Содержание к диссертации
Список использованных сокращений 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
ГЛАВА 1. СТРУКТУРНЫЕ И ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ 8
ХАРАКТЕРИСТИКИ МИОЗИНА И ЕГО НИТЕЙ
Состав молекулы миозина миокарда 8
Легкие цепи миозина миокарда 11
Функциональная роль легких цепей миозина миокарда 13
Изоформы легких и тяжелых цепей миозина миокарда 15
Состав миозина предсердий и желудочков в норме 16
Структура нитей миозина 16
Нативные нити сердечного миозина 16
Синтетические нити миозина 18
Роль легких цепей в проявлении структурных 19 характеристик нитей миозина
Ферментативные характеристики миозина и его нитей 21
Роль легких цепей в актин-активируемой АТФ-азной 23 активности миозина
ГЛАВА 2. ИЗМЕНЕНИЯ В МИОЗИНЕ МИОКАРДА ПРИ 27
АДАПТАЦИИ И ПАТОЛОГИИ
Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов 27 при адаптационных процессах
Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов 29 при дилатационной кардиомиопатии
Ремоделирование сократительного аппарата кардиомиоцитов 32 при гибернации
Внутрисердечная гемодинамика при клапанных патологиях 35
Патофизиология ишемических и реперфузионных 39 повреждений миокарда
Биохимические маркеры повреждения миокарда 47
Резюме по обзору литературы 53
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ 54
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 54
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 55
Экспериментальный материал 55
Клинический материал 56
Выделение и очистка белковых препаратов 57
Выделение и очистка миозина из сердечной мышцы 57
Выделение и очистка легких цепей миозина из 59 сердечной мышцы человека
3.3.3 Выделение и очистка актина скелетных мышц кролика 60
Определение АТФазной активности миозина суслика в 61 присутствии актина
Определение концентрации белковых препаратов 62
Электрофорез в полиакриламидном геле 62
Иммуноблоттинг 63
Исследование концентрации тропонина-Т и аутоантител к ЛЦ 64 миозина миокарда в венозной крови пациентов с помощью твердофазного иммуноферментного анализа
Методика искусственного кровообращения 65
Методика выполнения кардиоплегии 66
3.11. Методика статистической обработки материала 69
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 70
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ПОВЕДЕНИЯ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ 70
МИОЗИНА ПРИ АДАПТАЦИИ И ПАТОЛОГИИ
4.1. Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина 70
миокарда в разных отделах сердца (предсердие, желудочек)
при разных состояниях сусликов Spermophillus undulatus (зимняя спячка, пробуждение, активность)
Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина 75 миокарда человека в желудочках сердца при развитии ДКМП
Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ1 миозина 78 миокарда левых отделов сердца человека при клапанной патологии
Изучение закономерности появления аутоантител к ЛЦ 85 миозина миокарда в крови пациентов, оперированных по
поводу клапанной патологии сердца
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ВЫВОДЫ 97
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 98
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ 99
Список использованной литературы 100
Список использованных сокращений
а-ТЦ - предсердная изоформа тяжелых цепей миозина
Р-ТЦ - желудочковая изоформа тяжелых цепей миозина
АТФ - аденозинтрифосфат
ГКМП - гипертрофическая кардиомиопатия
ДКМП - дилатационная кардиомиопатия
ДСН - додецилсульфат натрия
ДЭАЭ целлюлоза — диэтиламиноэтил-целлюлоза
ИБС - ишемическая болезнь сердца
ИМ - инфаркт миокарда
ЛЖ - левый желудочек
ЛП - левое предсердие
ЛЦ миозина - легкие цепи миозина
ЛЦ1 - легкие цепи 1 миозина
ЛЦ1ж - легкие цепи 1 желудочкового типа
ЛЦ1п - легкие цепи 1 предсердного типа
ЛЦ2 - легкие цепи 2 миозина
ЛЦ2ж - легкие цепи 2 желудочкового типа
ЛЦ2п - легкие цепи 2 предсердного типа
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ТЦ - тяжелые цепи миозина
ЭКГ - электрокардиография
ЭхоКГ — эхокардиография
Введение к работе
Русский физиолог Григорий Скориченко так писал о важности изучения зимней спячки: «Жизнь и ее эпилог смерть — главный предмет биологии. Но между ними есть третье понятие, патологическое в одних случаях, нормальное - в других: угнетение жизни. Изучение незадерживаемой, ликующей жизни представляет в высшей степени увлекательную задачу, но и исследование угнетенной, затаившейся жизни также способно пролить много света в темные области физиологии и патологии...» (докторская диссертация «Угнетение жизни: старое и новое о зимней спячке», Санкт-Петербург, 1891г.).
Актуальность исследования. Зимняя спячка (гибернация) - это эволюционно закрепленная способность некоторых теплокровных животных адаптироваться к неблагоприятным условиям за счет снижения активности всех физиологических систем организма (Хочачка и Сомеро, 1988). При гибернации двигательная способность скелетных мышц ингибирована полностью и существенно снижена сократительная активность сердца. Одной из фундаментальных проблем зимней спячки является выяснение роли разных мышечных белков в ее адаптационном механизме. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что изменения изоформного состава легких цепей (ЛЦ) миозина скелетных мышц у зимоспящих сусликов вносят вклад в подавление и восстановление его функциональной активности соответственно при входе животного в спячку и при выходе из нее (Лукоянова и др. 1996). Изучение изменений в изоформном составе ЛЦ миозина миокарда зимоспящих сусликов в разные периоды гибернации предстояло выяснить. Животное выходит из спячки без необратимых нарушений в сократительной способности миокарда. По-
видимому, при входе в спячку существует порог максимально допустимых изменений в сократительной системе миокарда и, в частности, в белке миозине, при котором гарантирована их обратимость при пробуждении животного. Изучение изменений в составе миозина миокарда, вносящих вклад в механизмы гибернации и выхода из нее, является актуальной задачей. Выяснение этих изменений позволит решить ряд фундаментальных и прикладных задач медицины, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями человека. Знание изоформных замен в миокарде, которые организм суслика использует при входе и выходе из спячки, поможет понять значение аналогичных замен в миокарде человека при некоторых сердечных заболеваниях.
Среди сердечных заболеваний кардиомиопатии (КМП) являются тяжелыми формами нарушения сердечной деятельности, приводящими к инвалидности и летальному исходу. Среди КМП удельный вес дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) составляет 60%. Одной из причин высокой смертности при ДКМП является трудность ранней диагностики, оценки ближайшего прогноза развития заболевания и выбора своевременного, эффективного лечения. Основным недостатком подходов, диагностирующих стадию ДКМП, является использование клинических и гемодинамических показателей без учета молекулярных изменений в самой мышце сердца и, в первую очередь, в свойствах ее основного сократительного белка миозина. Выяснение и учет этих изменений - новый подход к решению проблемы. Большую помощь в этих исследованиях может оказать использование зимней спячки млекопитающих, как природной модели обратимого ингибирования и активирования деятельности сердечной мышцы. В этой работе изучение изменений в сократительном белке миозине миокарда и их роли при развитии ДКМП и клапанной патологии человека проведено в сравнении с подобными изменениями в миокарде зимоспящих сусликов в разные периоды гибернации.
Молекула миозина, состоит из двух тяжелых цепей (ТЦ) и двух пар легких цепей (ЛЦ1 и ЛЦ2). Эти цепи играют важную роль в структурных, АТФ-азных и регуляторных свойствах миозина. Особенностью ЛЦ миозина миокарда, важной для диагностики сердечных болезней, является то, что эти цепи имеют свои изоформы в разных отделах сердца: в предсердиях (ЛЦ1п и ЛЦ2п) и желудочках (ЛЦ1ж и ЛЦ2ж). О прогностическом значении ЛЦ миозина свидетельствуют данные о том, что на ранних стадиях развития гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) в желудочке миокарда появляется изоформа ЛЦ1 предсердного типа, не характерная для этого отдела сердца в норме, и она исчезает на конечной стадии болезни (Могапо, 1999). Показано, что появление ЛЦ1 предсердного типа в миозине желудочка на начальной стадии ГКМП приводит к повышению сократительной способности миокарда (Могапо, 1999). Подобные исследования в случае ДКМП предстояло провести.
Потеря ЛЦ миозина ингибирует ферментативную и регуляторную способность миозина (Халина и др., 2003; Халина и Подлубная, 2002; Khalina et. al., 2005), а появление ЛЦ в миокардиальной ткани в свободном, не связанном с ТЦ миозина виде может приводить к их миграции в кровоток. Зарегистрировано появление ЛЦ миозина в крови пациентов с инфарктом миокарда и при сердечной недостаточности (Nicol et.al., 1993; Yamamuro et.al., 1995; Kemp et.al., 2004; Sawicki et.al., 2005). Следовательно, ЛЦ миозина можно отнести не только к важным факторам адаптации, но и к важным белкам-маркерам развития ряда сердечных патологий. В данной работе этот потенциал ЛЦ миозина миокарда исследуется в адаптационных процессах при зимней спячке сусликов Spermophillus undulatus и в адаптационно-патологических процессах при развитии ДКМП, а также при клапанной патологии сердца человека для выяснения роли ЛЦ в этих процессах и создания основы для их диагностики.
