТаз и их комплексов с ДНК, а также о механизме реакции метилирования, получена при изучении двух прокариотических С5-МТаз - M.Hhal и М.НаеШ. Информация о других прокариотических МТазах и эукариотических ферментах ограничена. В связи с этим, актуальной задачей является изучение механизма метилирования ДНК и структуры комплексов расширенного круга прокариотических МТаз с ДНК. Кроме того, учитывая гомологию аминокислотных последовательностей эукариотических и прокариотических МТаз, целесообразным представляется использовать последние в качестве моделей для изучения метилирования ДНК эукариотическими ферментами.
Объектом исследований в настоящей работе явились МТазы SssI и EcoRII, которые
т узнают в ДНК последовательности CG и СС /aGG, соответственно, и метилируют в них
остатки цитозина (С) по атому углерода в 5-ом положении. M.SssI является уникальной прокариотической МТазой, узнающей ту же нуклеотидную последовательность, что и
эукариотичские МТазы. Имеются данные, что эукариотические ферменты также могут
т т
метилировать С /д или СС /aGG участки. Для обеих МТаз данные рентгеноструктурного
анализа (РСА) отсутствуют, и практически неизвестно, какие аминокислотные остатки ферментов обеспечивают узнавание ДНК и принимают участие в катализе.
Метод фотоаффинной модификации (ФМ) фермента модифицированными ДНК-дуплексами, содержащими фотоактивные группы, - один из наиболее перспективных методов, позволяющих определять аминокислотные остатки или участки фермента, ответственные за связывание ДНК или осуществление катализа.
В тех случаях, когда информация о ферменте ограничена, однако имеются данные РСА для родственных ферментов, широкое применение находит метод моделирования по гомологии, позволяющий предсказать пространственную структуру фермента на основании известных структур родственных ферментов. Существует два основных метода распознавания укладки белка. Один из них основан на анализе аминокислотных последовательностей моделируемого белка и белков с известными структурами. В основе
другого метода, получившего название «протягивание нити» (threading), лежит идея о том, что одинаковую упаковку могут иметь белки и с негомологичными аминокислотными последовательностями. Существует много программ для распознавания укладки белков и поиска шаблонов для моделирования, работа которых основана на одном из этих двух методов. Каждая из программ имеет свои сильные и слабые стороны. В последнее время в области моделирования белков по гомологии был достигнут значительный прогресс, связанный с развитием метасерверов, позволяющих получать более точные предсказания за счет комбинирования результатов, полученных несколькими независимыми программами. Модели белков, построенные с использованием метасерверов, обладают достаточно высоким качеством. На основании модели фермента и его комплекса с ДНК, можно сделать предположение о том, какие аминокислоты участвуют в связывании ДНК и катализе.
Цель работы. Целью работы явилось изучение ДНК-белковых контактов в комплексах M.EcoRII и M.SssI с ДНК и определение функционально значимых областей M.EcoRII с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования.
В задачи работы входило: 1) получение конъюгатов M.EcoRII с фотоактивными аналогами ДНК-субстрата; 2) определение участков M.EcoRII, к которым происходит ковалентное присоединение фотоактивных ДНК-дуплексов; 3) моделирование комплексов M.EcoRII-ДНК-AdoHcy и M.SssI-ДНК-AdoHcy и предсказание аминокислотных остатков M.EcoRII и M.SssI, вовлеченных во взаимодействие с ДНК; 4) сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными для выявления наиболее вероятных контактов между ферментами и ДНК.
Научная новизна и практическая ценность.
Изучено взаимодействие M.EcoRII с ДНК-дуплексами, содержащими фотоактивные остатки 5-иодурацила или диазиринового производного урацила в различных положениях участка узнавания EcoRII. Субстратные свойства модифицированных ДНК-дуплексов и выходы конъюгатов M.EcoRII-ДНК зависят от природы модификации и ее локализации в участке узнавания. В случае 5-иодурацилсодержащих ДНК-дуплексов наиболее прочные комплексы M.EcoRII-ДНК и наибольшие выходы фотохимической реакции наблюдаются при модификации метилируемых остатков цитозина. Полученные данные косвенно подтверждают «выпетливание» метилируемого цитозина из двойной спирали ДНК в процессе метилирования M.EcoRII и позволяют сделать предположение, что метилируемый цитозин сближен с одним из остатков M.EcoRII (Туг, Phe, Trp, His или Met).
Проведено расщепление химическими реагентами продуктов фотоприсоединения фотоактивных ДНК-дуплексов к M.EcoRII. Показано, что метилируемый цитозин сближен с областью Leu84-Met251 в каталитическом домене M.EcoRII, а центральное основание
метилируемой цепи участка узнавания - с областью Glu339-Trp389 в ДНК-узнающем домене.
Построена модель M.EcoRII в комплексе с ДНК и AdoHcy. Согласно модели некоторые петли в большом домене M.EcoRII (в том числе и каталитическая петля) длиннее соответствующих петель в больших доменах M.Hhal и М.НаеШ. Предсказаны аминокислотные остатки M.EcoRII, взаимодействующие с ДНК. На основании сопоставления результатов моделирования с экспериментальными данными выявлены наиболее вероятные контакты M.EcoRII с ДНК.
Построена модель M.SssI в комплексе с ДНК и AdoHcy. Согласно модели структура малого домена M.SssI в целом аналогична структуре малого домена GCGC-узнающей M.Hhal, однако одна из петель в M.SssI, аминокислотные остатки которой непосредственно взаимодействуют с ДНК, более похожа на соответствующую петлю в малом домене CG-узнающей метилтрансферазы Dnmt2. Это связано с более коротким участком узнавания M.SssI и Dnmt2 по сравнению с участком узнавания M.Hhal. Предсказано, что консервативные остатки Glul86, Arg232 и Thr313 участвуют в стабилизации «выпетленного» цитозина. Особое значение имеет предсказание функции вариабельного остатка Gin 147, который совместно с Ser300 занимает пространство, освободившееся после «выпетливания» метилируемого цитозина, и участвует во взаимодействии с ДНК. Экспериментальные данные, полученные Дарий М.В., подтверждают необходимость Glnl47, Glul86, Arg232 и Thr313 для функционирования M.SssI.
Полученные в работе результаты уже были использованы {Дарий и др., 2007) и будут использованы в дальнейшем для планирования экспериментов по изучению M.EcoRII и M.SssI, а также в целом расширяют наши знания о механизме функционирования С5-МТаз, в том числе CG-узнающих МТаз млекопитающих.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001» (Москва, 2001) и Ш-ем съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 114-ти страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы (115 ссылок). Материал иллюстрирован 23-мя рисунками, 2-мя таблицами и 12-ю схемами.
![Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур](/i/i/4471/365034.png "Синтез олигонуклеотидных конъюгатов с помощью реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения и их использование в конструировании ДНК-наноструктур Устинов Алексей Викторович")
