Содержание к диссертации
Введение
1. Повреждения остатков гуанина в ДНК 9
1.1. Повреждение ДНК активными формами кислорода 9
1.1.1. Структура ДНК, содержащей 8-oxoG 11
1.1.2. Репарация 8-охоО-ДНК 12
1.1.3. Влияние 8-oxoG на процессы, протекающие в клетке 14
1.2. Повреждение ДНК метилирующими агентами 18
1.2.1. Структура ДНК, содержащей 06meG 19
1.2.2. Ответ клетки на присутствие 06meG в ДНК 21
1.2.3. Цитотоксичность 06meG 22
1.3. Действие на ДНК бензо[а]пирена — канцерогенного полициклического ароматического углеводорода 25
1.3.1. Структура ДНК, содержащей (+)-транс- и (+)-^мс-В[а]Р-Л^~-сЮ-аддуктьі 27
1.3.2. Репарация В[я]Р-ДНК 31
1.3.3. Взаимодействие В[а]Р-ДНК с ДНК-связывающими ферментами 32
2. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНК- метилтрансфераз SssI (Spiroplasmd) и Dnmt3a (мыши) 36
2.1. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG 38
2.1.1. Выделение Dnmt3a-CD и M.SssI 38
2.1.2. Дизайн и характеристика аналогов субстратов 39
2.1.3. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 40
2.1.4. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG 43
2.1.5. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 49
2.1.6. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG 54
2.1.7. Молекулярные основы влияния 8-oxoG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК 56
2.2. Взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК, содержащей 06meG 58
2.2.1. Используемые ДНК-дуплексы 58
2.2.2. Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 06meG 60
2.2.3. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 06meG 63
2.2.4. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих О meG 64
2.2.5. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 06meG 66
2.2.6. Молекулярные основы влияния 06meG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК 67
2.3. Взаимодействие M.SssI с ДНК, содержащей (+)-ifitc-B[a]?-N2-dG 69
2.3.1. Связывание M.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)-ifuc-B[a]P-N -dG 70
2.3.2. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих (+)-ifitc-B[a]P-N -dG 73
2.3.3. Сравнение влияния (+)-цис- и (+)-mpciHC-B[a\P-N -dG-аддуктов на функционирование M.SssI 75
2.4. Заключение 78
3. Экспериментальная часть 79
3.1. Реактивы и материалы 79
3.2. Приборы и методы 82
3.3. Общие методики 84
3.3.1. Формирование ДНК-дуплексов 84
3.3.2. Плавление ДНК-дуплексов 84
3.3.3. Приготовление компетентных клеток 85
3.3.4. Выделение Dnmt3a-CD 86
3.3.5. Выделение M.SssI 87
3.3.6. Ферментативное 5'-фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов 87
3.3.7. Выделение олигонуклеотидов из геля 88
3.3.8. Определение концентрации активных молекул M.SssI с помощью метода поляризации флуоресценции 88
3.3.9. Определение Ка комплексов Dnmt3a-CD с ДНК и AdoIIcy с помощью метода поляризации флуоресценции 88
3.3.10. Определение Ка комплексов M.SssI с ДНК и AdoHcy методом равновесного конкурентного связывания с ферментом двух различных ДНК-дуплексов с помощью «торможения» в геле 90
3.3.11. Определение начальных скоростей метилирования Dnmt3a-CD 30-ти звенных ДНК-дуплексов 92
3.3.12. Метилирование Dnmt3a-CD 30-ти звенных ДНК-дуплексов в условиях «одного оборота» (интегральная кинетика метилирования) 92
3.3.13. Определение начальных скоростей метилирования M.SssI 30-ти звенных ДНК-дуплексов 93
3.3.14. Определение начальных скоростей и каталитических констант скорости реакции метилирования M.SssI В[а]Р-содержащих ДНК-дуплексов 94
Выводы 95
- Повреждение ДНК метилирующими агентами
- Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG
- Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 06meG
- Общие методики
Введение к работе
Клеточная ДНК постоянно повергается воздействию веществ, содержащихся в окружающей среде или образующихся в процессе естественного метаболизма, способных вызывать её повреждение. Это способствует возникновению мутаций и нарушению функционирования различных систем клетки.
Мишенями для повреждающих агентов во многих случаях служат остатки гуанина. Основным источником эндогенных повреждений гуанина являются активные формы кислорода, приводящие преимущественно к образованию 7,8-дигидро-8-оксогуапииа (8-oxoG) — биомаркера окислительного стресса. Взаимодействие ДНК с некоторыми продуктами катаболизма, а также метилирующими агентами, содержащимися в окружающей среде, приводит к появлению в ДНК очень токсичного для клетки О -метилгуанина (О meG). Среди загрязнителей окружающей среды одним из наиболее распространённых является бензо[а]пирен (В[а]Р). В процессе метаболизма в эукариотических клетках В[а]Р активируется до реакционноспособных диолэпоксидов, которые ковалентно присоединяются к ДНК по экзоциклической аминогруппе гуанина с преимущественным образованием (+)-цис- и (+)-/и>анс-стереоизомерных B[dJP-N"-dG-аддуктов.
Действие окислительных и метилирующих агентов и В[а]Р на остатки гуанина в ДНК клеток млекопитающих может нарушить процесс ферментативного метилирования CG-последовательностей ДНК по атому углерода С5 остатков цитозина. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов, в том числе транскрипции генов. Изменение активности генов, часто ассоциированное с аберрантным метилированием ДНК, является фактором, запускающим развитие многих заболеваний, в числе которых рак, диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-ДНК-метилтрансферазами (МТазами) Dnmtl, Dnmt3a и Dnmt3b. Эти ферменты обладают сложной структурой, а молекулярные механизмы их действия ещё мало изучены.
Показано, что все три МТазы важны как для установления, так и для поддержания нормального уровня метилирования ДНК. Представляется важным изучение влияния повреждений ДНК, приводящих к образованию 8-oxoG, 06meG и B[a]P-JV2-dG, на функционирование МТаз.
Объектом исследования в настоящей работе стал каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD). В качестве второго объекта была выбрана прокариотическая МТаза SssI (M.SssI), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую CG-последовательность и традиционно используется в качестве модельного фермента при изучении эукариотических МТаз.
Целью работы явилось определение влияния повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование каталитического домена Dnmt3a мыши и M.SssI из Spiroplasma.
В работе решались следующие задачи: 1) исследование влияния 8-oxoG, 06meG и (+)-ijuc-B[a]P-N -dG на различные стадии реакции метилирования ДНК каталитическим доменом Dnmt3a и M.SssI и 2) определение возможных молекулярных механизмов действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование Dnmt3a-CD и M.SssI.
Повреждение ДНК метилирующими агентами
Действие некоторых продуктов катаболизма и Б-аденозил-ь-метионина на ДНК приводит к появлению О -мети л гуанина (О meG). Известно, что в ДНК клеток млекопитающих О meG образуется в небольших количествах, но обладает очень сильными мутагенными, канцерогенными и цитотоксическими свойствами [2,8,62-64]. По различным оценкам содержание 06meG в ДНК лейкоцитов крови человека варьируется от 7 до 180 нмоль/(моль гуанинов), что примерно соответствует 10-300 повреждённым остаткам на клетку [65,66]. Однако содержание 06meG может меняться при хронических воспалительных заболеваниях или постоянном внешнем воздействии сильных метилирующих агентов. Такие вещества широко распространены в окружающей среде, содержатся в пище и образуются из предшественников, входящих в состав табачного дыма [4,67,68]. Электрофильной атаке метилирующих агентов в ДНК чаще всего подвергается атом азота N7 остатка гуанина, который проявляет наиболее сильные нуклеофильные свойства [3,4]. In vivo среди всех возможных повреждений гетероциклических оснований метилирующими агентами на Л -метилгуанин приходится до 85.5% [4]. Далее в ряду уменьшения нуклеофильности в двухцепочечной ДНК располагаются атомы кислорода Об остатка гуанина (до 7.8%) и азота N3 остатка аденина (до 9.4%) [3,4]. Метилирование пуринов по JV3- и -положениям дестабилизирует TV-гликозидную связь, что приводит к образованию апуриновых сайтов [2,3]. Кроме того, N - и N -метилпурины эффективно удаляются из ДНК соответствующими ДНК-гликозилазами. В клетках млекопитающих время жизни Л -метиладенина составляет 3-8 часов, a JV -метилгуанина — около 36 часов [69]. Для многих метилирующих агентов обнаружены предпочтительные участки метилирования в ДНК [4,70]. Установлено, что наиболее эффективно метилируется второй остаток гуанина в последовательности 5 -NGGN-3 [71]. При этом выход О meG зависит от нуклеотида, примыкающего с 5 -стороны к метилируемому гуанину и уменьшается в ряду G A OT m5C [72].
Важно отмстить, что 06meG является одним из самых мутагенных, канцерогенных и токсичных повреждений, образующихся при действии метилирующих агентов на ДНК, несмотря на то, что встречается достаточно редко [64,73]. Повышенный интерес к изучению влияния 06meG на биологические процессы также связан с тем, что многие препараты, применяемые при химиотерапии рака, способны алкилировать ДНК [5], при этом некоторые из них приводят к образованию 06meG [74,75]. Методами ЯМР и РСА установлено, что присутствие 06meG напротив цитозина в двойной спирали ДНК нарушает её структуру [76]. При физиологических значениях рН в паре C-06meG между основаниями образуется только две водородные связи (рис. 5) [77,78]. Формирование особой конформации пары C-06meG сопряжено с нарушениями структуры углеводофосфатного остова и смещением остатков цитозина и повреждённого гуанина в малую и большую бороздки ДНК соответственно [76]. Известно, что остаток О meG способен образовывать пару с тимином, это обуславливает мутагенные свойства повреждённого остатка гуанина [76]. По данным РСА, замена уотсон-криковской пары G-C на пару 06meG практически не влияет на структуру ДНК [78]. Небольшие изменения наблюдаются только со стороны большой бороздки ДНК, вызванные наличием метальной группы в положении О6 остатка 06meG. Таким образом, введение 06meG в ДНК может повлиять на её узнавание ДНК-связывающими белками со стороны большой бороздки, в том числе МТазами. 1.2.2. Ответ клетки на присутствие OemeG в ДНК Репарация ОбтеО-ДНК в клетках человека происходит преимущественно путём прямого переноса метильной группы с атома кислорода Об повреждённого остатка гуанина на один из остатков цистеина О -алкилгуанин-алкилтрансферазы [1,8,81]. В результате реакции образуется химически стабильный S-метилцистеин, что препятствует регенерации фермента [8]. Таким образом, 96-алкилгуанин-алкилтрансфераза функционирует как суицидальный фермент, и после диссоциации комплекса фермента с ДНК подвергается убиквитинзависимой деградации [81]. Поэтому в случае внешнего воздействия алкилирующих веществ система репарации быстро насыщается [8]. В репарации 06шеО-ДНК в клетках человека также принимают участие NER и ферменты системы репарации мисматчей (MMR) [1,82]. Участок ДНК, содержащий 06meG как в паре с цитозином, так и в паре с тимином, узнается гетеродимером MutSa — компонентом эукариотической системы MMR [1,83]. В клетках человека связывание MutSa с метилированным гуанином ингибирует репарацию ДНК и инициирует апоптоз [1].
Именно с цитотоксичностью 06meG связано применение в противоопухолевой терапии некоторых лекарственных препаратов, таких, как темозоломид, прокарбазин и дакарбазин, метилирующих остаток гуанина по ([/-положению [81,84]. Процесс запуска апоптоза ещё не до конца изучен. Однако известно, что віопочение ферментов системы MMR происходит после хотя бы одного акта репликации [3,85,86]. Образовавшаяся после репликации пара 06meG узнается комплексом PCNA MutSa, который постоянно связан с хроматином [86]. Это облегчает связывание второго компонента системы MMR — гетеродимера MutLa. В результате образуется комплекс PCNA#MutSa#MutLa, который через ряд посредников передает апоптотический сигнал к каспазе-3, запускающей апоптоз. На основании того, что MutSa также узнает О meG, расположенный напротив цитозина, высказываются предположения о существовании другого механизма инициации апоптоза, не связанного с репликацией ДНК [85]. Прежде всего, цитотоксичность О meG может быть обусловлена нарушением процесса репликации ДНК. В работе [87] показано, что 06meG частично блокирует синтез ДНК in vitro фрагментом Кленова, рої бактериофага Т7, рої а и полностью блокирует pol р. В экспериментах in vivo О meG проявляет сильные мутагенные свойства, способствуя ошибочному встраиванию тимина, и, как следствие, возникновению мутаций G-C- A в 75-90% случаях [88,89]. Исследования по связыванию белка-инициатора репликации антигена Т с ДНК, содержащей последовательность инициации репликации (ориджин репликации) SV40, показали, что 06meG снижает сродство антигена Т к ориджину [90]. Авторы данной работы считают, что снижение эффективности связывания антигена Т с ОбтеО-ДНК связано с нарушением структуры повреждённой ДНК и выступанием 06-метильной группы в большую бороздку. Интересно, что несмотря на снижение сродства антигена Т к ориджину, содержащему О meG, хеликазная активность антигена Т значительно возрастает. Таким образом, присутствие О meG в местах инициации репликации может нарушить жёсткую регуляцию этого процесса и способствовать случайному инициированию синтеза ДНК.
Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 8-oxoG
Изменения скорости метилирования ДНК Dnmt3a-CD при замене остатков гуанина на 8-oxoG, прежде всего, могут быть связаны с изменением сродства МТазы к повреждённым субстратам. Чтобы это проверить, было изучено связывание флуоресцентно-меченных S-oxoG-содержащих ДНК-дуплексов с Dnmt3a-CD методом поляризации флуоресценции. Связывание проводили в присутствии аналога кофактора 8-аденозил-[/-гомоцистеина (AdoHcy), который способствует образованию специфического комплекса С5-МТаз с ДНК [194,195] и предотвращает побочную реакцию дезаминирования цитозина [196-198]. За образованием фермент-субстратного комплекса при титровании ДНК аликвотами фермента следили по увеличению значения поляризации флуоресценции (Р) реакционной смеси. Стоит отметить, что традиционный метод определения констант диссоциации (Ка) ДНК-белковых комплексов с помощью «торможения» в геле в нашем случае применить было нельзя. Комплексы Dnmt3a-CD с ДНК очень плохо входили в гель и разрушались в процессе электрофореза. Основываясь на ранее полученных данных, показывающих отсутствие влияния FAM-метки на формирование комплексов МТазы с 18-ти звенными дуплексами [162], было сделано предположение, что FAM-метка не оказывает воздействия на стабильность комплексов Dnrat3a-CD с 30-ти звенными субстратами. В каждой точке титрования конечное значение Р достигалось через две минуты и в течение последующих 90 мин оставалось практически неизменным (значение Р уменьшалось меньше, чем на 10%). Контрольные эксперименты показали, что увеличение концентрации глицерина (максимальная концентрация глицирина составляла 2.5%) в реакционной смеси при титровании ДНК раствором Dnmt3a-CD, содержащим 13.5% глицерина, не влияет на значение Р. В случае дуплексов fGCGC/CGMG, fGCGC/CGMX, fGCGC/CXMG и fGCGCTC/CGMGAX кривые связывания были похожи на гиперболические кривые (рис. 15), обычно наблюдаемые при связывании белков с ДНК в соотношении 1:1.
Однако в случае дуплексов XCGC/CGMGf и GCXC/CGMGf кривые связывания носили чётко выраженный сигмоидальный характер, что обычно указывает на наличие положительной кооперативности. Поэтому данные по связыванию были обработаны в координатах Хилла (вставка на рис. 15). Значения коэффициента Хилла варьировались от 1.2 для fGCGC/CGMX и fGGGC/CXMG до 1.8 для XCGC/CGMGf и GCXC/CGMGf. Однако при расчёте К& фермент-субстратных комплексов модель Хилла имеет серьёзные ограничения, так как не учитывает изменение равновесной концентрации свободного фермента в результате его связывания с субстратом, которая значительно меньше общей концентрации Dnmt3a-CD, что следует из образования прочных фермент-субстратных комплексов. Поэтому далее для определения Кл фермент-субстратных комплексов, полученные данные по связыванию были обработаны в соответствии с несколькими другими моделями. 1) Модель связывания фермента с ДНК со стехиометрией 1:1 в двух вариантах, в которых за связывающую белковую единицу был принят мономер или димер Dnmt3a-CD. В обоих случаях данная модель давала значительную систематическую погрешность как для дуплекса fGCGC/CGMG, так и для дуплексов XCGC/CGMGf и GCXC/CGMGf. В связи с этим данная модель была отклонена. 2) Использование модели, предполагающей независимое связывание двух белковых единиц с одной молекулой ДНК, не привело к существенному улучшению ситуации. 3) Значительное снижение систематической погрешности было достигнуто при использовании модели, представленной на схеме 1. дуплекс, ES и E2S — фермент-субстратные комплексы. Схема 1 Суть модели заключается в последовательном связывании с одной молекулой ДНК двух белковых единиц, которые представляют собой гомодимеры Dnmt3a-CD. Данная модель связывания описывается системой уравнений (1)-(5) и позволяет рассчитать значения di и Kd2 фермент-субстратных комплексов, образующихся соответственно на первой и второй стадиях связывания. поляризации rElfSl/rESl = К (2) флуоресценции свободной и полностью связанной ДНК соответственно; [Е]о — общая концентрация Dnmt3a-CD; [S] и [Е] — равновесные концентрации [Ь\ + [ЬЬ\ + 2Ь2Ь] = EJ0 (4) свободных ДНК и фермента соответственно, [S]0 — [S] + [ES] + [E2S] = [S]0 (5) общая концентрация ДНК. Предполагается, что значение Р комплекса E2S в два раза больше значения Р для ES, а объём Ег приблизительно-в два раза больше объёма, занимаемого Е. Предположение о гомодимере Dnmt3a-CD в качестве связывающей белковой единицы подтверждается тем, что значение разности (Ртах - -РоХ которое пропорционально объёму комплекса белка с 30-ти звенным субстратом, в случае Dnmt3a-CD составляет 0.32- 0.35 (рис. 15), тогда как комплексу M.SssI с таким же дуплексом соответствует значение 0.09 -0.11 (данные получены совместно с Н.А. Черепановой). Так как молекулярные массы мономерных форм ферментов Dnmt3a-CD и M.SssI составляют соответственно 36 и 44 кДа, то наблюдаемые значения (Ртах — Л)) указывают на связывание с одним ДНК-дуплексом, по крайней мере, четырёх мономеров Dnmt3a-CD.
Предположение о составе комплекса Dnmt3a-CD с ДНК соотносятся с данными РСА комплекса Dnmt3a-CD с регуляторным фактором Dnmt3L, который представляет собой гетеротетрамер, состоящий из двух мономеров Dnmt3a-CD и двух мономеров Dnmt3L (3L»3a»3a»3L) (рис. 16А), при этом данные мутационного анализа свидетельствуют о том, что гомодимер Dnmt3a-CD сам по себе каталитически не активен [199,200]. В процессе написания работы появились данные о том, что потеря контактов между мономерами Dnmt3a-CD не только блокирует метилирование, но и приводит к потере ферментом способности связывать ДНК [201]. При обработке кривых титрования по уравнениям (1)-(5) были определены значения констант диссоциации Км и К& (табл. 2). Важно отметить, что обработка экспериментальных данных в соответствии с уравнениями (1)-(5) в отличие от модели Хилла позволяет учесть уменьшение равновесных концентраций свободных ДНК и фермента при образовании комплекса. В случае дуплексов XCGC/CGMGf и GCXC/CGMGf, содержащих 8-oxoG в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним, значение К&\ превышало К& по крайней мере в десять раз, что свидетельствовало о снижении содержания в системе комплекса ES до стехиометрически незначительных количеств и не позволило определить точные значения индивидуальных констант. Однако значения произведений KdiK&. были рассчитаны с хорошей точностью (табл. 2). Из расчётов также следовало, что значения Кц и К&. зависимы друг от друга. Всё это предполагает, что связывание Dnmt3a-CD с данными аналогами субстратов (XCGC/CGMGf и GCXC/CGMGf) носит характер кажущейся кооперативное. Для неповреждённого субстрата fGCGC/CGMG и дуплексов, содержащих 8-oxoG в метилированной цепи (fGCGC/CGMX, fGCGC/CXMG и fGCGCTC/CGMGAX), значения Км и К& бьши похожими. Близость значений Кл\ и Клі также свидетельствует о том, что связывание Dnmt3a-CD в этих случаях носит характер кажущейся кооперативности, так как в случае реализации независимого связывания двух димеров фермента с ДНК отношение макроскопических констант (KdifKai) равнялось бы четырём [202]. Важно отметить, что метилирование второй цепи в исходном полуметилированном дуплексе GCGC/CGMGf, т.е. образование полностью метилированного дуплекса GMGC/CGMGf, способствовало увеличению кооперативности связывания, что проявлялось в увеличении значения К \ по отношению к К г и соответствующему увеличению произведения КцКйі (табл. 2).
Связывание Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими 06meG
Чтобы проверить, обусловлены ли наблюдаемые изменения степени метилирования О meG-ДНК измением сродства Dnmt3a-CD к повреждённым субстратам, было изучено связывание О meG-содержащих ДНК-дуплексов с этим ферментом, как это описано для 8-oxoG (раздел 2.1.4.) (рис.23). Различия в значениях К& для комплекса Dnmt3a-CD с неповреждённым дуплексом fGCGC/CGMG, приведённые в табл. 2 и 4, связаны с использование разных препаратов фермента, которые в процессе выделения, по-видимому, сохранили разное количество активных молекул, способных связывать ДНК. Как и в случае 8-oxoG, для дуплексов, содержащих 06meG в метилируемой цепи (YCGC/CGMGf и GCYC/CGMGf), наблюдалась наибольшая сигмоидальность кривых связывания (рис. 23). Для данных субстратов также возможно было рассчитать только произведение Кл\Кц, увеличение значения которого по сравнению с К,цК$і для fGCGC/CGMG в 70 и 130 раз соответственно, указывало на дестабилизацию фермент-субстратного комплекса, обусловленную снижением сродства Dnmt3a-CD к первому участку связывания на ДНК относительно второго (A di К , установлено в процессе обработки данных). Кривые титрования для дуплексов fGCGC/CGMG, fGCGC/CYMG и fGCGCTCTC/CGMGAGAY были похожи на гиперболические кривые, однако из соотношения значений К&\ и К& (- і К п, табл. 4) следовало, что в этих случаях связывание также носит характер кажущейся кооперативности (раздел 2.1.4.). Интересно, что небольшое улучшение связывания по сравнению с неповреждённым субстратом fGCGC/CGMG (уменьшение Км и Каї в 4.1 и 1.7 раз соответственно и уменьшение К ЦК І2 в 6.7 раза) наблюдалось только для дуплекса fGCGCTCTC/CGMGAGAY, в котором 06meG удалён от участка узнавания. Однако увеличение скорости метилирования Dnmt3a-CD дуплекса fGCGCTCTC/CGMGAGAY зафиксировано не было (табл. 4). При этом связывание дуплексов, для которых увеличение скорости метилирования было показано, либо практически не изменялось (fGCGC/CYMG), либо ухудшалось (YCGC/CGMGf). Только в случае субстрата GCYC/CGMGf, содержащего 06meG в участке узнавания рядом с цитозином-мишенью, уменьшение v коррелировало с ухудшением связывания.
Таким образом, 06meG влияет на стабильность фермент-субстратного комплекса, однако изменения степени метилирования ДНК Dnmt3a-CD, наблюдаемые при замене остатков гуанина на О meG, обусловлены другими механизмами. 2.2.4. Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих О meG Чтобы выяснить, связаны ли наблюдаемые эффекты на метилирование Dnmt3a-CD ОбтеО-содержащих ДНК-дуплексов с влиянием 06meG на соотношение продуктивного и непродуктивных фермент-субстратных комплексов или с влиянием на саму реакцию метилирования (изменением kst), было изучено метилирование в условиях «одного оборота» (при 10-кратном избытке Dnmt3a-CD по отношению к субстрату). Как видно из рис. 23, используемая концентрация Dnmt3a-CD (3 мкМ) удовлетворяет условиям насыщения и доллша способствовать связыванию всей свободной ДНК в комплекс с ферментом. Обработка полученных временных зависимостей степени метилирования Для всех дуплексов, кроме GCGC/CYMG, значение kst практически не отличалось от значения kst для неповреждённого субстрата GCGC/CGMG. В случае дуплекса GCGC/CYMG, содержащего 06meG в участке узнавания напротив цитозина-мишени, наблюдалось увеличение kst в 2.1 раза по сравнению с неповреждённым субстратом. Выход продукта реакции зависел от локализации О meG (табл. 4). Как и в экспериментах для 8-oxoG, 100%-ный выход продукта реакции не наблюдался ни для одного из дуплексов из-за образования непродуктивных фермент-субстратных комплексов. Уменьшение значения R (в 3.2 раза) по сравнению с неповреждённым субстратом наблюдалось только для дуплекса GCYC/CGMG, содержащего 06meG в метилируемой цепи в участке узнавания, для которого было зафиксировано снижение v0TH (табл. 4). В случае дуплекса YCGC/CGMG значение R немного увеличивалось (в 1.4 раза). Для субстратов GCGC/CYMG и GCGCTCTC/CGMGAGAY значение R практически не отличалось от значения R для GCGC/CGMG. Таким образом, уменьшение и увеличение скорости метилирования при локализации О meG в метилируемой цепи в участке узнавания и рядом с ним, по- видимому, обусловлено соответственно уменьшением и увеличением доли молекул Dnmt3a-CD, связавшихся в продуктивной ориентации с ДНК. Тогда как стимулирование метилирования при локализации 06meG напротив цитозина-мишени, по-видимому, связано с ускорением самой реакции метилирования (переноса метильной группы). 2.2.5. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 06meG Для того чтобы оценить влияние 06meG на функционирование M.SssI, были измерены v0 реакции метилирования полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих О meG, в условиях стационарной кинетики так же, как это описано для 8-oxoG.
Для всех используемых субстратов зависимость степени метилирования ДНК от времени носила линейный характер (рис. 25). Полученные значения v представлены в табл. 4. Видно, что M.SssI более чувствительна к присутствию О meG в участке узнавания, чем рядом с ним. Так, v0TH для дуплекса GCYC/CGMG, содержащего повреждённое основание в метилируемой цепи в участке узнавания, была в 25 раз меньше по сравнению с v0TH для неповреждённого субстрата GCGC/CGMG, а замещение остатка гуанина на 06meG в участке узнавания напротив цитозина-мишени (GCGC/CYMG) приводило к практически не оказывало влияния на скорость метилирования M.SssI соответствующих дуплексов (YCGC/CGMG и GCGCTC/CGMGAGAY). 2.2.6. Молекулярные основы влияния 06meG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК Известно, что замена остатка гуанина в CG паре на 06meG приводит к нарушению структуры ДНК: остатки цитозина и 06meG смещаются в малую и большую бороздки соответственно, изменяется структура углеводофосфатного остова, в паре C-06meG между основаниями образуется только две водородные связи (рис. 5) [76,77]. Таким образом, нарушения взаимодействия МТаз Dnmt3a-CD и SssI с ДНК могут быть обусловлены изменением контактов ферментов с углеводофосфатным остовом и основаниями (преимущественно с гуанинами) участка узнавания со стороны большой и малой бороздок. Из данных по футпринтингу M.SssI в комплексе с ДНК [210] и моделирования по гомологии комплекса M.SssI HK AdoHcy [211], известно, что M.SssI образует ряд контактов с межнуклеотидными фосфатами участка узнавания и нуклеотидной последовательности с 5 -стороны от него. Также в нашей лаборатории Е.В. Кудан и М.В. Дарий было показано, что в комплексе M.SssI с ДНК гуанин-«сирота», располагающийся напротив «выпетленного» цитозина, стабилизируется за счёт образования контактов между его функциональными группами, в том числе атомом кислорода Об карбонильной группы, и аминокислотами МТазы. Снижение способности M.SssI метилировать дуплекс GCGC/CYMG, содержащий 06meG напротив цитозина-мишени, подтверждает участие атома кислорода Об гуанина-«сироты» в стабилизации последнего. Значительное уменьшение степени метилирования M.SssI дуплекса GCYC/CGMG, содержащего 06raeG в участке узнавания рядом с метилируемым цитозином, может быть связано с нарушением контактов M.SssI с атомом азота N7 остатка 06meG в результате изменения структуры двойной спирали и смещения повреждённого остатка гуанина в большую бороздку, а также с нарушением контактов МТазы с межнуклеотидными фосфатами.
Общие методики
При формировании 18-ти звенных В[а]Р-повреждённых ДНК-дуплексов G CG/CGC, GCG /CGC, G CG/CGM и GCG /CGM неповреждённая цепь CGC или CGM смешивалась с двукратным избытком В[а]Р-содержащей цепи (G CG или GCG ) в буфере Е. Было показано, что M.SssI не связывается с олигодезоксирибонуклеотидами G CG или GCG . При формировании субстратов, не содержащих (+)-ijUc-B[a]?-N -dG, соотношение цепей было 1:1. При формировании 30-ти звенных ДНК-дуплексов, неповреждённых и содержащих 8-oxoG или 06meG, цепи смешивались в соотношении 1:1 в буфере Ж. Смеси олигодезоксирибонуклеотидов нагревали до 80-90С и охлалсдали при комнатной температуре. Плавление проводили в 150 мкл раствора 500 нМ ДНК-дуплекса в буфере Е (18-ти звенные ДНК-дуплексы) или в буфере Ж (30-ти звенные ДНК-дуплексы) на спектрофотометре «Hitachi», Model 150-20 (Япония). Образец нагревали от 40С до 95С с шагом 0.5 градуса/мин. Изменение оптической плотности фиксировали при длине волны 260 нм. Кривые плавления всех используемых ДНК-дуплексов были кооперативными. Значение Тпл определяли как температуру, соответствующую половине высоты кривой плавления. Термическая стабильность 30-ти звенных полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG или 06meG, также была изучена с помощью анализа температурной зависимости интенсивности флуоресценции комплексов ДНК с интеркалятором «SYBR Green І» на приборе для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени «АНК» (Россия). «SYBR Green I» — флуоресцентный краситель селективный к двухцепочечной ДНК (длина волны возбуждения — 488 нм, а испускания — 522 нм) [222,223]. Так как в свободном состоянии «SYBR Green I» практически не флуоресцирует, в процессе плавления ДНК-дуплекса интенсивность флуоресценции красителя падает. Плавление 2 мкМ ДНК-дуплекса проводили в пластиковой пробирке на 200 мкл в 40 мкл буфера 3, содержащего «S YBR Green І», в интервале температур от 50 до 90С с шагом 0.5 градуса/мин. Кривые плавления для всех дуплексов были кооперативными.
Температуру плавления определяли как температуру в максимуме дифференциальной кривой плавления. Для неповреждённого дуплекса GCGC/CGMG Тпл составляла 77С. Введение 8-oxoG в ДНК приводило к снижению значения Тпл на 1—1.5 градуса, а введение 06meG — на 3.5-4.4 градуса. На чашку Петри с LB-агаром, переносили небольшое количество клеток из музея BL21(DE3) Е. coli (или ER1821 Е. coli) и растили в течение ночи при 37С. Затем небольшим количеством клеток с чашки Петри инокулировали 30 мл среды SOB, содержащей 300 мкл 2М раствора Mg2+ (стерильный водный раствор 1М MgCb и 1М MgS04). Клетки выращивали при 18С с интенсивной аэрацией (частота вращения шейкера 200-250 об/мин) до достижения мутности раствора 0.6 OD600, после чего клеточную культуру охлаждали во льду в течение 10 мин и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 мин при 2500 g (при 4С). Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 10 мл охлаждённого ТВ (Terrific Broth), инкубировали 10 мин во льду и осаждали клетки центрифугирование (10 мин, 2500 g, 4С). Супернатант удаляли, клетки осторожно ресуспендировали в 2.5 мл охлаждённого ТВ и добавляли ДМСО до конечной концентрации 7%. Всё осторожно перемешивали вращением пробирки и инкубировали 10 мин во льду. Полученную суспензию расфасовывали по 200 мкл в охлаждённые пробирки и немедленно замораживали в жидком азоте (хранили при —70С) или сразу же проводили трансформацию. Для трансформации к компетентным клеткам добавляли 1-10 нг плазмиды в объёме 1-5 мкл и инкубировали 30 мин во льду, периодически встряхивая. После этого проводили «хит шок», помещали пробирку с клетками в лед на 5 мин и добавляли 800 мкл среды SOB, 10 мкл 2М раствора Mg2+ и 10 мкл 2М глюкозы. Клетки инкубировали в течение одного часа при 37С. Затем переносили 100 мкл клеточной культуры на чашку Петри с LB-агаром, содержащим антибиотик, и растили при 37С в течение ночи. Затем скалывали 1-2 колонии с чашки Петри и инокулировали 20 мл среды LB с канамицином (75 мкг/мл). Клетки выращивали в течение ночи. Выделение каталитического домена Dnmt3a, содержащего шесть аминокислотных остатков гистидина HaN-конце, проводили в клетках BL21(DE3) Е. coli с использованием плазмиды рЕТ28а (Novagen), содержащей ген Dnmt3a-CD, как описано в [174]. «Ночную культуру» (20 мл) Е. coli BL21(DE3) с плазмидой pETDnmt3a-CD в среде LB с канамицином (75 мкг/мл) разбавляли в -50 раз средой LB с тем же антибиотиком. Клеточную культуру выращивали при 32С с интенсивной аэрацией. Экспрессию белка инициировали добавление 1 мМ раствора ИПТГ при достижении мутности раствора 0.5 OD . Затем клеточную культуру растили в течении 4-х часов при 30С, после чего клетки осаждали центрифугирование на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley, Великобритания) в 8 мл буфера И. Выделение белка проводили в присутствии ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонилфторида (17 мкг/мл) и коктейля ингибиторов протеиназ Complete Mini EDTA-free (Roche) в соответствии с инструкцией. Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4С (30 мин, 13000 об/мин) на центрифуге Eppendorf MiniSpin. Супернатант пропускали через колонку с 600 мкл Со -содержащей смолы TALON для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech), уравновешенную буфером И. Колонку промывали 16 мл буфера И и 8 мл буфера К. Белок элюировали 1.8 мл буфера Л. Элюированный белок диализовали при 4С в буфере Н в течение ночи, а затем в буфере О в течение 2 ч или добавляли глицерин до конечной концентрации 40%. После диализа препарат фермента хранили при -20С.
Чистота конечного препарата Dnmt3a-CD определялась с помощью гель-электрофореза в 12.5% ПААГ в присутствии 0.1% ДСН и составляла 90% (рис. 13). Концентрацию Dnmt3a-CD определяли по методу Бредфорд и использовали в качестве концентрации мономерных форм фермента. 3.3.5. Выделение M.SssI «Ночную культуру» (10 мл) Е. сої і ER1821 с плазмидой pCAL/nH в среде LB с ампициллином (0.15 мг/мл) разбавляли в 50 раз средой LB с тем же антибиотиком. Выращивали при 37С с интенсивной аэрацией в течение 3 ч до мутности 0.6 OD600, после этого проводили индукцию 1 мМ ИПТГ и растили клетки ещё около 4 ч при 37С. Клетки осаждали центрифугированием на центрифуге Beckman Coulter J2-21 (США) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора MSE Sonifier (Crawley, Великобритания) в 5 мл буфера П с добавлением ингибиторов протеиназ: фенилметансульфонил фторид а (17 мкг/мл), лейпептина (5 мкг/мл) и пепстатина А (1 мкг/мл). Фрагменты клеток осаждали центрифугированием при 4С на микроцентрифуге. Все стадии выделения белка проводили при 4С. Супернатант пропускали через колонку с 650 мкл Со2+-содержащей смолы TALON для аффинной хроматографии (BD Biosciences Clontech). Колонку промывали последовательно 5 мл буфера П, затем 5 мл 10 мМ и 5 мл 20 мМ раствора имидазола в буфере П. Белок элюировали 1 мл 150 мМ раствора имидазола в буфере П. Далее проводили диализ против буфера Р при 4С в течение ночи, добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и БСА до концентрации 0.1 мг/мл и хранили при -20С. 3.3.6. Ферментативное 5 -фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов 5 - Р-фосфорилирование олигонуклеотидов ( 60 пмоль) Т4- полинуклеотидкиназой (10 ед.акт.) проводили в течение 60 мин при 37С в 15 мкл буфера Т, содержащего (у- Р)-АТР. Продукты, содержащие Р-метку, вместе с непрореагировавшим (у- Р)-АТР отделяли от фермента, экстрагируя последний смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в объёмных соотношениях 25:24:1 соответственно. Затем нуклеотидный материал осаждали 80%-ным раствором спирта в присутствии 0.1 М ацетата натрия.
