Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Молекулярные механизмы и биологическая роль апоптоза 7
1.1. Общие понятия и характеристика апоптоза 7
1.2 Молекулярные механизмы лежащие в основе апоптоза 16
1.3 Участие липидов и липидной фазы мембран в апоптозе 19
Глава 2. Объект и методы исследовании 40
2.1. Объект исследования и постановка опыта 40
2.2. Микроскопия эритроцитов голубя 41
2.3. Выделение фосфолипазы А2 из эритроцитов 42
2.4. Определение активности фосфолипазы А2 42
2.5. Количественное определение белка в ферментном препаратс...43
2.6. Определение содержания ТБК-активиых веществ (малонового диальдегида) в эритроцитах 43
2.7. Орсделепие содержания диеновых конъюгатов 44
2.8. Получение сфингомиелина 44
2.9. Получение диацилглицерола 45
2.10. Получение суспензий сфингомиелина, фосфатидилсернпа и диацилглицерола 45
2.11. Хроматографические методы анализа 46
2.11.1. Тонкослойная хроматография липидов 46
2.11.1.1. Подготовка силикагеля и приготовление пластинок 46
2.11.1.2. Разделение липидов 47
2.11.1.3. Разделение общих липидов 48
2.11.1.4. Обнаружение липидов при помощи йода 49
2.11.1.5. Обнаружение фосфолипидов 50
2.11.1.6, Определение микроколичеств фосфора липидов 51
2.12. Газожидкостнаявая хроматография. Анализ жирных кислот...52
2.12.1. Метилирование жирных кислот 52
2.12.2. Техника хроматографического анализа жирных кислот 53
2.12.3. Обработка результатов хроматографических исследований..,.53
2.13, Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Выброс клеточного ядра из эритроцитов голубя и состояние мембранных липндов при воздействии иероксидом водорода и УФ-облучением 56
3.1. Перокснд водорода как индуктор апоптоза эритроцитов голубя. Влияние температуры 56
3.2. Индукция апоптоза эритроцитов голубя УФ-излученим. Влияние температуры 71
3.3. Влияние добавленного сфингомиелина как индуктора апоптоза эритроцитов голубя 78
3.4. Влияние добавленного фосфатидилсерина и диацилглицерола как индукторов апоптоза эритроцитов голубя 87
3.5 Стеариновая и олеиновая кислоты как индукторы апоптоза эритроцитов голубя 93
Заключение 97
Выводы 101
Список литературы 103
Список принятых сокращений 126
- Молекулярные механизмы лежащие в основе апоптоза
- Микроскопия эритроцитов голубя
- Метилирование жирных кислот
- Индукция апоптоза эритроцитов голубя УФ-излученим. Влияние температуры
Введение к работе
Актуальность темы. Программируемая клеточная гибель —-естественный физиологический многоэтапный процесс, в результате которого элиминируются "отработавшие" или поврежденные клетки и обеспечивается баланс между пролиферацией и гибелью клеток, тканевой гомеостаз в многоклеточном организме. Обновление форменных элементов крови, в том числе эритроцитов, происходит интенсивно. Существуют разные способы реализации апоптоза. Считают, что чаще всего ядра выталкиваются из клеток, они затем фагоцитируются макрофагами (Н.С. Кисляк и др., 1978; Б. Албертс и др., 1994). В ходе энуклеации клетка совершает активные движения, выбрасывает многочисленные отростки. Один из таких отростков содержит ядро. Процесс напоминает отделение двух дочерних клеток после митоза. Реже ядро нормобласта исчезает через кариорексис - образование ядерных фрагментов, телец Жолли, и их последующего распада внутри клетки (И.А. Кассирский, 1955). Еще один способ освобождения от ядра - его растворение, кариолизис (Н.Д. Стражеско, 1963). В отличие от эритроцитов млекопитающих, зрелые эритроциты рыб, амфибий, рептилий и птиц содержат клеточное ядро. Особый интерес представляют эритроциты птиц, поскольку они, как и млекопитающие, относятся к теплокровным. Несмотря на универсальность апоптоза, механизмы его включения могут различаться у организмов, находящихся на разных уровнях эволюции. Выяснение механизма выброса ядра из клетки имеет важное значение не только для физико-химической биологии, но и для медицины, например, в связи с удалением опухолевых клеток. Независимо от природы и источников сигналов, запускающих апоптоз, воздействие на клетку и ответственные рецепторы не может происходить без взаимодействия с мембраной клетки и его компонентами, в
том числе и с липидами. Между тем, в литературе мало данных о роли и вовлечении липидов в апоптоз.
Цель и задачи диссертационной работы. Изучить участие липидов в апоптозе эритроцитов голубя. Для этого необходимо было решить следующие задачи: обнаружить морфологические изменения эритроцитов характерные для апоптоза; изучить роль индукторов липиднои природы в морфологических изменениях эритроцитов голубя; исследовать липидньгй состав эритроцитов при различных условиях инкубирования в присутствии индукторов апоптоза; установить взаимосвязь между образованием апоптозных везикул, с изменением фосфолипидов и жир но кислотно го состава мембранных липидов.
Научная новизна. Впервые исследован выброс ядра эритроцитами голубя с последующим распадом клеток на апоптозные везикулы. Изучен жирнокислотный состав отдельных фракций липидов при воздействии пероксида водорода и УФ-облучения. Показана индукция апоптоза сфингомиелином (СМ), фосфатидилсерином (ФС), диацилглицеролом(ДАГ) и олеиновой кислотой(ОЛ). Обнаружено, что при воздействии пероксидом водорода происходят изменения в составе мембраных липидов, количественного и качественного соотношения липидов и продуктов ПОЛ и это может являться одним из механизмов, через который происходит инициирование апоптоза. Добавленные СМ, ФС, ДАТ и ОК проникают в эритроциты и вызывают глубокие изменения в структурно-функциональном состоянии мембран и могут непосредственно влиять на рецепторы и сигнальные системы в качестве биоэффекторов. Установлена взаимосвязь между апоптозом эритроцитов и изменением состава и состояния липиднои компоненты мембраны.
Практическая значимость. Результаты исследований позволяют расширить представления об участии липидов и их производных в
механизмах апоптоза. Получены новые данные об удалении ядра из эритроцита и изменении структур но-функциональном состоянии мембран при индукции апоптоза.
Апробации работы. Основные результаты диссертации были
доложены на Огаревских чтениях в Мордовском госуниверситете им. Н.П.
Огарева (Саранск, 2000-2004); на выездном заседании Московского общества
испытателей природы (Саранск, 2001); на международной научной
конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001);
«, на научной конференции молодых ученых Мордовского госуниверситета им.
Н.П. Огарева (Саранск, 2001-2004); на Пущинской конференции молодых ученых (Пущино,2001-2004); на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Пероксид водорода и УФ-облучсние (205 -315 нм) индуцируют
морфологические изменения эритроцитов голубя, сопровождающийся
VIу выбросом из клетки ядра и образованием везикул.
Пероксид водорода и УФ-облучение (205-315 нм) интенсифицируют процессы перекисного окисления липидов, что сопровождается накоплением первичных и конечных продуктов окисления липидов.
При воздействии пероксида водорода изменяется доля индивидуальных фракций мембранных фосфолипидов: фосфатидилхолина, сфингомиелина, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина в эритроцитах голубя.
4. При инкубации эритроцитов в присутствии пероксида водорода
** изменяется состав жирных кислот индивидуальных фосфолипидов и
свободных жирных кислот.
Изменение количественного и качественного соотношения мембранных липидов при апоптозе свидетельствует о подготовки эритроцитов к выбросу ядра и образования везикул.
Добавление экзогенных липидов и их производных в качестве индукторов апоптоза, приводит к проникновению их в эритроциты, вызывает выброс ядра и образование везикул.
Изменения количественного и качественного соотношения липидов могут являться одним из механизмов апоптоза эритроцитов голубя.
Молекулярные механизмы лежащие в основе апоптоза
Эритроциты млекопитающих образуются из плюрипотентных стволовых клеток в желточном мешке эмбриона, в печени и селезенке, в красном костном мозге плоских костей в постнатальный период развития организма. Эритропоэз в красном костном мозге, регулируемый гликопротсиновым гормоном эритропоэтином, включает ряд промежуточных стадий (И.А. Кассирский, 1955).
Эритробласты, лишенные эритропоэтина, погибают в результате апоптоза (P.A, Gregoli et al,, 1999). Эритропоэтин регулирует экспрессию антиапо птоз ного белка Bcl-XL (М. Solovsky et al, 1999; N. Moloyama et al, 1999), действуя в сочетании с фактором транскрипции GATA-I (Т. Gregory et al, 1999). В отсутствие GATA-1 клеточная дифференцировка останавливается на стадии базофильных эритробластов, которые затем погибают через апоптоз (Т. Gregory et al, 2001). Такая же картина наблюдается при включении Fas-рецептора эритробластов с помощью Fas-специфических антител, в результате которого происходит активация каспазы-3 и последующее расщепление GATA-1(R. De Maria et al, 1999).
Цистеиновые протеазы, каспазы, возникающие путем активации их предшественников (прокаспаз), играют центральную роль в апоптозе (В.П. Скулачев и др., 2000; Самуилов В.Д. и др., 2000). Однако в эритропоэзе каспасы призваны играть иную роль, они служат не для исполнения программы гибели клеток - предшественниц эритроцитов, а для реализации программы цитодифференцировки. Пептидный ингибитор каспаз Z-VAD.fmk блокирует эритропоэз in vitro (Y. Zermati et al., 2001). Каспаза-3, активированная через механизм, зависимый от митохондриальных апоптогенных факторов, в процессе дифференцировки эритробластов расщепляет ядерный белок ламин В, поддерживающий целостность клеточного ядра, и белок acinus (от «apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus» - индуктор апоптозиого уплотнения хроматина в ядре), не вызывая при этом апоптоза (Y. Zermati et al., 2001).
Стадии эритробластов характеризуются постепенным нарастанием содержания гемоглобина в клетках и пикнотизацией (сморщиванием) ядра. Ортохромный эритробласт, максимально насыщенный гемоглобином, теряет клеточное ядро и становится ретикулоцитом. Каспаза-3, активность которой обнаруживается в эритробластах (Y. Zermati et al., 2001), вероятно, участвует в подготовке клетки к освобождению от ядра.
Существуют разные способы реализации этого процесса. Считают, что чаще всего ядра выталкиваются из клетки, оно затем фагоцитируются макрофагами (И.А. Кассирский и др., 1955; Н.Д. Страженко и др., 1963; Б. Альберте и др., 1994). В ходе энуклеации клетка совершает активные движения, выбрасывает многочисленные отростки. Один из таких отростков содержит ядро. Процесс напоминает отделение двух дочерних клеток после митоза и в экспирементальных условиях занимает 10 мий (Н.С. Кисляк и др., 1978). Реже ядро нормобласта исчезает через кариорексис - в результате деструкции с образованием ядерных фрагментов, телец Жолли, и их последующего распада внутри клетки (И.А. Кассирский, 1955). Еще один способ освобождения от ядра - его растворение, кариолизиз (Н.Д. Страженко, 1963).
Ретикулоциты выходят из костного мозга в кровоток. Здесь происходит дальнейшее опустошение ретикулоцитов. В течение первых 1-2 суток ретикулоцит теряет митохондрии и рибосомы и превращается в эритроцит. Подобно клеткам флоэмы у растений и эпителиальным клеткам глазного хрусталика, эритроциты метаболически активны, но не способны к пролиферации. Созревшие эритроциты циркулируют в крови около 4 месяцев и, поизносившись, включают включают программу апоптоза (Е. Daugas et al., 2001) и исчезают в недрах ретикуло-эндотелиальной системы.
В отличие от эритроцитов млекопитающих, зрелые эритроциты рыб, анфибий, рептилий и птиц содержат клеточное ядро. Особый интерес представляют эритроциты птиц, поскольку они, как и млекопитающие, относятся к теплокровным. Ингибитор протеинкиназ стауроспорин в комбинации с ингибитором синтеза белка циклогексимидом, а также отсутствие сыворотки крови в среде инкубации, индуцирующие апоптоз у большинства испытанных типов клеток млекопитающих, не вызывают гибели безъядерных эритроцитов человека. Напротив, зрелые эритроциты цыпленка, хотя их ядра транскрипционно неактивны, в этих условиях погибают с выраженными признаками апопотоза по пути, который реализуется без участия каспаз (М. Weil et al., 1998).
В эритроцитах человека обнаружены неактивные предшественники и каспазы-3, и каспазы-8, однако не эти ферменты приводят в действие программу гибели эритроцитов. Они так и остаются в неактивной форме. Процесс реализуется с участием цистеиновой протеази другого типа - р-кальпаина, гетеродимерной Са +-зависимой протеазы, претерпевающей аутопротеолитическую активацию в ответ на повышение концентрации Са в цитоплазме с помощью добавленного Са -ионофора и вызывающей разрушения белка цитоскелета фодрина (эритроцитарного спектрина), появление фосфатидилсерина в наружном монослое плазматической мембраны (экстернализация фосфатидилсерина) и гибель эритроцитов (D. Bratosin et al., 2001). Тем не менее, обработка эритроцитов человека окислителем бутил перо кс ид ом приводит к активации прокаспазы-3, экстернализации фосфатидилсерина и фагоцитозу эритроцитов (K.S. Lang et al, 2003).
Микроскопия эритроцитов голубя
Для исследования использовали кровь взятую в соотношении 9 : 1 с 3,8 % раствором цитрата натрия. Для получения эритроцитарной массы эритроциты трижды промывали физиологическим раствором с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 2000 об/мин. Гемолиз эритроцитов проводили добавлением к ним равного количества дистиллированной воды. К 0,4 мл гемолизата добавляли 0,2 мл 2М раствора хлорида натрия и перемешивали в течение 10 мин при 37С для полной экстракции фосфолипазы. Ферментный раствор готовили смешиванием равных объемов полученного экстракта и трисНСІ-буфера (трисНО-буфер 0,05М, содержащий 0,02М хлорида кальция, рН7,5)(Безрукопа Г.А., 1989).
Активность ФЛА2 определяли по накоплению лизофосфатидилхолина в реакции с фосфатидилхолином методом ТСХ. В качестве субстрата использовали фосфатидилхолин, очищенный хроматографическим методом. Идентификацию ФХ проводили после выдерживания пластины в парах йода сопоставлением значений Rf с данными литературы. После чего пятна фосфолипида соскабливали в пробирку с притёртой пробкой, заливали смесью хлороформ : метанол (2 : 1) и оставляли на экстракцию на магнитной мешалке в течение 12 часов. Далее осуществляли центрифугирование при 5000 оборотах в минуту в течение 30 минут. Растворители удаляли выпариванием на роторном испарителе "ROTADEST" (Венгрия) под вакуумом. Необходимое количество фосфатидилхолина растворяли в реакционной среде, содержащей ЮмМ трис, 0,05М NaCl, ЮмМ СаСЬ, 0,5мМ ЭДТА, 0,5% тритона Х-100, рН 8,0. В опытную пробу последовательно вносили 50 мкл ферментного препарата, 1 мл субстратной смеси с концентрацией фосфатидилхолина 2 мг/мл. В контрольную пробу 1 (на фермент) вносили 50 мкл ферментного препарата и 1 мл инкубационной смеси без фосфатидилхолина, в контрольную пробу 2 (на липид — ФХ) вносили 50 мкл трисНО-буфер и 1 мл субстрационной смеси с концентрацией фосфатидилхолина 2 мг/мл. Гидролиз проводили в течение 1 часа при температуре 37 С . Реакцию останавливали смесью хлороформ : метанол (2:1).
Верхнюю фазу удаляли, а нижнюю фазу выпаривали на роторном испарителе. Липиды доводили до нужной концентрации, наносили на пластинку для ТСХ, разделяли двумерно в системах Брокхьюза — (хлороформ: метанол : аммиак : вода) в соотношении 90:54:5:8 и (хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота : вода) в соотношении 90:40:10:4. Удельную активность выражали в мкг неорганического фосфора лизофосфатидилхолина, образовавшегося в результате действия 1 мг белка в течение 1 часа.
Определение белка проводили по методу Лоури (О.Н. Lowry et al., 1951). Исследуемый раствор в количестве 50мкл смешивали с 2 мл реактива 3, оставляли при комнатной температуре на 10 минут. Затем добавляли 0,2 мл реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивали и оставляли на 1 час. После чего колориметрировали при 750 нм против контроля на спектрофотометре СФ-46.
Метод основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии МДА с тиобарбитуровой кислотой. Для исследования отбирали 0,1 мл эритроцитов, трижды отмытых изотоническим раствором и гемолизировали внесением в пробирку 2,0 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляли 1,0 мл раствора ТХУ(170 г/л) и 1,0 мл раствора ТБК. Пробу прогревали в кипящей водяной бане в течение 10 минут, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.
Интенсивность окраски измеряли при длине волны 532 им на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см (Д.Ю. Егоров и др., 1988). Концентрацию ТБК-активных продуктов рассчитывают с учетом коэффициента молярного поглощения комплекса МДА-ТБК, равного 1,56 к 105 /моль х см"1 (F.E. Hunter et al.,1963).
Метод основывается на установлении содержания первичных продуктов ПОЛ в крови по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в ультрафиолетовой области спектра (233 нм). К 0,4 мл эритроцитов, отмытых трижды охлажденным изотоническим раствором, добавляли 1 мл хлороформа, 2 мл метанола и 0,4 мл дистиллированной воды. Все это тщательно перемешивали и помещали в холодильник на 1 час. Затем добавляли 2 мл хлороформа и пробу центрифугировали в течение 10 мни при 3000 об/ мин. После чего отбирали нижнюю фракцию пробы в выпаривательную колбу и выпаривали на роторном испарителе "Rotadest"(BeHrp ). По окончании выпаривания добавляли 3 мл раствора метанол - гексана(14 : 2 по объему) и проводили измерение на спектрофотометре. Расчет концентрации коныогированных диенов вели с использованием коэффициента молярного поглощения при 233 нм 2,2х105/моль х см (Recknagel et al., 1966). 2.8. Получение сфингомиеліша
Для упрощения выделения сфингомиелина из общих липидов головного мозга КРС применяли метод осаждения ацетоном (М. Кейтс и др., 1975). Это самый простой и часто самый эффективный метод отделения фосфолипидов от нейтральных липидов и пигментов. Большинство фосфолипидов не растворяется в холодном ацетоне, в то время как глицериды и другие нейтральные липиды хорошо растворяются в ацетоне даже на холоде.
Аликвотную часть раствора липидов (100 мг) помещали в центрифужную пробирку с притертой стеклянной пробкой емкостью 15 мл. Раствор упаривали в токе азота при 30С до объема 0,2-0,3 мл, добавляли 5 мл ацетона и 0,1 мл 10 % раствора MgCl2 6H20 в метаноле, перемешивали и охлаждали в бане со льдом в течение 1 ч. Суспензию центрифугировали, как описано выше. Высушенный остаток взвешивали, растворяли в определенном объеме раствора хлор о ф ом-метанол (2:1, по объему). Выделение сфингомиелина осуществляли с помощью двумерной тонкослойной хроматографии в системах Брокхыоза (В.М. Broeckhuyse,196S).
Для получения диацилглицерола использовали ферментативную реакцию фосфолипазы С с фосфатидилхолином. Для этого 100 мг яичного лецитина растворяли в б мл диэтилового эфира, добавляли в раствор 1,2 мг фосфолипазы С в 3 мл 0.001 М раствора СаСЬ и 1 мл 0,1 М трис-буфера (рН 7,3). Смесь встряхивали в течение 1 ч при 27, охлаждали до комнатной температуры и переносили в делительную воронку объемом 20 мл. После разделения фаз водный слой экстрагировали диэтиловым эфиром (5x10 мл), объединенный органический экстракт высушивали безводным Na2SC 4 и затем упаривали в вакууме на роторном испарителе. Остаток представляет собой хроматофафически чистую смесь 1,2-диглицеридов; выход - 75-77 мг (95-98%). Чистоту диацилглицсрола проверяли при помощи TCX(JLK. Yao et al., 1985).
Подготовка силикагеля и приготовление пластинок для препаративного разделения липидов методом ТСХ применяли силикагель марки КСК Воскресенского химкомбината и Kieselgel 60 gipshalting фирмы «Merk» (Германия). При работе с КСК силикагель с необходимыми размерами частиц, пригодный для ТСХ получали следующим образом. Гранулы размалывали на шаровой мельнице 24 часа, затем переносили порошок в 3-х литровую емкость с дистиллированной водой, перемешивали и давали отстояться 5 мин. Затем верхнюю фазу сливали в 5 л емкость, а оставшиеся крупные частицы снова промывали водой, перемешивали и отстаивали 5 мин. Снова сливали верхнюю фазу в 5 л емкость. Объединенные верхние фазы перемешивали и давали отстояться 1 час. После отстаивания верхнюю фазу, содержащую мелкие частицы силикагеля сливали, а осадок подвергали промывке в соляной кислоте для удаления следов железа (Новицкая Г.В., 1972). С этой целью в кристаллизатор насыпали 150-200 г отмученного силикагеля, добавляли 0,5 л концентрированной соляной кислоты и 0,5 л дистиллированной воды и тщательно перемешивали. Через 2-3 часа силикагель осаждался, а надосадочная жидкость удалялась. Далее промывали силикагель дистиллированной водой до нейтральной реакции надосадочной жидкости. Промытый силикагель высушивали 48 часов при 120 С. Затем просеивали его через двойной слой капрона. Стеклянные пластинки размером 10x10 см перед нанесением на них силикагеля тщательно мыли хромовой смесью и 5 % горячим раствором NaOH. После чего их промывали несколько раз водопроводной и дистиллированной водой и сушили. Затем приготавливали водную суспензию силикагеля со связующим (в концентрации 300 мг/мл). В качестве связующего использовали гипс или белую магнезию, причем последняя улучшала разделение кислых липидов. Белую магнезию получали химическим путем методом, описанным Корякиным и Ангеловым (ЕО.В. Карякин и др., 1974), или использовали продажную отечественную («Реахим»). В случае использования Kieselgel 60 связующее не добавляли. Суспензию тщательно перемешивали на магнитной мешалке. Во время перемешивания отбирали по 7 мл суспензии и наносили на одну пластинку. Взвесь равномерно распределяли по поверхности пластинки и сушили на горизонтальном столике.
Метилирование жирных кислот
Метилирование проводили с помощью раствора трех фтор исто го бора в метаноле, что позволяет сократить время метилирования до 30-90 мин. В ампулу отмеряли небольшой объем (1 мл) раствора липидов в хлороформно - метанольной смеси (2 : 1 по объему), содержащей 5-Ю мг липидов. Растворитель упаривали в токе азота и к сухому остатку липидов приливали 1-1,5 мл раствора трехфтористого бора в метаноле. Ампулы запаивали и помещали в термостат с температурой 100С на 1-1,5 часа. Затем ампулы охлаждали, вскрывали и их содержимое переносили в пробирки с притертой пробкой. В каждую пробирку добавляли 1 объем воды, 2 объема петролейного эфира или гсксана и подкисляли для лучшей экстракции метиловых эфиров. Пробирки закрывали, энергично встряхивали 3 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Верхнюю фазу, содержащую метиловые эфиры, переносили в отдельную пробирку. Экстракцию проводили 2-3 раза, полученные экстракты объединяли и в пробы добавляли по 0,5 г безводного сульфата натрия для удаления следов воды. Через некоторое время пробы фильтровали, а затем растворитель удаляли с помощью вакуумного испарителя, или путем высушивания в токе охлажденного a30Ta(W.R.Morrison et al., 1964)
Смесь метиловых эфиров использовалась для ГЖХ анализа. Разделение веществ методом ГЖХ осуществляли на газовом хроматографе CHROM - 5. Колонку, помещенную в термостат, заполняли инертным носителем (измельченным твердым веществом), на который нанесен тонкий слой нелетучей жидкости (жидкая фаза). Смесь, подлежащую разделению, вводил в специальную камеру, находящуюся в начале колонки, где она быстро испаряется и уносится в колонку потоком газа-носителя из баллона, проходящего через редуктор. По мере продвижения по колонке, компоненты смеси распределяются между подвижной и неподвижной фазами, образуя отдельные зоны в газе-носителе. Эти зоны выносятся из колонки и проходят через детектирующее устройство, которое тем или иным способом сигнализирует о выходе компонента. Сигналы детектора обрабатываются программной комплексом Хромпроцессор 6.
Результаты исследований получали в виде хроматограмм с рядом пиков различной высоты и ширины, каждый из которых соответствовал индивидуальной жирной кислоте. Количественный анализ полученных хроматограмм проводили в соответствии с описанными в литературе методами (Литвинов и др., 1971; Коган и др., 1975; Вигдергауз и др., 1977; Пецев и др., 1987). Метод внутреннего стандарта Метод основан на сравнении площадей пиков известного вещества-метки и определяемого компонента. В качестве стандарта подбирают вещество, которое не реагирует с компонентами смеси, не очень сильно сорбируется и появляется на хроматограмме отдельно от других компонентов. Кроме того, его не должно быть в исследуемой смеси. В качестве такого вещества-метки мы использовали маргариновую кислоту (С 17:0).
Для проведения анализа и расчета методом внутреннего стандарта мы: а) составили ряд искусственных смесей исследуемого вещества с веществом-меткой, сняли ряд хроматограмм при режиме анализа смеси и измерили соотношение площадей соответствующих пиков. Площади пиков рассчитывались с помощью программного обеспечения «Хромпроцессор». Результаты обсчета площадей распечатывались на принтере; б) затем определяли приблизительное весовое количество анализируемой смеси, которое нужно ввести в колонку, чтобы получить достаточно хорошо выраженный пик определяемого компонента; подбирали приблизительно такое количество вещества-метки, при котором на хроматограыме появлялся пик метки, соизмеримый с пиком определяемого компонента; приготовили стандартную смесь метки и компонентов из больших количеств; вычислили относительное содержание вещества-метки в смеси; в) в хромато графическую колонку ввели пробу анализируемой смеси с известным в ней содержанием метки и снимали хроматограмму, измерили площадь пика определяемого компонента и пика вещества-метки; зная калибровочную константу К, рассчитали процентное содержание компонента. Поскольку необходимо было определить несколько компонентов, то для каждого из них определяли калибровочную константу указанным способом. Для обсчета хроматограмм использовали программу «Хромпроцессор»,а так же компьютерную программу, специально разработанную сотрудниками нашей лаборатории.
Индукция апоптоза эритроцитов голубя УФ-излученим. Влияние температуры
Известно, что УФ-излучение является одним из факторов, вызывающих программируемую гибель клеток (B.C. Новикова и др., 1996). Под воздействием УФ света происходит образование АФК, накопление которых может индуцировать апоптоз клеток, молекулярный механизм данного явления до настоящего времени не изучен. В связи с этим, представляло интересным изучить механизм активации апоптоза УФ-излучением эритроцитов голубя. В ходе эксперимента образцы облучали УФ-светом (ДРБ8-1, 205-315) нм в диапазоне 97,6 и 195,2 Дж/м и микроскопировали их, сравнивая с контролем (без воздействия УФ-излучением). Для подавления антиоксидантной системы клеток использовали KCN(10"4 М). После облучения образцы инкубировали при 25 С, так как ранее проведенные исследования показали, что при данной температуре морфологические изменения фиксировать наиболее удобно.
В контрольных образцах изменений в морфологии эритроцитов замечено не было даже после 24 часов инкубации. Наблюдали целые, а также гемолизированные эритроциты. В опытных пробах подвергнутых облучению 97,6 Дж/м по истечении 6 ч инкубации появлялись безъядерные эритроциты и субэритроцитарные везикулы, их доля составляла соответственно 0,82 и 3,18 тыс/мм крови. Через 12 ч инкубации количество апоптозных везикул увеличивалось, их доля составляла 3,7 тыс/мм3 крови. Удлинение времени инкубации до 24 ч вызывало увеличение числа везикул в 2 раза относительно контроля, их число составляло 6,36 тыс/мм крови. При этом безъядерных эритроцитов обнаружено не было.
При увеличении времени дозы облучения до 195,2 Дж/м морфологические процессы протекали более интенсивно. Так в образцах крови после 6 часовой инкубации появлялись безъядерные эритроциты и апоптозные везикулы, их доля составляла соответственно 1,702 и 3,441 тыс/мм3 крови. Через 12 ч инкубации количество субэритроцитарных везикул увеличивалось, их доля составляла 4,63 тыс/мм3 крови. Удлинение времени инкубации до 24 ч вызывало увеличение числа апоптозных везикул в 2 раза относительно контроля, их число составляло 6,73 тыс/мм3 крови. Влияние УФ- излучения на живые структуры многогранно. Из литературы известно, что действует в первую очередь, на структуры которые имеют в своем составе сопряженные системы (Ю.А. Владимеров и др., 1972). К таким системам можно отнести и липиды имеющие значительное число двойных связей. Кроме этого УФ- излучение влияет и на образование активных форм кислорода, что является дополнительным фактором воздействием на двойные связи жирных кислот.
Учитывая вышеизложенное, мы предположили, что одним из механизмов, интенсифицирующих апоптоз является перекисное окисление липидов эритроцитарных мембран. Из литературы известно, что при действии УФ-излучения и в том числе на эритроцитарные мембраны усиливаются процессы липоперекосиобразование (В. Bose et al., 1990).
В этой связи представляло интерес исследовать интенсивность процессов ПОЛ при действии УФ-излучения и установить взаимосвязь между накоплением продуктов ПОЛ и апоптическими явлениями в эритроцитах.
В серии экспериментов было исследовано накопление продуктов перекисного окисления липидов в зависимости от времени облучения и инкубации эритроцитов голубя при 25С. Было установлено, что содержание диеновых коныогатов в эритроцитах не подверженных воздействию УФ-облучения (контроль) составляло 0,475 нмоль/мг липида и практически не менялось при их инкубации в течении 24 часов. При облучении эритроцитов 97,6 Дж/м приводило к возрастанию количества диенов до 0,663 нмоль/мг липида. Инкубация эритроцитов предварительно подвергнутых облучению до 12 часов приводила к дальнейшему увеличению начальных продуктов ПОЛ (рис.3.8). Максимальное их накопление регистрировалось через 24 часа инкубации. Для определения ТБК-активных продуктов брали те же интервалы времени инкубации. В норме количество малонового диальдегида при температуре 25 составляло 0,896 нмоль/мг липида. Оказалось что при действии на кровь УФ-света 97,6 Дж/м содержание МДА по отношению к начальному уровню возрастает до 1,512 нмоль/мг липида. С удлинением времени инкубации до 12 часов концентрация конечного продукта перекисного окисления липидов возрастает 2,7 раза относительно контроля. 12 3 12 3 Наибольшее накопление МДА в эритроцитах голубя регистрировалось при удлинении времени инкубации до 24 часов: превышение над уровнем контроля составляло 3,7 раза
