Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы. 7
Глава 1 Структура, функции и физиология митохондрий млекопитающих 7
1.1. Специфика генетической системы митохондрий 7
1.2. Структура, содержание генов, и организация мтДНК млекопитающих 8
1.3. Транскрипция мтДНК и процесеинг РНК 11
1.4. Репликация мтДНК
Регуляция экспрессии и репликации мтДНК 19
1.5. Нуклеазная активность в митохондриях 22
1.6. Митохондриальная РТР 23
Глава 2. Дисфункция митохондрий и нестабильность мтДНК при действии генотокстеких агентов (облучения и блеомицина) 27
2.1, Действие облучения 27
2.2.Структура и принцип действия антибиотика блеомицина 30
2.3. Апоптоз 33
Роль митохондрий в апоптозе 35
Глава 3. Происхождение и эволюция митохондрий 3 7
Часть II Собственные исследования 41
Глава 1. Материалы и методы. 41
1.1. Лабораторные животные . 41
1.2. Облучение 41
13. Выделение митохондрий мозга 41
1.4. Измерение скорости потребления 02 в суспепзии изолированных митохондрий мозга42
1.5. Измерение ДЧ'-т 42
1.6. Выделение ДНК 42
1.6.1, Выделение ДНК из митохондрий , 42
1.6.2. Выделение ДНК из цитозольной фракции (сорбция на магнинтых сорбентах) 43
1.7. Выделение РНК 43
1.7.1. Выделение РНК с использованием тиоцианата гуаншшна 43
1.7.2. Выделение РНК на магнитных сорбентах 43
1.7.3. Выделение мРНК из тотальной РНК 44
1.8. Синтез первой цепи кДНК 44
1.9. Полимеразная цепная реакция [ПЦР] 44
1.9.1. ПЦР в реальном времени , 45
1.9.1,1, Краткая теория метода ПЦР в реальном времени 46
1.10. Определи не нуклеазной активности 4S
1.11. Определение активности цитратсинтазы 49
Глава 2. Результаты и их обсуждение 50
2.1.Биогенез мтДНК в ответ на действие облучения и блеомицина 50
2.1,1.Количество копий мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей 52
2.1.2. Репликация мтДНК при действии ИР 53
2.1.3. Транскрипция мтДНК в клетках головного мозга и селезенки контрольных мышей 55
2.1.4 Транскрипция мтДНК при действии ИР 58
2.1,5. Транскрипция мтДНК при действии блеомицина 62
2.2. Элиминация фрагментов мтДНК. 66
2,2.1, Выход ДНК из митохондрий in vitro 69
2.2.2 Выход фрагментов мтДНК из митохондрий в тканях облученных мышей in vivo 73
2.3 Функциональное состояние митохондрии тканей облученных мышей 76
2.4. Эндонуклеаза-G и ее роль в фрагментации мтДНК 78
Заключение 83
Выводы 86
Список цитированной литературы 87
Список работ по теме диссертации 106
- Структура, функции и физиология митохондрий млекопитающих
- Структура, содержание генов, и организация мтДНК млекопитающих
- Лабораторные животные
Введение к работе
Актуальность проблемы.
За последние 20-30 лет сложились основные представления о структуре мтДНК, процессах ее репликации и транскрипции (Fernandez-Silva et al., 2003). В настоящее время установлено, что подавляющее большинство митохондриальных белков кодируется в ядре, синтезируется в цитоплазме в виде предшественников и импортируется в митохондрии (Iborra et al., 2004). Собственно митохондриальный геном кодирует лишь небольшое число пептидов-компонентов системы окислительного фосфорилированяя, в процессе которого синтезируется АТФ (Attardi and Shatz, 1988). Митохондриальный геном заметно отличается от ядерного: мтДНК имеет кольцевую форму, несколько отличный генетический код, наследуемость по материнской линии, полиплоидность, и транскрибируется единым полицистронным блоком.
Несмотря на относительную автономность и изолированность этой макромолекулы, ядерный геном многих видов растений и животных содержит участки с полной гомологией к фрагментам мтДНК. Например, у человека найдено несколько тысяч митохоидриальных псевдогенов, равномерно распределенных по всем хромосомам (Woischnik et al., 2002). Считается, что это следствие эволюционного процесса, в ходе которого шел перенос мтДНК в ядро. Более того, в настоящее время появились свидетельства того, что спонтанные вставки фрагментов мтДНК в ядерный геном могут привести к дисфункции генов (Turner et al., 2003).
К началу настоящего исследования в литературе практически не обсуждался факт выхода фрагментов мтДНК из митохондрий. Существовало лишь единственное предположение о возможности такого процесса, выдвинутое Д.Б. Зоровым [Zorov et al., 1997]. Тем не менее, было известно, что мтДНК, находясь в непосредственной близости от электрон-траспортной цепи, постоянно подвергается атакам сводных радикалов, приводящих к различного рода повреждениям митохондриалыгого генома. Такие повреждения выражаются, как правило, модификациями оснований, одно- или двунитевыми разрывами. Неэффективность систем репарации, постоянные атаки свободных радикалов приводят к тому, что в митохондриях возникают разные по размерам молекулы мтДНК, способные замыкаться в кольцо - явление гетероплазмии. Если такое кольцо содержит область регуляции транскрипции/репликации, то данная молекула, хотя и потеряла часть генома, способна к репликации и транскрипции. Образование делеций мтДНК показано огромным количеством авторов, однако до настоящего времени не изучен механизм их образования и, главное, не ясно, что происходит с фрагментами мтДНК, неспособными к функционированию.
Процессы репликации, транскрипции, степень фрагментации мтДНК в условиях окислительного стресса также все еще остаются недостаточно изученными, несмотря на то, что роль митохондрий широко обсуждается в процессах программируемой клеточной гибели, клеточных патологий, в канцерогенезе. В связи с этим исследование функционирования мтДНК при действии генотоксических агентов - индукторов окислительного стресса (рентгеновское, у-облучение) является не только оправданным, но и чрезвычайно актуальным.
Цель исследования. Целью настоящей работы является исследование функционирования митохондриальной ДНК клеток головного мозга и селезенки при действии генотоксических агентов.
Основные задачи исследования.
-
Исследование процессов репликации и транскрипции мтДНК клеток головного мозга и селезенки мышей в условиях окислительного стресса, вызванного рентгеновским и гамма - облучением, а также действием цитостатического антибиотика блеомицина.
-
Исследование процессов фрагментации мтДНК в клетках головного мозга при облучении мышей.
-
Выявление роли эндонуклеазы G при фрагментации мтДНК в условиях окислительного стресса.
-
Тестирование цитозольной фракции клеток головного мозга мышей и среды инкубации митохондрий в модельных системах на наличие фрагментов мтДНК.
-
Исследование процессов выхода фрагментов мтДНК из органеллы, сохраняющей свои нативные физиологические характеристики.
Научная новизна работы.
Настоящее исследование существенно расширяет современные представления о процессах репликации, транскрипции и повреждении мтДНК в условиях окислительного стресса. В данной работе приведены количественные оценки изменений указанных процессов в разных по радиочувствительности тканях (головной мозг и селезенка) мышей при рентгеновском и гамма-облучении, а также при действии цитостатического антибиотика блеомицина. Обнаружено, что вне зависимости от радиочувствительности ткани, изменения транскрипции мтДНК в условиях окислительного стресса носят универсальный характер. На фоне активации процессов репликации и транскрипции мтДНК в данных тканях происходит резкое снижение «дозы гена», в частности гена nd4, в результате процессов фрагментации мтДНК и появления крупных делеций. Исследована
роль митохондриальной неспецифической эндонуклеазы G в процессах фрагментации мтДНК.
Впервые зарегистрирован факт выхода фрагментов мтДНК из митохондрий, сохраняющих все функциональные характеристики, при участии РТР, что само по себе играет исключительно важную роль, поскольку расширяет современные представления о процессах, происходящих в митохондриях.
Научно-практическая иенность.
Фрагментация мтДНК, снижение «дозы определенного гена», появление фрагментов мтДНК в цитозоле клеток может быть в перспективе использовано при оценке генотоксическго груза при радиационных авариях, проведении курса радио- химиотерапии онкологических больных, изучении нейродегенеративных болезней человека.
Способ количественной оценки экспрессии митохондриальных генов, с применением 2-х факторов нормализации: мРНК ядерных генов и собственно митохондриальных генов может использоваться при исследовании самых разнообразных научных проблем.
Апробация диссертации.
Материалы диссертации были представлены на 8-ой и 10-ой Путинских школах-конференциях молодых ученых (Пущине, 2004, 2006 гг.); на V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006 г.); на 35-ой конференции Европейского общества радиационных исследований (ERRS) (Киев, 2006 г.).
Публикации.
Основные результаты диссертации опубликованы в 10 печатных работах, из них 4 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации.
Структура, функции и физиология митохондрий млекопитающих
Известно, что большинство клеток млекопитающих содержит сотни митохондрий, а каждая митохондрия содержит несколько (2-10) копий мтДНК [Shuster et al. 1988; Wiesner et al. 1992b]. У одного организма все копии мтДНК должны быть идентичны - состояние гомоплазмии, однако мутации могут накапливаться, сохраняться и даже амплифицироваться, что приводит к сосуществованию диких (немутированных) и мутированных форм мтДНК -состояние гетероплазмии. При каждом делении клетки митохондрии и их геномы случайным образом распределяются в дочерние клетки. В связи с этим каждая из дочерних клеток на ранних стадиях клеточного цикла обладает своим собственным уровнем гетеро- или гомоплазмии. Как следствие этого - «пороговый эффект» в возникновении мтДНК-зависимых болезней человека: в большинстве случаев, для возникновения патологии, уровень мутантных молекул мтДНК должен превышать 60-80% от общего числа копий мтДНК [Lightowlers et al. 1997; Zeviam and Antozzi, 1997].
Митохондриальный геном наследуется по материнской линии; несколько митохондрий сперматазоида, которые смогли пройти через мембрану яйцеклетки во время оплодотворения, активно элиминируются убиквитин-зависимым механизмом [Sutovsky et al. 1999,2000], Данные более поздних исследований показывают, что в некоторых случаях, отцовская мтДНК может избегать процесса активной элиминации и передаваться потомкам, как например, в мышечной ткани [Schwartz and Vissing, 2002], Во время оогенеза происходит процесс, названный «бутылочное горло», суть которого заключается в том, что лишь небольшая часть молекул мтДНК передается потомкам [Marchington et al. 1998], Этот феномен закрепляет мутации в состоянии гомоплазмии в течение одного или нескольких поколений [Zeviani and Antozzi, 1997].
Скорость эволюции мтДНК намного быстрее, чем ядерного генома [Brown et al. 1979]. Косвенным подтверждением этому является то, что мтДНК меньше защищена белками и физически ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий, в которой генерируется большое количество повреждающих мтДНК активных форм кислорода (АФК). Кроме того, в отличие от ядерной ДНК, мтДНК не имеет эффективных систем репарации [Pinz and Bogenhagen, 1998]. Высокий уровень мутабельности и материнская наследуемость делает анализ последовательности мтДНК интересным инструментом в популяциошюй генетике человека и изучение эволюции [Stoneking, 1994], С другой стороны, накопление соматических мутаций мтДНК, как было подтверждено играет большую роль в старение человека [Wallace, 1997; Michikawa et al. 1999; Hofhaus et al. 2003].
Отличительной особенностью мтДНК является и то, что гены мтДНК транслируются с использованием генетического кода, несколько отличного от универсального. Так, у млекопитающих кодон UGA, кодирующий триптофан в мтДНК, в ядерной ДНК является терминирующим; AUA, AUC и AUU являются инициирующими кодонами, a AGA и AGG вместо кодирования аргинина являются терминирующими. Более того, упрощенная система кодон-антикодонового взаимодействия в трансляции задействует только 22 тРНК [Attardi and Schatz, 1988].
Структура, содержание генов, и организация митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислота млекопитающих
Структура, содержание генов и организация мтДНК строго консервативны для всех млекопитающих. В связи с этим, мтДНК можно рассматривать как единую модель. мтДНК млекопитающих - это замкнутая в кольцо двуцепочечная молекула, размером приблизительно 16,6 Т.И.И. и молекулярным весом около 10 мегадальтон [Anderson et al, 1981]. мтДНК большинства клеток составляет не более 0,5-1% от тотальной ДНК клетки. Из-за того, что содержание G+T отличается у двух цепей мтДНК, они могут быть разделены на Н-цепь (от англ. Heavy) и на L-цепь (от англ. Light) в градиенте хлористого цезия в денатурирующих условиях. В нормальном состоянии мтДНК представлена в суперскрученной форме, и, как было сказано выше, слабо ассоциирована с белками, в отличие от ядерной ДНК [Richter et al. 1988]. Ранее предполагалось, что мтДНК человека ассоциирована с внутренней мембраной митохондрий через белок knob [Albring et al. 1977]. Однако в недавних работах, проведенных на дрожжевых клетках, показано, что мтДНК вместе с белками образует надмолекулярные структуры, названные нуклеоидами, содержащими несколько молекул мтДНК (2-4) и около 20 различных полипептидов [Miyakawa et al. 1987; Kaufman et al. 2000]. Вся эта структура, в свою очередь, ассоциирована с внутренней мембраной [Hobbs et al. 2001]. Большая часть молекул мтДНК в метаболитически активных клетках имеет трехцепочечную структуру, названную D-петлей (displacement loop), образованную участком Н-цепи длиной 500-700 п.н., частично отожженной к родительской L-цепи. D-петля - это участок мтДНК длиной, приблизительно, 1 т.п.п, (у человека) представляющий собой основной некодирующий регион, содержащий основные регуляторные элементы для репликации и транскрипции. D-петля обладает наибольшей видовой вариабельностью по последовательности и длине, однако, все же содержит некоторые консервативные последовательности, выполняющие регуляторные функции [Attardi and Schatz, 1988; Shandel and Clayton, 1997].
Митохондриальная ДНК млекопитающих содержит 37 генов: РНК трансляционного аппарата митохондрий (2 рибосомальпые РНК: 12S и 16S, а также 22 тРНК), 13 структурных генов, кодирующих компоненты системы ОФ: 7 кодируют субъединицы комплекса I (NADH-CoQ оксидоредуктазы), 1 кодирует цитохром-Ь, субъединицу комплекса III (CoQ-цитохром -с- оксидоредуктазы), 3 кодируют субъединицы комплекса IV (цитохром-с-оксидазы), и 2 кодируют субъединицы комплекса V (АТФ - синтазы) (Рис.1) Каждый из этих комплексов содержит субъединицы, кодированные ядерным геномом. После синтеза белков на ретикулуме они доставляются через цитоплазму в митохондрии, образуют комплекс активного голофермента с комплексами, синтезированными в митохондриях, и встраиваются в мембрану. Комплекс II - компонент сукцинатдегадрогеназы кодируется только ядерным геномом. Все эти гены ассиметрично распределены по всей длине мтДНК, большинство кодируется на Н-цепи, L-цепь кодирует только 8 тРНК и 1 мРНК ND6 [Attardi and Schatz, 1988].
Одна из главных харарктеристик мтДНК млекопитающих - это ее компактная организация, при которой гены без интронов следуют один за другим или же прерываются несколькими нуклеотидами [Anderson et al. 1981; Montoya et al. 1981]. Некоторые из генов даже перекрываются, как например: АТФазы 6 и 8 (46 нуклеотидов у человека) и ND4 и ND4L субъединицы (7 нуклеотидов у человека). Часть терминирующих кодонов не закодировано в мтДНК, вследствие чего они образуются при посттраскрипционном полиаденилировании соответствующей мРНК [Ojala et al. 1981]. Другим интересным свойством мтДНК является то, что гены тРНК распределены между структурными генами, что чрезвычайно важно для постранскрипционного процессинга мРНК.
В мтДНК обнаружено только два некодирующих региона, выполняющих большинство регуляторних функций. Основным является вышеописанная D-петля, расположенная между генами тРНКРЬе и тРНК 0 , содержащая точку начала репликации Н-цепи (Он) и промоторы для транскрипции Н- и L-цепей. Структура D-петли различных животных включает консервативные последовательности, известные как CSB (conserved sequences blocks) и как TAS (termination associated sequences) и тРНК-подобные вторичные структуры [Shadel and Clayton, 1997], которые, предположительно, играют роль в репликации мтДНК. Второй некодирующий регион намного короче (приблизительно 30 п.н.), содержит точку начала репликации L-цепи [OL] и локализован внутри кластера тРНК -генов, приблизительно на две трети длины мтДНКотОн(РисЛ).
Лабораторные животные
Митохондрии выделяли из мозга мышей методом Брустовецикого и Дубински [Brustovetsky and Dubinsky 1999]. После декапитации мозг быстро извлекали и помещали в ледяную среду выделения (СВ), содержащую: маннит- 225 мМ, сахароза-75 мМ, ЭГТА-1 мМ, бычий сывороточный альбумин (БСА)- 0,1%, HEPES-10 мМ, рН 7.4. Изолированный мозг промывали 2-3 раза в ледяной среде СВ, затем измельчали хирургическими ножницами в чашке Петри с небольшим количеством СВ.
Измельченную ткань помещали в стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком, приливали 10 объемов ледяной среды СВ и гомогенизировали вручную 3-4 проходами пестика, К полученному гомогенату приливали 1 объем среды СВ и центрифугировали при ускорении 2000g, 10 мин (2 С). Супернатант переносили в чистую пробирку и центрифугировали при ускорении 12000g, 10 мин. Супернатант принимали за цитозольную фракцию, а полученный осадок митохондрий ресуспепдировали в 20 мл среды содержащей: маннит- 225 мМ, сахароза- 75 мМ, HEPES- 10 мМ. Центрифугировали при ускорении 12000g в течение 10 мин.
Полученный осадок митохондрий использовали для экспериментов.
Измерение количества белка в изолированных митохондриях проводили методом Лоури с использованием БСА как стандарт. 1.4. Измерение скорости потребления 02 в суспензии изолированных митохондрий мозга.
Измерение скорости потребления ( проводили при 28 С в термостатируемой ячейке с перемешиванием в среде содержащей: маннит- 215 мМ, сахароза- 50 мМ, KCL-10 мМ, КН2Р04-1 мМ, MgCLr 0.5 мМ, HEPES-10 мМ, рН- 7.4.
Концентрация митохондрий в ячейке во всех экспериментах составляла 1мг белка/імл. Объем ячейки равен 2.5 мл. Потребление Ог митохондриями измеряли полярографически с использованием закрытого электрода типа Кларка.
Измерение ДЧ -т проводили при 28 С в термостатируемой ячейке с перемешиванием в среде, содержащей; маннит- 215 мМ, сахароза- 50 мМ, KCL-10 мМ, КН2Р04-1 мМ, MgCL2- 0.5 мМ, HEPES-10 мМ, рН- 7.4.
Измерения ДЧ -т проводили с использованием флуоресцентного зопда Rhodamine 123 [Emaus et al 1986]. Длина волны возбуждения флуоресценции зонда составляет 488 нм, длина волны регистрации флуоресценции составляет 525 нм. Концентрация зонда составляла 1мкМ. При соотношении концентрации зонда 1 мкМЛмг митохондриального белка/1мл наблюдается линейная зависимость изменений интенсивности флуоресценции зонда от изменений ДЧ -т на участке от 200 до 50 мВ и в таких концентрациях Rhodamine 123 абсолютно не влияет на параметры окислительного фосфорилирования (ОФ).
Похожие диссертации на Функционирование митохондриальной ДНК при действии генотоксических агентов
