Содержание к диссертации
Введение
1. Химическая модификация ш^-полимеразы е. coli и ее использование в изучении процесса транскрипции. 5
1.1. РНК-полимераза. - ключевой фермент процесса транскрипции 6
1.1.1. Связывание с матрицей 7
1.1.2. Инициация синтеза РНК 11
1.1.3. Элонгация цепи РНК 13
1.1.4. Терминация транскрипции 16
1.2. Роль SH -групп РНК-полимеразы в процессе транскрипции 20
1.3. Химическая модификация ряда функционально важных аминокислотных остатков РНК-полимера.зы 31
1.3.1. Модификация остатков лизина как подход к изучению каталитического центра фермента 31
1.3.2. Роль остатков аргинина и гистидина в РНК-полимеразе 37
2. Результаты и их обсуждение 41
3. Экспериментальная часть 74
3.1 Материалы 75
3.2 Выделение и характеристика субъединиц РНК-полимеразы 76
3.3. Определение аминокислотной последовательности пептидов 78
3.4. Химическая модификация РНК-полимеразы 82
Выводы 88
- Роль SH -групп РНК-полимеразы в процессе транскрипции
- Химическая модификация ряда функционально важных аминокислотных остатков РНК-полимера.зы
- Выделение и характеристика субъединиц РНК-полимеразы
- Химическая модификация РНК-полимеразы
Роль SH -групп РНК-полимеразы в процессе транскрипции
По сравнению с основными элементами ( Ж, С, Н, 0 ), содержание серы в белках относительно не велико ( 0,5 - 2,5 % ). Тем не менее сера в ее различных химических формах, вносит значительный вклад как в реакционную способность белковых молекул, так и в стабилизацию их вторичной структуры, а, следовательно, и в осуществление их биологических функций. SHr-Группам приписывают более важную роль, чем .другим функциональным группам белка, из-за их высокой реакционной способности и исключительного многообразия химических реакций, в которые они вступают: алкилирований, ацилирования, окисления, образования меркалтидов, полумеркалталеи, образование комплексов с переносом заряда, и т.д. Среди известных к настоящему времени тиоловых ферментов, то есть ферментов, активность которых снижается или исчезает при модификации SH -групп, имеются представители всех классов ферментов. К их . .числу относятся почти все известные дегидрогёназы, ферменты .дыхательной цепи, ферменты обмена, аминокислот, углеводов, жиров, а также биосинтеза, белков / 79-84 /. Роль SH-групп в поддержании конформации ферментов, их участия в осуществлении каталитических функций изучается и на. белках, обладающих сложным субъединичным составом и. большим молекулярным весом. К их числу относится ДНК-зависимая РНК-полимера.за Е. coli. Холофермент РНК-полимеразы содержит 33 остатка цистеина: J, -A, f> - 7, р1- 15, и (і фактор - 3 / I - 4 /, цричем ни одной S связи в ферменте не найдено / 85 /. На важность остатков цистеина. в молекуле РНК-полимеразы указывают данные о крайней чувствительности фермента к сульфгидриль-ным реагентам / 86 /. Добавление тиол-специфичных реагентов ингибирует активность РНК-полимеразы / 87 /. Однако, из-за большого количества, цистеинов в молекуле, трудно определить специфическую функциональную роль отдельных остатков. Б настоящее время предполагается, что сульфгидрильная"модификация может влиять на такие процессы, как взалмодеиствие субъединиц в ферменте, узнавание матрицы, способность связывать матричную ДНК / 88 /. Не исключается также возможность вовлечения SH-групп в осуществление каталитических функций, а также участия их в поддержании различных конформаций фермента., необходимых для осуществления синтеза. РНК /89 /. Инактивация фермента сульфгидрильными агентами зависит от ионной силы буфера, а также от наличия в среде АТР. В буфере, содержащем I М KCI, РНК-полимераза существует в виде протомера и при этом число реакционноспособных SH -групп заметно увеличивается.
Однако, вполне возможно, что соль вызывает не только диссоциацию димера фермента, но и какие-то глубокие конформа-ционные изменения в самом ферменте, обнажая дополнительные SH -группы для действия модифицирующих агентов. Заметной протектирующей способностью обладает матрица.. Так, например, если действие цистамина на. нативную РНК-полимеразу вызывает практически полную инактивацию фермента, то обработка комплекса. РНК-полимераза - ДНК не приводит к изменению ферментативной активности, а. количество модифицированныхрстатков цистеина значительно падает. Наиболее изучено действие п-хлормеркурибен-зоата на РНК-полимеразу, однако, к сожалению, данные, полученные в различных лабораториях, крайне противоречивы. Было показано, что модификация 3-4 SH -групп в ферменте не влечет за собой изменение полимеразной активности / 85, 90 , 91 /. Инактивация наблюдается при титровании 8 / 91 /, либо 12 / 92 / остатков цистеина.. By и .др. / 92 / на. РВК-полимеразе из Escherichia coli а Краков на. РНК-полимеразе из Az. vineiandii показали, что модификация фермента п-хлормеркурибензоатом не влияет на. связывание его с синтетической матрицей. Однако, полученный в этих условиях комплекс стабилен лишь при низкой ионной силе, увеличение концентрации соли до 0,25 М ведет к полной диссоциации комплекса d(A) -модифицированная РНК-полимераза в отличие от комплекса, с натив-ным ферментом. Таким образом, на основании полученных результантов, авторы предаолагают, что сульфгидрильные группы остатков цистеина непосредственно в связывании с матрицей не участвуют, но важны для конформационных изменений, приводящих к образованию прочного " открытого " комплекса. Кроме того, Смит / 93 / также отметил, что обработка, РВК-полимеразы п-хлормеркурибензоатом не влияет на связывание фермента с синтетическими полидезоксинуклеотидами и при модификации не меняется профиль центрифугирования фермента.. Однако, Ишихама и Гурвитц / 87 / обнаружили, что обработка, РНК-полимеразы п- хлормеркурибензоатом является причиной потери ферментом способности связывать нативную ДНК фага Т7. Позднее / 94 / Ишихама. показал, что такая обработка фермента влечет за собой образование субпротомерных комплексов oL, В и р1 Кроме п-хлормеркурибензоата, .для модификации SH -групп РНК-полимеразы были использованы .другие ртутьсодержащие соединения, такие как 2-хлормеркури-4-нитрофенол и Hg+ / 95 /. Они, подобно п-хлормеркурибензоату, обратимо реагируют с тиолами фермента, в стехиометрическом соотношении и максимальный уровень инги-бирования наблюдается через 10 минут после добавления модифицирующего агента.
Ионы меди также ингибируют РНК-лолимеразу, взаимодействуя с остатками, цистеина, однако, инактивация протекает значительно медленнее и активность после добавления 2-мер-калтоэтанола восстанавливается лишь частично / 85 /. Для модификации РНК-полимеразы использовали также 5,5 -дитио-бис( 2-нитробензойную кислоту ) / 85 /. Активность РНК-полимеразы изменяется незначительно при модификации первых 10 SH -групп, зависит от модификации медленно реагирующих тиоловых групп и полностью падает в том случае, если все SH -группы модифицированы. Химическая модификация тиолов 5,5 -дитио-бис (2-нитробензойной кислотой ) может быть легко обратима путем добавления избытка, 2-меркалтоэтанола, причем степень обратимости зависит от числа модифицированных тиолов. В противоположность действию п-хлормеркурибензоата, при модификации 5,5 -дитио-бис ( 2-нитробензойной кислотой ) около 50$ активности сохраняется у фермента, находящегося в форме преиниционного комплекса, однако, Дамъянович и .др. считают, что в нативных условиях ДНК не защищает SH -группы РНК-полимеразы / 96 /. Б работе By / 92 / по модификации РНК-полимеразы тетра,-тионатом натрия, блокировка первых 8 остатков не ведет к потере активности, при модификации же 21 остатка, сохраняется менее 1% активности. Аналитическое центрифугирование показало отсутствие разогрегации фермента в результате мо.дификации. Однако, флуоресцентный анализ с помощью -толуоинидил-нафтален-6-сульфонатом выявил, что модифицированный фермент претерпел конформационные изменения. Обработка холофермента в течение небольшого времени дает форму с 12 модифицированными остатками. Показано, что модифицированный фермент почти не активен ( Ь% начальной активности ) при использовании в качестве матрицы двухцепочечной ДНК, однако, он обладает 50 - 70 % начальной активности на d( А-Т )-сополимере и 70 - 100$ активности на одноцепочечной матрице. Для инициации синтеза РІК, осуществляемого РНК-полимера.зой на нативной двухцепочечной матрице, необходимо, чтобы фермент был способен связываться с цромоторными участками / 97 /, где происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК. Для инициации синтеза РНК на, одноцепочечной матрице нет необходимости в таком " плавлении ". Неспособность модифицированного холофермента использовать нативную двухцепочечную ДНК-ма,трицу ( например, ДНК фага Т7 ) происходит, очевидно, благодаря ингибированию стадии инициации синтеза, РНК, что может быть объяснено либо неспособностью связываться с цромоторными участками матрицы, либо невозможностью инициировать синтез РНК, даже при правильном выборе района, взаимодействия. tf-Субъединица, выделенная из модифицированной РНК-полимеразы, полностью активна, в то же время добавление немодифициро-ванной в-субъединицы к полученному кор-ферменту не восстанавливает его ферментативную активность. Таким образом, основной структурный дефект, возникающий при модификации, затрагивает субъединицы кор-фермента.
Химическая модификация ряда функционально важных аминокислотных остатков РНК-полимера.зы
Известно, что РНК-полимераза осуществляет поликонденсацию нуклеозид-б -трифосфатов, в результате которой образуется РНК и неоргалический пирофосфат / 35 /. Отсюда, можно заключить, что на ферменте имеются соответствующие центры связывания нуклеозид-5 -трифосфатов. Очевидно, что структура центров, связывающих нук-леозид-5 -трифосфаты, должна обеспечивать прямое или косвенное участие матрицы в отборе определенного субстрата, комплементарного данному звену матрицы. Как осуществляется это участие, пока, не известно. Одним из основных подходов для изучения связывания РНК-полимеразы с нуклеозид-5 -трифосфатами является использование реагентов - производных субстратов ( инициирующих и элонгирующих ). Чаще .других используются альдегид-содержащие аналоги нуклеозид-5 -трифосфатов, реагирующие с остатками лизина, которых в кор-ферменте 205, а. в холоферменте -252 / I - 4 / с образованием основалий Шиффа. Поскольку эта реакция обратима, то дая получения стабильной связи мелщу реагентом и белком, основания Шиффа. обычно восстанавливают боргидридом натрия. Известно,большое количество специфических химических реагентов, ингибирующих избирательно одну или несколько стадий реакции, катализируемой РНК-полимеразой. Так, например, химическая модификация одной - трех аминогрупп фермента такими реагентами, как 5-формил-1 ( с - D-рибофуранозил )урацил-5 -трифосфатов / 108 /, 6-метилтиоинозиндикарбоксальдегид ( продукт окисления J& -D-рибо-зил-6-метилтиопурина )/51/ приводит к тому, что в ферменте модифицируе тся р -субъ единица,. Судя по тому защитному действию, которое оказывает нуклеозид--5 -трифосфаты на инактивацию фермента, к аффинным реагентам -аналогам субстратов - можно отнести пиридоксаль-фосфат. Это соединение ковалентно связывается с РНК-полимеразой и инактивирует её при. концентрации 10 "% / 109 /. Дефосфорилировании лишает пиридоксальфосфат инактивирующего действия. Было найдено, что реагент связывается ковалентно именно с остатками лизина. Модифицированный фермент нормально связывается с ДНК, но не способен к транскрипции. В 1980 году Слепнева / НО / исследовала аффинную модификацию РНК-полимеразы с помощью окисленного периодатом итр . Она показала, что реагент инактивирует фермент, причем уридин-5 -три-фосфат оказывает защитное действие. В присутствии poly(dA) реа,-гент ингибировал как синтез, так и. пирофосфатный обмен, а в присутствии poly(dT) - только транскрипцию. По мнению Слепневой это говорит в пользу выдвинутой ранее / III / ею гипотезы о наличии, двух центров элонгации: центра первичного связывания субстратов и отдельного каталитического центра, осуществляющего присоединение субстрата, отобранного связывающим центром, к растущей РБК.
Слепнева. обнаружила аффинную метку в основном в области субъединиц f и, f , а также С . Однако, необходимо отметить, что результаты исследований по аффинной модификации. РНК-полимеразы иногда довольно трудно сопоставлять .друг с другом и. тем более делать из них вывода о функциональной топографии фермента при его функционировании, так как лишь немногие из них выполнены в полных системах, содержащих цромоторные матрицы. Между тем известно, что при образовании комплекса РНК-полимеразы с промоторными участками ДНК фермент претерпевает глубокие конформационные перестройки. Более того, некоторые авторы предполагают, что характер этих перестроек зависит от структуры промоторов / 112, ИЗ /. Конформационные перестройки затем продолжаются на стадии, которую можно назвать " синтезом затравки ", т.е. в период между синтезом первой фосфодиэфирной связи, и диссоциацией tf -субъединицы. Поэтому уже из общих соображений очевидно, что все исследования по аффинной модификации, выполненные в отсутствие матрицы, либо в присутствии различных " неприро.дных ", непромоторных матриц, имеют лишь ограниченную ценность. Игнорирование этого обстоятельства, часто приводит к противоречивым выводам уже на уровне исследования функциональной роли субъединиц фермента. Однако, на основании анализа приведенных выше литературных данных можно сделать вывод, что аффинными реагентами, аналогами субстратов, в ферменте модифицировались и/или -субъединицы. Крайне редко происходила модификация (Г -субъединицы. Кроме аффинных реагентов, .для изучения роли остатков лизина в функционировании РНК-полимеразы, были использованы также различные модифицирующие Ш -группы в белках химические агенты. Так, флуорескамин ( 4-фенилспиро[фуран-л( 3 ) І -фталанІ-З.З -дион, являясь специфическим реагентом на -аминогруппу остатков ли- - 3 зина / 102 /, быстро реагировал с РНК-полямеразой Е. eoli, и включался в субъединицы в соотношении. \рв : (Г : = 1:4,8: : 1,33, а для кор-фермента « \ff = 1:4,8. Относительное увеличение флуоресценции наблюдалось прежде всего для р/ -оубъединиц как для холо- так и для кор-фермента. Инактивация фермента происходила на, уровне инициации. Преинкубация фермента с матрицей и субстратами привела к уменьшению флуоресценции для f - и. р -субъ-единиц / 102 /. Другой реагент, р -нафтохинон-4-сульфоновая кислота, модифицируя ИЖ-полимеразу, ингибировал 3 РР± обмен и Г С]АТР связывание, но на 45$ фермент сохранял способность связывать ДЖ. Авторы полагают / 87 /, что модификация наиболее реакционноспоообных групп остатков лизина, возможно, затрагивает центр связывания нуклеозидтрифосфатов.
Дальнейшее изучение роли аминогрупп в РНК-полимеразе проводили с использованием монохлортрифторбензохинона / 114 /. -эр Было показано, что ингибировался как РР± обмен, так и. связывание [ С]АТР. Это свидетельствовало о модификации центра связывания нуклеозидтрифосфатов в ферменте. В противоположность этим реагентам, модификация РНК-поли-меразы бенгальским розовым приводила к тому, что фермент взаимодействовал с ДБК, связывал нуклеозидтрифосфаты, катализировал решщию обмена, пирофосфата, однако, не происходила элонгация РНК / 87 /. Это наводит авторов на мысль, что бенгальский розовый может либо ингибировать образование фосфодиэфирной связи, либо транслокацию фермента вдоль матрицы. При высоких концентрациях ( 10 М ), бенгальский розовый также ингибировал инициацию цепи и способствовал преждевременному высвобождению цепи РНК из комплекса фермент - ДЖ. Кроме перечисленных выше реагентов, для изучения связывания РНК-полимеразы с ДЖ, использовался имидоэфир, метилацетамид, ковалентно связывающийся с і -аминогруппой остатков лизина /115/. Модификация влияла на связывание кор-фермента РНК-полимеразы с ДНК / 116 /. Цреинкубация фермента с ДЕК тимуса теленка, частично защищала его от инактивации имидо эфиром, предотвращая модификацию 12 остатков лизина, имеющих активность в 5-Ю раз больше по сравнению с другими остатками лизина в ферменте. В последнее время ряд ученых приступил к изучению роли остатков лизина в ( -субъединице РНК-полимеразы Е. coli , используя тринитробензолсульфоновую кислоту / 117 /. Полная потеря активности в -субъединицы наблюдалась при модификации 5 остатков лизина, причем, кинетический анализ показал, что один остаток лизина является критическим .для функционирования ff -субъединицы. Модифицированная С -субъединица взаимодействует с кор-ферментом РНК-полимеразы с образованием холофермента. Возможно, при модификации в С -субъединице нарушается взаимодействие остатков лизина с аспарагиновой или глутаминовой кислотами, что влечет за собой конформационные изменения в tf -субъединице, приводящие к ин-гибированию синтеза РНК. Таким образом, в настоящее время существует два подхода для изучения роли, остатков лизина, в функционировании, РНК-полимеразы. С одной стороны, это использование аффинных аналогов субстратов, содержащих альдегидную группу и образующих основания Шиффа, для изучения роли различных субъединиц в процессе транскрипции; с другой - применение различных модифицирующих агентов с целью использования их для локализации существенных остатков лизина в ферменте.
Выделение и характеристика субъединиц РНК-полимеразы
РНК-полимеразу выделяли из штамма Е. соїі по методу Берд-жеса / 143 /, который наиболее приспособлен .для наработки больших количеств белка. Для получения фермента, насыщенного по б -субъединице, на последней стадии использовали хроматографию на одноцепочечной ДНК-агарозе / 144 /, что позволяло разделять кор- и холофермента. Удельная активность фермента / 143 / составляла 500-1000 ед. активности на ДНК из тимуса, теленка. 3.2.2 Разделение субъединиц холофещента Субъединицы холофермента. разделялись в одну стадию с помощью препаративного электрофореза, в ацетатцеллкшозных блоках. В ка,-честве исходного материала для получения блоков использовали диа.-цетатцеллюлозу с содержалием уксусной кислоты 54,9%, выпускаемую ВНИИС ( г. Владимир ). 21 г ацетатцеллюлозы ра.створяли в 600 мл ледяной уксусной кислоты. Вязкий раствор выливали в кювету ( 45х 36x0,3 см ), представляющую собой лист стекла с бортиками, из стеклянных палочек, приклеенных силиконовым кислотостойким клеем и помещали в атмосферу насыщенного водяного пара в строго горизонтальном положении. Для этого кювету располагали на поверхности, вода в герметически закрытой ванночке. Водяные пары, диффундируя в раствор полимера, вызывали его коагуляцию. Затем кювету со сформировавшимся блоком, погружали в воду, отделяли гель от стекла и тщательно отмывали его от следов уксусной кислоты. Готовый блок уравновешивали буферным раствором В ( 0,6 М борная кислота -аммак, рН 8,9 , 8 М мочевина, 0,02 М 2-меркал то этанол, 0,01м EDTA. 10 мг лиофильно высушенного препарата холофермента РНК-поли-меразы растворяли в 300 мкл буферного раствора В, содержащего 0,2 М 2-меркаптоэтанола и. инкубировали в течение 10 час при температуре 25С. Раствор наносили на приготовленную пластинку.
Горизонтальный электрофорез проводили в камере для горизонтального электрофореза в течение 6-8 час при напряжения 500 В. Электродный раствор: 0,6 М борная кислота - аммиак, рН 8,9; О.ОЙГЕОТА. Участки ацетатцеллюлозы, соответствующие - (Rf =0,1 ); f - С Rf =0,2 ); - ( Rf =0,5 ) и - ( Rf =0,7 ) субъединицам, локализовали, с помощью окрашивания амидовым черным, вырезали, и переносили в центрифужные пробирки, снабженные специальными, вкладышами,. Раствор отделяли центрифугированием ( 30 мин при 8000 об/мин ) и обессоливали на колонке ( 1x20 см ) с сефадексом 6-50, уравновешенным аммоний-бикарбонатным буфером ( рН 8,2 ). Выход субъединиц 40 - 50$. 3. 2.3 Реконструкция субъединиц холофермента РНК-полимеразы Реконструкцию субъединиц холофермента РНК-полимеразы проводили по методу / 145 /. Субъединицы, полученные после элект- рофореза в ацетатцеллюлозных блоках, смешивались в стехиометричес-ких соотношениях и проводился диализ против буфера, содержащего 0,01 М трис-ЛСІ, рН 7,9, 0,01 М Mg С12, 0,5 М KCI, 0,1 мМ EDTA , I мМ ДТТ, 50% глицерин в течение 4 час при 4С. Об активности фермента судили по синтезу олигонуклеотидов. 3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АШНОКИОЮТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕГіЬНОСТИ ІШІТИДОВ 3.3.1 Гидролиз субъединиц РНК-полимеразы ферментами Гидролиз субъединиц РНК-полимеразы трипсином, химотрипсином и протеиназой из St. aureus проводили в 0,1 - 0,2 М бикарбонате аммония при. 37С и. соотношении фермент - субстрат 1:30 - 1:50. Время гидролиза трипсином и химо трипсином составляло 4-6 час, а протеиназой из St. aureus 16 - 20 ча,с. По окончании гидролиза гидролизат замораживали и. лиофилизовали. 3.3.2 Использование метода, пептидных карт .для выделения пептидов Для выделения пептидов,полученных при ферментативном гидролизе субъединиц, использовали метод пептидных карт на бумаге Ватман ЗММ или в тонком слое целлюлозы ( 20x20 см ). На лист бумаги. Ватман ЗММ или на пластинку с тонким слоем целлюлозы ( 20x20 см) наносили 5 - 10 нмоль гидролизата в виде узкой полоски ( 1,5x10 мм ) перпендикулярно направлению электрофореза. Электрофорез проводили в течение I час при рН 6,5 и напряжении 500 В в системе пиридин: уксусная кислота : вода ( 25 : I : 225 ). Хроматографию проводили в системе пиридин : н-бутанол : уксусная кислота : вода. ( 10 : 15 : 3:12 ). Для детекции радиоактивных пятен использовали радиоавтографию. Время экспозиции 3-5 дней. Пленку ( PM-I или PT-I ) обрабатывали стандартными проявителями. Радиоактивные пятна вырезали и элюировали 10$ уксусной кислотой. 3.3.3 Определение аминокислотного состава пептидов I - 10 нмоль растворяли в 100 мкл 5,7 Н соляной кислоты, раствор замораживали и тщательно дегазировали при помощи вакуумного настюа. Гидролиз проводили в запаянных ампулах под вакуумом в течение 24 час. По окончании гидролиза образцы упаривали досуха.. Для полного удаления кислоты упаривание повторяли несколько раз, добавляли по 150 мкл перегнанной над нингидрином воды. Количество остатков лейцина, валина, изолейцина определяли при максимальним времени гидролиза ( 72 час ), а. количество треонина и се-рина - экстраполяцией к нулевому времени. Содержание остатков триптофана определяли при помощи цветной реакции с фруктозой /146 / и спектрофотометрически / 147 /. Аминокислотный анализ выполняли на анализаторе D -500 ( Durrum, США ). 3.3.4 Определение Ы-концевых аминокислотных остатков Н-концевые аминокислотные остатки, пептидов определяли в виде 1-диметилнафталин-5-сульфонильных ( DUS ) производных по методу Грея / 148 /. Раствор 0,5-3 нмоль пептида помещали в ампулу, упаривали в вакууме при. 40С, добавляли 15 мкл 0,1 Н раствора бикарбоната натрия и равный объем шз -хлорида в ацетоне ( 6 мг/мл ). Реакционную смесь выдерживали I час при 37С, содержимое ампулы высушивали в вакууме и к остатку добавляли 30 мкл 5,7 Н соляной кислоты.
Ампулу вакуумировали, запаивали и выдерживали. 20 час при П0С. Если Ы-концевыми Аминокислотами пептидов были пролин, серии или гистидин, время гидролиза сокращали до 4-х часов. В слу- чае же валиш и изолейцина, его, наоборот, увеличивали до 40 -70 час. Гидролизат упаривали при 60с, к сухому остатку добавляли 30 мкл воды и упаривали еще раз. Остаток растворяли в ацетоне ( в случае шэ -гистидина и DUS -аргинина - в 2 Н аммиаке ) и использовали, для хроматографического анализа. При работе с микроколичествами пептидов дансилирование проводили по методу / 149 Д К пептиду (0,1 - 0,5 нмоль ) добавляли дважды по 2 мкл 0, бикарбоната натрия, упаривали в вакууме и приливали I мкл раствора, дансилхлорида ( 6 мг/мл ) в 50% водном ацетоне. Раствор выдерживали I час при 37С, затем упаривали досуха и добавляли 5 мкл 5,7 Н соляной кислоты. Дальнейшую обработку проводили как описа,-но выше. DHS -Производные аминокислот идентифицировали двумерной тонкослойной хроматографией на силикагеле / 150 /. Хроматографию проводили на плстинках ( 6x6см ) с закрепленным слоем силикагеля марки КСК в следующих системах: I) первое направление-ацетон : изопропиловый спирт : 25% аммиак (9:7:0,5и9:7: 0,7 ); второе направление - хлороформ : бензиловий спирт : этил-ацетат : уксусная кислота ( 6 : 4 : 5 : 0,2 ); 2) первое направление - ацетон : изопропиловый спирт : 25% аммиак ( 9:7:2и9:7:3); второе направление - хлороформ : бен-зиловый спирт : метиловый спирт : уксусная кислота (5:4:1: I ) . Для более четкого разделения вт -производных валина, лейцина, и изолейцина, алалина и тирозина, а. также метионина, лизина, и фенилаланина использовали двумерную хроматографию в тонком слое полиамида на пла.стинках 3x3см в системах: первое направление - 1,5% HG00H; второе направление - бензол : уксусная кислота. ( 9 : I ) и этилацетат-уксусная кислота.-мета.нол ( 20 : I : 3.3.5 Деградация ПЄПТРІДОВ с идентификацией аминокислот В ВИДЄ DABTG -ПРОИЗВОДНЫХ Реакцию проводили по методу / 152 / в ампулах ( 5 х 70 мм ), присоединяемых с помощью коллектора к системе .для откачивания воздуха и заполнения аргоном. I - 10 нмоль пептида, растворяли в 80 мкл 50% водного пиридина, добавляли 40 мкл раствора 4-Ы,М -диметиламиноазобензол-4 -изотиоцианата, ( DABITC ) ( 112 мкг/ 40 мкл пиридина ) при охлаждении, систему вакуумировали и залол-няли аргоном ( операцию проводили дважды ), после термостатиро-вания ( 52С, 50 мин ) к реакционной смеси добавляли 10 мкл фенил-изотиоцианата, систему охлаждали, заполняли аргоном и термостатировали при 52С в течение 30 мин. Побочные продукты реакции и избыток фенилизотиоцианата экстрагировали раствором гептан -этилацетат (2:1) дважды по 500 мкл. После экстракции остаток высушивали в течение 30 мин. К высушенному остатку добавляли 50 мкл безводной трифторуксуснои кислоты, коллектор охлаждали, заполняли азотом и термостатировали в течение 15 глин при 52С.
Химическая модификация РНК-полимеразы
Реакцию проводили по методу /153 /в ампулах ( 5x70 мм ), присоединяемых с помощью коллектора к системе для откачки воздуха и заполнения аргоном. 20 - 50 нмоль пептида растворяли в 50 мкл 50$ водного пиридина, добавляли 10 мкл Ъ% раствора, фенилизотиоцианата в пиридине, при охлаждении систему вакуумировали и заполняли аргоном ( операцию повторяли дважды ). После термостатирования ( 45С, 60 мин ) реакционную смесь промывали бензолом ( 2x100 мкл ) и высушивали ( 60С, 30 мин ). К остатку добавляли 50 мкл воды и 100 мкл ледяной уксусной кислоты, насыщенной газообразным HCI. Коллектор охлаждали, заполняли аргоном и термостатировали ( 45С, 60 мин ). Кислоту отгоняли в вакууме, а к остатку добавляли 50 мкл воды и экстрагировали Pth -аминокислоту этилацетатом ( 2x30 мкл ). Этилацетат отгоняли в вакууме и идентифицировали радиоактивные pth -аминокислоты путем детекции на. сцинтилляционном счетчике. 3. 4.1 Модификация РНК-полимеразы иодуксусной кислотой и иодацетамидом Реакцию модификации РНК-полимеразы иодуксусной кислотой и. иодацетамидом проводили в буфере, содержащем 40 мМ трис-HCI ( рН 7,9 ), 0,1 M JSEaCI, 10 мМ %СІ2, І мМ КН2Р04, I мМ EDTA , 0,ІмМ дитиотреитола, в течение І часа при 20С, в темноте. Конечные концентрации в реакционной смеси: ШК-полимеразы - 4x10 М, иодуксусной кислоты и иодацетамида -ЮМ. Об активности модифицированной РНК-полимеразы судили по её способности синтезировать олигонуклеотиды. При использовании моноиод-[ С]уксусной кислоты .для модификации РЕК-полимеразы, к 5 нмоль кор- или холофермента. добавляли I мкмоль моноиод- [СП уксусной кислоты ( радиоактивная кислота, разбавлялась нерадиоактивной до удельной радиоактивности 3000 имп/ ( мин-нмоль ). Карбоксиметилировалие проводили в течение 2 час при 20С и в темноте. Реакцию останавливали добавлением большого избытка 2-меркал то этанола к фермент высаживали 3-х кратным избытком ацетона. Субъединицы разделяли с помощью электрофореза на ацетатцеллюлозе. 3.4.2 Модификация РНК-полимеразы ионами ртути Реакцию модификации РНК-полимеразы п-хлормеркурибензоатом и % s04 проводили в буфере, содержащем 40 мМ трис-HCI ( рН 7,9 ), 0,1 М Ыа,С1, 10 мМ М gCI2, І мМ КН2Р04, I мМ EDTA , 0,1 мМ дитиотреитола. в течение 10 мин при 20С. Конечные концентрации в реакционной смеси: РНК-полимеразы - 4x10 М, 1 s04 - 2x10 М, п-хлормеркурибензоата - ЗхЮ М. Об активности фермента судили по способности РНК-полимеразы синтезировать олигонуклеотиды.
Используя и Н gsO в качестве модифицирующего агента., к 2 нмоль восстановленного фермента добавляли 40 нмоль % gS04 ( радиоактивный сульфат ртути разбавляли нерадиоактивным до удельной активности 100000 имп/ ( мин нмоль ). Модификацию проводили в течение 2 мин, после чего белок высаживали подкисле-нием раствора уксусной кислотой. Анализ продуктов модификации проводили электрофорезом в градиентных ( 4 - 30$ ) полиакриламид-ЕЫХ пла,стинках ( Pharmacia, РАА 4/30 ) в натрий-фосфатном буфере , содержащем 5,5 мМ Ил РО , 2,5 мМ ЫаОН и 1% додецил-сульфат натрия. 3.4.3 Модификация РНК-полимеразы Ы-этилмалеимидом Реакцию модификации РНК-полимеразы Ж-этилмалеимидом проводили в буфере, содержащем 40 мМ трис-НСІ ( рН 6,5 ), 0,1 М IlaCI, 10 мМ M -CIg, I мМ КН2Р04, Г мМ EDTA , 0,1 мМ дитиотреитола в течение 12 час при 4С. Об активности модифицированной РНК-полимеразы судили по её способности синтезировать олигонуклеотиды. При использовании Н-[ С/этилмалеимида .для модификации РНК-полимеразы , к 5 нмоль холофермента добавляли I мкмоль М- [ Cj этилмалеимида ( радиоактивный модифицирующий агент разбавлялся нерадиоактивным до удельной радиоактивности 3000 имп/ ( мин нмоль)) Реакцию модификации проводили в течение 12 час при 4С и останавливали её добавлением избытка 2-меркаптоэтанола. По окончании реакции фермент высаживали 3-х кратным избытком ацетона. Субъеди-ницы РНК-полимеразы разделяли с помощью электрофореза на ацетат-целлюлозе. 3. 4.4 Синтез РНК, осуществляемый РНК-полимеразой Синтез РНК проводили в буферном растворе, содержащем 40 мМ трис-НСІ ( рН 7,9 ), 0,1 М ЖаСІ, 10 мМ М С12, I мМ КН2Р04, I мМ EDTA » I мМ дитиотреитола, 0,05$ бычьего сывороточного альбумина, 200 мкМ АТР . 200 мкМ GTP , 40 мкМ СТР , 40 мкМ UTP ( 200мкКи/мл /СС-32ГТР)» 20 мкг/мл BSU фрагмента ДНК фага Т7 или 4 мкг/мл роіу(аї ) и 100 мкг/мл РНК-полимеразы. Синтез РЖ проводили в течение 20 мин при 37С и останавливали добавлением равного объема буфе ногфаствора, содержащего 0,1 MEDIA , 0,1$ додецилсульфат натрия, 7 М мочевину, 50 мМ трис-борат ( рН 8,3 ). Синтезированные олигонуклеотиды разделяли с помощью электрофореза в пластинах 25% или 3% полиакриламидного геля ( 1,5x200x400 мм ) в буфере, содержащем I М трис, I М борную кислоту , 0,02 М EDIA ( рН 8,3 ) и 8 М мочевину, в течение 4-6 час при напряжении 1000 в. Для радиоавтографии. использовали рентгеновскую пленку PM-I или PTffl. 3.4.5 Окисление холофермента РНК-полимеразы феррициадидом калия I нмоль холофермента. переводили в буфер с высокой ионной силой ( 0,65 М трис-НС1, рН 8,0, 0,4 М ЖаСІ ).
Окисление проводили феррицианидом калия при концентрации модифицирующего агента 3,0 мМ, в течение 2 час , при 20С. После реакции белок высаживали подкислением уксусной кислотой и результат модификации анализировали электрофорезом в градиентных полиалриламидных пластинках ( Pharmacia, РАА 4/30 ) в натрий-фосфатном буфере ( рН 7,0 ) как описано выше. 3.4.6 Получение фрагментов ДНК Для получения промоторсодержащих фрагментов ДНК использовали плазмиду pOD 162. Рестрикцию ДНК ферментом Sail проводили в буфере, содержащем 6 мМ трис-НС1 ( рН 7,5 ), 6 мМ MgCI2, 6 мМ 2-меркал то этанола, 0,15 М КаСІ, а ферментом EcoRl в буфере, содержащем 0,1 М трис-HCI ( рН 7,5 ), 0,005 М MgCIo, 0,05 М ЫаС1, 0,01 M 2- меркалтоэтанола, используя I ед. акт. фермента на I мкг фрагмента. Реакцию расщепления ДНК ферментами рестрикции проводили в течение 3-4 час при 37С. Конечная концентрация ДНК в реакционной смеси 0,3 мг/ мл. 3.4.7 Связываяие РНК-додимеразы с фрагментами ДНК Связывание РНК-полимеразы ( модифицированной и нативной ) с фрагментами ДНК проводили в буфере, содержащем 150 мМ KCI, 40 мМ трис-НСІ ( рН 7,9 ), ІЗ мМ Mg CL , 0,1 мМ дитиотреитола, 100 мкг/ мл сывороточного альбумина, в течение 10 мин при 37С. Комплексы РНК-полимераза - ДНК фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры с последующей элюцией их буфером, содержащем 0,5 М ЫН40Ас, 0,01 М М g(0Ac )2, 0,1$ додецилсульфат натрия, 0,1 мМ EDTA в течение 12 час при 20С.После элюции фрагменты ДНК разделяли в 6% полиакриламидном геле в присутствии мочевины, как описано выше или электрофорезом в агарозе. Окраску геля проводили этидиум-бромидом в течение 15 мин. 3.4.8 Электрофорез в агарозе Агарозу растворяли в буфере, содержащем 40 мМ трис-НСІ, рН 7,8-8,2, 20 мМ АсОН, 2 мМ EHDA на водяной бане. Для аналитических целей брали, 100 мл буфера, Для препаративных - 400 мл буфера ( для прибора горизонтального электрофореза с размером охлаждалэ-щей плиты - 20x20 см ). В зависимости от задачи использовали гели, содержащие от 0,4 до 1,6$ агарозы. После растворения агаро-зы добавляли 20-50 мкл водного раствора ( 10 мг/мл ) бромистого этидия. Смесь заливали в прибор для горизонтального электрофореза. Электрофорез проводили при 150 мА в течение I часа. 3.4.9 Модификация ионами ртути РНК-полимеразы, находящейся в транскрибирующем комплексе Исследуя влияние ионов ртути на. элонгацию цепи РНК, РНК-по-лимеразу ( 4x10 М ), находящуюся в транскрибирующем комплексе ( См. синтез РЖ, время реакции 2 мин ), обрабатывали Hg S04 ( 2х 10 М ) и одновременно 10-кратным избытком рифампицина ( 20 мкг/мл ) в молярном отношении. Синтез РНК проводили в течение 20 мин при 37С аналогично описанному выше и останавливали добавлением равного объема, буферного раствора, содержащего 0,1 М ЕША, 0,1$ додецилсульфат натрия, 7 М мочевину, 50 мМ трис-ббрат ( рН 8,3 ).
