Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Липиды нервной ткани, и их роль в функционировании клеток
1.1. Лизофосфолипиды 17
1.2. Роль липидов в функционировании нервов 20
1.3. Участие фосфолипазы А2 в метаболизме нервной ткани. 23
Глава 2. Регенерация нервных клеток после повреждений 29
Глава 3. Объекты и методы исследования 39
3.1. Объект исследования и постановка опыта 39
3.2. Экстракция липидов из нервной ткани 39
3.3. Хроматографические методы анализа 40
3.3.1. Микротонкослойная хроматография липидов 40
3.3.2. Газожидкостная хроматография жирных кислот 44
3.4. Определение активности фосфолипазы А2 в гомогенате из нервной ткани 45
3.5. Количественное определение белка 46
3.6. Регистрация потенциала действия 46
3.7. Статистическая обработка результатов 47
Глава 4. Влияние механической травмы на липидныи состав седа лищного нерва крысы . 48
4.1, Влияние длительности перетяжки на липидныи состав нерва крысы 56
4.2. Изменение состава липидов травмированного нерва в зависимости от времени прошедшего после механического воздействия 58
Глава 5. Действие ксимедона на липидныи состав седалищного нерва крысы после повреждения 70
Глава 6. Влияние ламинина иа липидный состав травмированного нерва крысы
Глава 7. Изменение активности фосфолипазы А2 при повреждении седалищного нерва крысы 86
Заключение 89
Выводы 91
Список использованных источников 93
Приложения 115
- Роль липидов в функционировании нервов
- Регенерация нервных клеток после повреждений
- Экстракция липидов из нервной ткани
- Изменение состава липидов травмированного нерва в зависимости от времени прошедшего после механического воздействия
Введение к работе
Актуальность темы. Основная функция соматических нервов заключается в проведении возбуждения. Способность нервов выполнять эти функции обусловлена наличием трансмембранного потенциала, и во многом определяется составом и свойствами компонентов биологических мембран, в том числе и липидов.
Такие продукты липидного метаболизма, как 1,2-диацилглицерол, ли-зофосфолипиды участвуют в регуляции активности фосфолипазы Аг, проте-инкиназьт С, работы ионных каналов, способны ингибировать трансмембранную передачу сигнала через рецепторы, сопряженных с G-белком (Y. Asaoka et al., 1991; Э.В. Дятловицкая и др., 1998; Н.В. Проказова и др., 1998; W.H. Moolenaar, 1999). Проницаемость клеточной мембраны зависит от модификации жирными кислотами липидных областей за счет их ионофорных и де-тергентных способиостей, а так лее специфическим взаимодействием жирных кислот с мембранными белками - АТФазами, фосфолипазами и каналообра-зующими белками. Так, арахидоновая кислота способна не только непосредственно менять активность ПКС, ионных каналов, уровень Са""1", но и служит субстратом для синтеза простаглаидииов, тромбоксанов, лейкотриенов и других биологически активных метаболитов (A.R. Brash, 2001), меняющих возбудимость нерва и характер синаптической передачи (NJ. Rothwell et al., 1995; A.EdstrometaL, 1996).
Однако высокие концентрации ряда продуктов липидного обмена могут вызывать деструктивные изменения в мембранах. Так увеличение фосфо-липазной активности, интенсификация процессов перекисного окисления липидов приводит к нарушению состояния мембраны и транспорта ионов (М.М. Taketo et al., 2002; Е. Birgbauer et al., 2004).
Таким образом, нарушение возбудимости периферических нервных волокон при травмах, ишемии, диабетической и алкогольной нейропатии во многом могут определяться изменениями липидного метаболизма. При этом особый интерес представляет исследование более поздних изменений со-
стояния клеток при повреждении, где особое внимание уделяется липидам миелинового нерва. Известно, что липидный состав меняется при различных видах повреждения клеток (М. Alberghina et al., 1988; J.E. Vance et al., 2000; Г.А. Грибанов и др., 2003). Эти нарушения проявляются в изменении вязкости плазматической мембраны, модифицируя множество клеточных процессов, включая транспорт медиаторов, активность мембрано связанных ферментов, иммунологическую и химиотерапевтическую цитотоксично сть, синтез простагландинов и, наконец, рост клетки (K.J. Smith et al., 1980; С. Ide, 1996; М. Ohlsson et al., 2004).
Ранее, было обнаружено изменение липидного состава при проведении ритмического возбуждения, ранней дегенерации нерва, вызванной его перерезкой (Д.А. Кадималиев, 1985; В.В. Ревин и др., 1987; В.Т. Николаев, 1995). В ряде работ показано непосредственное участие фосфолиапзы А2 как на начальных этапах демиелинизации, так и при восстановлении поврежденных нервов (A. Edstrom et al., 1996; М. Horafelt et al., 1999). Однако молекулярные механизмы протекания регенеративных процессов и в том числе, восстановления проводимости, затрагивающие качественные и количественные изменения в составе липидов нерва, раскрыты недостаточно. В литературе практически отсутствуют работы посвященные анализу взаимосвязи липидного состава с изменениями функционального состояния периферических нервов при патологиях.
Представляются интересными также изучение методических подходов для ускорения репарационных процессов в травмированных нервах, основным из которых является применение фармакологических стимуляторов регенерации. При этом механизмы действия многих из них остаются неизвестными.
Все эти данные позволяют считать, что мембранные липиды играют важную роль в долгосрочном функционировании нерва, а изменения липидного состава проявляются при некоторых патологиях.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение действия механической травмы и химических агентов на липидный состав соматических нервов крысы.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Изучить влияние механической травмы на изменение содержания лизофосфолипидов, свободных жирных кислот, жирных кислот фосфолипидов и неполярных липидов;
Исследовать динамику содержания физиологически активных компонентов липидного состава в условиях нарушении возбудимости нерва при различной степени повреждения;
Оценить участие фосфолипазы А2 в посттравматическом изменении липидного состава нерва;
Изучить влияние стимуляторов регенерации ксимедона и ламинина на функциональное состояние и липидный состав поврежденных нервов.
Научная новизна. Впервые исследован лизофосфолипидный и жирно-кислотный состав отдельных фракций липидов седалищного нерва крысы при их повреждении и в ходе посттравматического восстановления. Обнаружено, что в течение пяти суток в поврежденном нерве наблюдается увеличение содержания лизофосфатидилхолина и лизоф ос фатидилэтаноламина. С увеличением длительности посттравматической выдержки происходит восстановление их содержания до контрольных значений. Жирнокислотный состав липидных фракций при повреждении нерва также претерпевает качественные и количественные изменения: происходит накопление свободных жирных кислот, повышается доля длинноцепочечных и ненасыщенных жирных кислот. Ксимедон и ламинин ускоряют восстановление лизолипидного и жир но кислотного состава до контрольного уровня.
Практическая значимость. Результаты исследований позволяют расширить представления о роли липидных метаболитов в процессе нарушения
функционирования нерва при повреждении, и разработать принципы диагностики методов восстановления функций соматических нервов в клинике.
Роль липидов в функционировании нервов
Как и в любой другой ткани в нервных клетках основная функция липидов - это компартментализация различных структур с помощью мембраны. Благодаря этому клетка способна создавать и поддерживать мембранные градииты (К.П. Рябов, 1990; И. Тасаки, 1971). Последнее особенно важно для нервной ткани, поскольку проведение потенциала действия осуществляется путем кратковременного передвижения ионов по градиенту.
Большое внимание уделяется исследованию регуляторной роли мембран в клеточном метаболизме. Практически все известные функции мембран позволяют рассматривать ее как универсальную структуру, регулирующую многие процессы в клетках. Характерной чертой внутриклеточных мем 21 бран является их способность к фазовым переходам, которые, по мнению ряда исследователей, играют роль триггерного механизма в переключении клетки из одного метаболического состояния в другое. Эти переходы зачастую связаны с изменением состава или структуры липидов (Е.Б. Бурлакова, 1981).
Одним из важнейших путей регуляции клеточного метаболизма мембранами является управление работой мембрано связанных ферментов. Ли-пидное окружение необходимо для функционирования белков и организации их в ансамбли. В модельных экспериментах показано, что на активность некоторых транспортных, рецепторных белков и ферментов могут влиять вязкость липидной компоненты мембраны, концентрация липида - специфического эффектора данного фермента, а так же наличие окисленных продуктов в липидах (W. Araki et al., 1997; A. Bradford et al., 2003). Таким образом, активность мембранных белков контролируется липидным окружением через изменение его состава, фазового состояния и т.д. (Е.Б. Бурлакова, 1981; В.И. Мельгунов, 1984; С.А. Вознесенский и др., 1984; Д.А. Кадималиев, 1985). Так, показана роль аннулярных липидов в модуляции взаимодействия ней-ромедиаторов с мембрано связанными рецепторами и физическом состоянии липидного бислоя мембраны в целом (О.С. Белокоыева и др., 1993). В работах, ранее проведенных на нашей кафедре, установлено, что при проведении возбуждения изменяется фосфолипидный состав нервных проводников. Было показано, что перераспределение индивидуальных ФЛ поддерживает активность систем транспорта ионов на оптимальном для длительной работы уровне (В.В. Ревин и др., 1984; Д.А. Кадималиев, 1985; В.В. Ревин и др., 1987; В.В. Ревин, 1991). Также известно, что при уменьшении доли ФХ в митохондриях печени снижается активность моноаминооксидазы. Изменение содержания ФЭА, ФС или КЛ такого эффекта не вызывает (Л.Д. Бергельсон и др., 1981).
Многие клеточные функции зависят от вязкости мембранных липидов. Вариация профиля жирных кислот в липидах мембран может изменить включение, агрегацию, диффузионные перемещения мембранных компонентов, активность мембраносвязанных ферментов и экспрессию рецепторов, мембранную проницаемость и транспортные свойства (J.F. Mead, 1984; Г.С. Когтева и др., 1998). Жирным кислотам ФЛ свойственны структурные переходы, высокая скорость обновления как внутри одного класса, так и между классами липидов, что может иметь важное значение для функционирования возбудимых образований. Изменение проницаемости мембран может быть обусловлено как модификацией жирными кислотами липидных областей мембраны за счет ионофорных свойств, детергентных способностей и возникновения дефектов, так и специфическим воздействием жирных кислот с мембранными белками (А.А. Болдырев, 1985; В.В. Ревин и др., 1987).
Специфической для нервной ткани является функция липидов в качестве изолятора-миелина, обеспечивающего кабельные свойства нервного волокна. Мембрана Шванновских клеток, многократно обвивая нервное волокно, образуя толстую миелиновую оболочку. Благодаря этой толстой липид-ной оболочке импульс по нерву движется значительно быстрее за счет скачкообразного переноса возбуждения между немиелинезированными участками - перехватами Ранвье.
Кроме того, некоторые липиды и продукты их метаболизма могут проявлять функцию биорегуляторов. К ним относят полиненасыщенные жирные кислоты (L.N. Berti-Mattera, et al., 2000; G.K. Marathe, et al., 2000; A.R. Brash, 2001; N.G. Bazan, 2003; R.K. Petersen, et aL 2003), диацилглицерол (E. Brown, et al., 1984; V. Natarajan, et al., 1987; D. Corda, et al., 2002; K. Fukami, 2002;
J.M. Caviglia, et al., 2004), лизофосфолипиды (W.H. Moolenaar, 1999; C.Q. Duong, et al., 2004), церамиды, оксилипины и амиды жирных кислот (Ю.Е. Вельтищев и др., 1987; Э.В. Дятловицкая и др., 1998). Липидные биорегуляторы образуются из других липидов под действием ряда ферментов, из которых основную роль играют фосфолипазы (Г.С. Когтева и др., 1998). Показателен в этом плане ФИ. Это минорный компонент нервной ткани (всего 1% от общего количества липидов), но он важен как регулятор концентрации ионов кальция в нервных и других клетках (В.А. Ткачук, 1998). При действии на клетку различными факторами, через ряд превращений ФИ расщепляется на два ключевых вторичных мессенджера - инозиттрисфосфат и диацилгли-церин (М. Liscovitch, et al., 1994; К. Fukami, 2002; J.S. Rhee, et al., 2002). Ино-зиттрисфосфат вызывает мобилизацию внутриклеточного кальция, а диа-цилглицерин активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует различные белки-мишени, обеспечивая специфические ответы клеток (П.Г. Костюк, 1981; W.J. van Blitterswijk, et al., 1999; H. Kanoh, et al., 2002; Y. Jun, et al., 2004; R.V. Stahelin, et al., 2004; H. Stensman, et al., 2004). Таким путем происходит передача сигнала через плазматическую мембрану. Систему обмена ФИ регулируют многие факторы, что обеспечивает тонкую «настройку» всего клеточного метаболизма.
Таким образом, липиды являются важным компонентом мембран нервных клеток а их качественный и количественный состав - одна из основных характеристик состояния нервного волокна (R.M. Gould et al., 1.987).
Регенерация нервных клеток после повреждений
Актуальность проблемы восстановления функции нервных проводников обусловлена широким кругом патологических состояний, в которые вовлечены периферические нервные волокна. Это травмы и ишемия нервных стволов, системные расстройства метаболизма (диабетическая нейропатия), интоксикации (алкогольная нейропатия и др.), побочное действие лекарственных средств (нейропатии, вызванные цитостатиками) (S. Love, 1983; М.Е. Schwab, et al., 1996; D. Tonge, et al., 1998; S. Kogawa, et al., 2000; D. Hunt, et al., 2004; C.F. Vogelaar, et al., 2004).
В настоящий момент для восстановления нервов после повреждений развивают три фундаментальных стратегии. Они, в свою очередь, определяются хронологическим уровнем посттравматического вмешательства. Вскоре после повреждения для нейропротекции используют фармакологические препараты, уменьшающие прогрессирование вторичных повреждающих процессов, которые следуют в течение первой недели после начального повреждения. На второй стадии, немного позже повреждения, стимулируют аксо-нальную регенерацию. И, наконец, при восстановлении повреждений в ЦНС, нервные волокна которой обладают меньшей способностью к регенерации чем нервы ПНС, применяют управление травмированного спинного мозга сеисомоторным возбуждением и/или поставкой отсутствующего афферентного сигнала, типа моноаминергичных систем (Р.А. Tresco, 2000; М. Gimenez yRibottaetal.,2002).
Успех регенерации периферического нерва обеспечивают посттравма» тическое выживание нейронов, эффективная элонгация аксона в потенциальном пространстве роста в условиях адекватного микроокружения и восстановление специфических нервных связей между регенерирующим аксоном и тканью-мишенью (Ю.А. Челышев и др., 2001: Z.L. Tang, et al., 2004). Регене зо рация периферических нервов включает формирование аксональных отростков, их рост и реиннервации исходного объекта. Этот процесс контролируется Шванновскими клетками или базальными мембранами Шванновских клеток (С. Ide, 1996; L.N. Berti-Mattera et al., 2001; Z. Chen et al., 2004; CX.A.-M. Vleggeert-Lankamp et al., 2004). Их участие в регенерации нервных волокон реализуется по нескольким направлениям: - синтез нейротрофических факторов (фактора роста нервов (Р. Villoslada et al., 2004), мозгового нейротрофического фактора (A.A.Petersen, 2001), цилиарного нейротрофического фактора, фактора ингибирующего ми грацию лейкоцитов); - реэкспрессия рецепторов к определённым нейротрофинам; - синтез адгезивных молекул; - синтез компонентов базальной мембраны (Ю.А. Челышев и др., 2001) Миелинизированные и немиелинизированные аксоны в перифериче ской нервной системе окружены Шванновскими клетками, которые, в свою очередь, охвачены базальными мембранами на границе с эндотелиальной со единительной тканью. Каждая Шваиновская клетка формирует вокруг во локна свою собственную ннтернодальную миелиновую оболочку, которая отделена от соседней перехватом Ранвье. Базальная мембрана непрерывна между смежными Шванновскими клетками. Немиелинизированные волокна имеют непрерывную оболочку без промежутков в перехватах Ранвье. Поэто му каждое волокно в ПНС и миелинизированное и немиелинизированное ок ружено непрерывной базалы-юй мембраной.
После повреждения аксон теряет контакт с телом клетки, его дисталь-ный сегмент постепенно дегенерирует и, в конечном счете, исчезает (уолде-ровская дегенерация). Наряду с аксональной дегенерацией Шванновские клетки в дисталы-юм конце нерва также подвергаются обширным изменени 31 ям. Миелиновая оболочка деградирует в различные формы миелиновых образований (Шваыновские клеточные колонны или полоса Bungner), и впоследствии фагоцитируются макрофагами (М. Wender, et al., 1979; А. Топа et al., 1993; С. Ide, 1996). Инвазия самих макрофагов может быть вызвана диффузными факторами, выпущенными из нерва при повреждении (J.M. Рососк et al., 2001). Так, рядом исследователей установлено, что спустя три дня после повреждения, аксоны дегенерировали, и миелиновая оболочка разрушалась, в Шванновских клетках, фибробластах и макрофагах содержались ли-пиды разрушенного миелина. Через одну неделю после повреждения трубки базальной мембраны содержали остатки разрушенного миелина, а некоторые трубки уже содержали регенерирующие аксоны (С. Ide, 1996).
С развитием процессов демиелинизации происходит снижение скорости проведения ПД, удлинение периода рефрактерное, а затем и полное блокирование проводимости. Однако для многих типов волокон показано восстановление проводимости при ремиелинизации. Причем до полного завершения этого процесса нервные волокна неспособны проводить высокочастотные импульсы, и скорость проведения в них низка (K.J. Smith et al., 1980).
В ряде работ показано, что спустя две недели после повреждения периферического нерва остатки разрушенного миелина содержались в недавно сформированных миелиновых оболочек вокруг регенерирующих аксонов. К третей неделе миелииизация регенерирующих аксонов заметно увеличивалась. С четвертой по десятую недели после повреждения новые миелиновые оболочки продолжали утолщаться, и были хорошо видны (J.F. Goodrum et al., 1994). Отмечено, что при миелинизации периферических нервов отдельные фосфолипиды поставляются разными транспортными системами (F. Boiron et al., 1993), при этом используется часть липидов ранее разрушенной миелино вой оболочки (J.F. Goodrum, et al., 1990; J.F. Goodrum, et al., 1995).
Эти данные подтверждают наличие катаболизма липидов в Шваннов-ских клетках и эндотелиальных фибробластах до прониішовения из нерва макрофагов. Однако, большинство миелиновых остатков фагоцитируется макрофагами в течение 1-2 недель после повреждения нерва. Эти связанные с остатками миелина макрофаги остаются в пределах нерва в течение многих недель, указывая на то, что большая часть остатков не используется повторно при регенерации миелина.
Регенерирующие аксоны растут из проксимального участка нерва в дистальный вдоль поверхности Шванновских клеток и/или внутренней поверхности базальной мембраны. Если регенерирующий аксон так или иначе выходит за ее пределы и попадает в соединительную ткань, то его рост прекращается. Таким образом, Шванновские клетки, как и макрофаги обеспечивают регенерирующие аксоны факторами роста, стимулируя в дальнейшем регенерацию поврежденных аксонов (V.H. Perry et al., 1992).
Базальная мембрана - специализированная внеклеточная матрица, которая действует как основа для эпителиальных и нервных клеток, которые иначе не могли бы сформировать функциональный контакт с соединительной тканью. Соответственно, о базальной мембране можно говорить как о "клее": с одной стороны она контактирует с клетками, и с другой стороны контактирует с окружающей соединительной тканью. Регенерирующие аксоны растут по внутренней поверхности базальной мембраны Шванновских клеток, которая содержит разнообразные адгезивные молекулы, включая ламинин. Известно, что экстраклеточный комплекс коллагена, ламинина и фибронектина стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы после поперечного рассечения между дистальним и проксимальным участками (С. Yueh-Sheng et
al., 2000). С другой стороны, Шванновские клетки экспрессируют на свою плазматическую мембрану адгезивнвіе молекулы, принадлежащие суперсемейству иммуноглобулинов и супер семейству кадхерина, которвіе участвуют в адгезии аксонов и Шванновских клеток. На регенерацию периферических нервов оказывают влияние многочисленные параметры: активность антиокислительных ферментов, апоптоз нейронов, соотношение пролиферации и апоптоза шванновских клеток, активность макрофагов, элиминирующих миелиновые оболочки и аксоны дегенерирующих нейронов.
Экстракция липидов из нервной ткани
Экстракцию липидов из нервной ткани проводили по методу Блайя-Дайера (Е. Bligh. et al., 1959). Навеску ткани (500 мг) фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в 3 мл смеси хлороформ-метанол-во да (1:2:0,8, по объему). Полученный гомогенат сливали в колбу с притертой пробкой, доводили общий объем до 10 мл. Через час содержимое сливали через складчатый фильтр. Колбу ополаскивали 5 мл вышеуказанной смеси и сливали туда же. Для отделения нелипидиых водорастворимых примесей в полученную смесь добавляли 4мл хлороформа и 4мл воды, встряхивали и оставляли на 10 - 12 часов или центрифугировали в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту. В этих условиях происходит деление раствора на две фазы: верхняя -водно-метанольная, содержащая водорастворимые компоненты, на границе фаз - белая пленка - протеолипиды, и нижняя фаза - хлороформная, содержащая липиды. Нижнюю фракцию осторожно отделяли и сливали в предварительно взвешенную выпаривательную колбу.
Экстракцию липидов вышеуказанным методом проводили при пониженной температуре (4 С). Конечный экстракт в выпаривательной колбе упаривали на роторном испарителе "ROTADEST" (Венгрия) до постоянного веса. Полученные липиды растворяли в смеси хлороформ-метанол (2:1, по объему) до концентрации 20 мг/мл. Липиды хранили при низкой температуре (0 С) в атмосфере азота.
3.3. Хроматографические методы анализа 3.3.1. Микротонкослойная хроматография липидов Подготовка силикагеля и приготовление пластинок. Хроматографиче-ское разделение проводили в тонком слое силикагеля, нанесенного на стеклянную пластинку, Использовали как стандартные пластинки (Merk), так и приготовленные в лабораторных условиях. Применяли силикагель марки КСК (г. Воскресение). Для получения частиц необходимого размера силикагель размалывали на шаровой мельнице 48-72 часа, затем переносили его в трех литровую емкость с дистиллированной водой, перемешивали, давали отстояться 5 минут. Затем верхнюю фазу сливали в 5 литровую емкость, а оставшиеся крупные частицы снова промывали водой, перемешивали и отстаивали 5 минут. Снова сливали верхнюю фазу в 5 литровую емкость. Объединенные верхние фазы перемешивали и давали отстояться 1 час. После отстаивания верхнюю фазу, содержащую мелкие частицы силикагеля, сливали, а осадок промывали соляной кислотой для удаления следов железа (Г.В. Новицкая, 1972). Для этого в кристаллизатор насыпали 150 г силикагеля, добавляли 0,5 л концентрированной соляной кислоты и 0,5 л дистиллированной воды и тщательно перемешивали. Через 2-3 часа силикагель осаждался, а яа-досадочная жидкость удалялась. Далее промывали силикагель дистиллиро ванной водой до нейтральной реакции надосадочиои жидкости. Промытый сяликагель сушили в термостате при 120 С. Затем его просеивали через двойной слой капрона. В качестве связующего компонента использовали гипс.
Для приготовления ТСХ пластин стеклянную подложку промывали хромовой смесью, водой, а затем дистиллированной водой. Готовили навеску силикагеля 10 г, растворяли ее в 33 мл дистиллированной воды, добавляли 1 г гипса. Суспензию перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут и наносили на установленную по уровню пластинку до застывания. Использовали стекла размером бхб и 10x10 см. Также использовали готовые пластинки фирмы Merck (Германия).
Для разделения липидов использовали хроматографические камеры. Стенки их изнутри выстилали фильтровальной бумагой, что ускоряет насыщение парами растворителей. Системы растворителей в камерах готовили за 1-1,5 часа до анализа.
Разделение общих липидов. Образцы наносили микрошприцем фирмы «Hamilton» (США) в виде пятна на расстоянии 0,5 — 0,7 см от краев пластины. Для разделения фосфолипидов использовали двумерную хроматографию в системах Брокхьюза: хлороформ/метанол/аммиак/вода (90:54:5:8) — первое направление, хлороформ/метанол/ледяная уксусная кислота/вода (90:40:10:4) - второе направление (R.M. Broeckhuyse, 1968). В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Пластинки перед нанесением прогревали в течение 30 минут при температуре 110-120 С.
После полного испарения растворителя из нанесенных образцов, пластины помещали в хроматографические камеры. Разделение заканчивали, когда фронт растворителей не доходил до верхнего края пластины на 0,3-0,5 см. Пластину вынимали из камеры, высушивали до исчезновения запаха растворителей и помещали во вторую систему. Разделение неполярных липидов. Для разделения диаци л глицеринов и СЖК использовали систему гексан/диэтиловый эфир/ледяная уксусная кислота (80:20:1 по объему). Экстракт общих липидов наносили в виде полоски на пластинку и прогоняли трехкратно в одном направлении (J.K. Yao et al., 1985). Идентификация липидов. Для идентификации липидов на пластинках использовали чистые вещества - «свидетели», значения Rr из литературы и специфические красители. Для обнаружения липидов использовали метод, основанный на окрашивании их парами йода, удобный благодаря своей универсальности и отсутствию разрушающего действия на липиды. Пластины после извлечения из хроматографической камеры высушивали и помещали в эксикатор, содержащий кристаллы йода. Липиды обнаруживаются в виде коричнево-желтых пятен или полос. Пятна осторожно очерчивали мягким карандашом и ждали, чтобы йод улетучился (Ю. Кирхнер, 1981).
Обнаружение фосфолипидов проводили методом В.Е. Васьковского (V.E. Vaskovsky et al., 1975). Сначала получали исходный реагент А. К 10 г натрия молибденовокислого в 60 мл 4н НС1 добавляли 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4н HCL Смесь нагревали на водяной бане в течение 20 минут, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Для опрыскивания пластин готовили реагент С: к 1 объему исходного реагента А добавляли 3 объема дистиллированной воды или 7 объемов 7н серной кислоты. Пятна фосфолипидов в последнем случае окрашивались в голубой цвет.
Изменение состава липидов травмированного нерва в зависимости от времени прошедшего после механического воздействия
Известно, что большинство живых тканей после действия повреждающего фактора активно регенерирует. Поэтому нам представлял интерес изучить динамику содержания липидиых фракций в процессе восстановления нервной проводимости. При изучении механизмов повреждения периферического нерва особое внимание следует отводить способности нервного волокна проводить электрические импульсы, т.е. его функциональному состоянию. Выделяют следующие реакций периферического нерва на повреждение: вал-леровская дегенерация (реакция на пересечение, передавливание нерва), атрофия и дегенерация аксона (аксонопатия), сегментарная демиелинизация (миелинопатия), первичные поражения тел нервных клеток (нейронопатия) (А.К. Эсбери и др., 1987).
Развитие валлеровской дегенерации происходит в результате предшествующего механического повреждения (пересечения или сдавливания) одного здорового аксона или группы аксонов, например, входящих в состав ствола нерва, или его ишемией. В зоне иннервации ствола нерва сразу же развивается паралич и потеря чувствительности. Дисталы-ю от места повреждения с помощью макрофагов происходит дегенерация аксонов и миелино-вых оболочек (А.К. Эсбери и др., 1987; V.I-L Perry et al., 1992). Проводимость снижается в течение нескольких дней или недель с того момента, как дис-тальный участок нерва утрачивает возбудимость. Регенерация проксимальной культи начинается рано, но протекает медленно. Качество восстановления зависит от степени деструкции леммоцитов, оболочки нерва и окружающей мягкой ткани, обеспечивающих поврежденный аксон факторами роста (J. Jungnickel et al., 2004; Т. Thippeswamy et al., 2004). Как уже ранее отмечалось, нарушение проводимости периферических нервных волокон происходит при травмировании нерва (S. Ide, 1996), после внутринервной инъекции ЛФХ (K.J. Smith et al., 1980; Е. Birgbauer et al, 2004) и т.д. В связи с этим, нами исследовалась способность травмированных седалищных нервов крысы проводить электрические импульсы на разных сроках после передавливания.
Как уже отмечалось, перетяжка нерва приводит к полной потере возбудимости нерва. Только через 20 суток после повреждения у нервов было обнаружено восстановление способности проведения ПД с небольшой амплитудой, в то время как контрольные нервы давали четкий импульс при раздражении (Приложение Б, рис. 3).
При этом мы изучали динамику содержания исследуемых липидов в зависимости от времени прошедшего после механического воздействия. Травму вызывали перетяжкой седалищного ыерва на 24 часа, далее у животных выделяли нервы непосредственно после перетяжки, по истечение пяти, десяти и пятнадцати суток соответственно.
Известно, что лизофосфолипиды, ЛФХ в частности, являются вторичными мессенджерами, и в малых концентрациях вызывают запуск многочисленных клеточных процессов (Y. Asaoka et al., 1991; S.M. Colles et al., 2000; M.R. Steiner et al., 2000); накопление же ЛФЛ в больших количествах приводит к дестабилизации плазматических мембран из-за того, что они обладают мощными детергентными свойствами (N.A. Gregson et al., 1973). Так же известно, что при патологических ситуациях содержание лизофосфолипидов в тканях повышается (S.M. Colles et al., 2000; Z. Shen et al., 2001). Изменения лизофосфолипидного состава этой серии опытов представлены в Приложении Б.
Нами установлено, что содержание ЛФХ в поврежденном нерве непосредственно после снятия лигатуры имеет близкое с контролем значение, и соответствуют 0,023-0,025 мкг РЛФХ/МКГ РФХ, но уже через пять суток количество ЛФХ по сравнению с контролем увеличивается в 4,4 раза. Дальнейшее увеличение послеоперационной выдержки до десяти суток приводит к снижению содержания ЛФХ, однако его количество превышает уровень контроля в 3,7 раза. Через пятнадцать суток после повреждения количество ЛФХ в опытном нерве продолжает снижается, но все еще превышает контрольное значение в 3,3 раза. В тех же условиях в контрольных нервах содержание ЛФХ в течение всего времени эксперимента достоверно не изменяется (рис. 4.7).
Динамика изменения содержания ЛФЭА в поврежденных нервах имеет схожий характер (рис. 4.7). В нативном нерве ЛФЭА присутствует в следовых количествах. После механической травмы его количество возрастает в 1,3 раза относительно контроля. К пятым суткам, как и в случае с ЛФХ, содержание ЛФЭА достигает максимума, к десятым суткам его количество снижается, однако все еще превышает контрольное значение в 2,5 раза. Через пятнадцать суток после повреждения содержание ЛФЭА в нерве уменьшается до первоначального значения, а контроле липид обнаруживается только в следовых количествах.
Наряду с исследованием изменения содержания ФЛ и ЛФЛ, мы изучали изменения состава жирных кислот входящих в эти ФЛ, ДАГ и во фракции СЖК нерва после травмы. Динамика содержания жирных кислот состава ли-пидов нерва после повреждения представлена в Приложении В.
Во фракции СЖК во всех вариантах опыта при разной длительности послеоперационной выдержки качественных различий не обнаружено, однако наблюдаются количественные изменения. Так происходили существенные колебания соотношения насыщенных/ненасыщенных кислот. Непосредственно после повреждения в течение пяти суток происходит снижение коэффициента насыщенности относительно контроля на 23 и 46% соответственно. К десятым суткам и далее происходит увеличение доли насыщенных жирных кислот, о чем говорит повышение коэффициента насыщенности: к пятнадцатым суткам коэффициент насыщенности СЖК травмированного нерва на 65%) выше, чем в контроле (рис. 4.8).
